Dual PCR Detection of Type 2 and 3 Cyprinus Herpesvirus
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摘要:目的 鲤疱疹病毒2型和3型对鲤科鱼类危害严重，本研究旨在建立快捷、高效且能同时检测2种鲤疱疹病毒的检测技术。方法 根据鲤疱疹病毒 2 型和3型的DNA聚合酶基因保守序列，设计2对特异性引物，通过对双重PCR反应条件的优化，建立检测鲤疱疹病毒2型和3型的双重PCR方法；使用该方法对试验室保存的鲫和鲤病鱼组织样品进行检测。结果 该方法能够分别对鲤疱疹病毒2型和鲤疱疹病毒3型各扩增出715 bp和456 bp的特异性条带，表现出良好的特异性；敏感性试验结果显示，该方法的检测极限值为100 copies·μL-1，具有较高的灵敏性。使用该方法对本试验室保存的18份临床病料进行PCR检测并对PCR产物进行测序验证，结果显示CyHV-2和CyHV-3阳性的各有3份，其阳性率都为33.3%；分别对2份CyHV-2和CyHV-3阳性样品混合后进行检测，结果混合样品均为CyHV-2和CyHV-3双阳性，与常规检测方法得到的结果相同。结论 本研究建立的双重PCR检测方法特异性强、灵敏度高，可用于CyHV-2和CyHV-3的快速检测和鉴别诊断。Abstract:Objective A PCR method for simultaneously detecting Type 2 and Type 3 Cyprinid herpesvirus that cause serious diseases on Cyprinidae was developed and tested for clinical diagnosis.Methods Two pairs of specific primers were designed according to the conserved sequences of the DNA polymerase gene of the two types of virus, CyHV-2 and CyHV-3. PCR reaction conditions of the method were optimized. The assay was applied on the stored tissue samples of diseased Carassius auratus and Cyprinus carpio to verify validity of the methodology.Result The newly developed Dual PCR Assay amplified specific bands with the base numbers of 715 bp for CyHV-2 and 456 bp for CyHV-3. It exhibited high sensitivity with a detection limit of 100 copies·μL−1. On the 18 clinical samples, 3 were found to be CyHV-2 and 3 CyHV-3 with a positive detection rate of 33.3%. Furthermore, the assay successfully identified the two type viruses in a mixed sample of CyHV-2 and CyHV-3 in a challenge test.Conclusion The Dual PCR Assay demonstrated high specificity and sensitivity in simultaneously detecting CyHV-2 and CyHV-3. It could be adequately applied for rapid diagnosis of the viral diseases on carps.
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Keywords:
- Cyprinus carpio /
- Cyprinus herpesvirus /
- Double PCR
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鱼类的生长、摄食及生理功能均受到养殖密度影响。从鱼类的生理角度分析，高密度养殖条件下，多数鱼类的免疫力会明显下降，且与其生长阶段密切相关[1-3]。为了提高养殖产量、降低养殖成本，生产者常尽可能提高鱼类放养密度[4-5]。然而高养殖密度作为一种环境胁迫因子会导致鱼类对养殖水域空间、食物资源的竞争渐趋激烈，且易引起水质恶化，疾病发生可能性增大，鱼类存活率及群体生长率降低[6-8]。逯尚尉等[6]研究认为过高的养殖密度会对点带石斑鱼幼鱼的生长与代谢造成负面影响；程佳佳等[8]的研究表明高密度环境也会对杂交鲟幼鱼生长性能与肌肉组分产生显著影响。但部分研究表明，过低的养殖密度也会在一定程度上抑制鱼类的生长效率[6, 9]，如当养殖密度低于1.1 kg·m-3时，点带石斑鱼幼鱼生长性能显著降低(P＜0.05)。因此，研究特定鱼类在不同密度养殖条件下的生长性能、肌肉成分及生理反应有助于在生产实际中科学设置放养密度，提高养殖经济效益及生态效益。
2017年，我国黄颡鱼养殖产量约50 t，产值近百亿元，连续多年增幅在20%左右，养殖产业发展迅猛。瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli是黄颡鱼中个体最大、生长最快的一个种，肉质细嫩、味道鲜美、营养丰富、少肌间刺，具有较高的经济价值。目前，国内外学者对瓦氏黄颡鱼的研究主要涉及遗传育种、营养需求、疾病防治等[10-13]。关于养殖密度对瓦氏黄颡鱼影响的评价仅限于生长情况，涉及肌肉成分、生理指标变化的研究较少。本研究探讨不同养殖密度条件下瓦氏黄颡鱼幼鱼生长、肌肉成分、血液生理生化等方面的差异，以期为瓦氏黄颡鱼幼鱼养殖设置适宜密度提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验动物及材料
瓦氏黄颡鱼幼鱼购自福建莆田天下鱼庄养殖场，种质来源相同，均匀健壮，体重(25.23±0.09)g。酸性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶测试试剂盒购自南京建成生物工程研究所。盐酸、乙醚等化学试剂，均为化学分析纯，购自西陇化工股份有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设置
试验在全封闭水循环系统中进行，瓦氏黄颡鱼用聚维酮碘处理后，在养殖系统中暂养2周。试验设置4个密度梯度，初始密度分别为G1：20尾·m-3(0.50 kg·m-3)、G2：40尾·m-3(1.01 kg·m-3)、G3：60尾·m-3(1.51 kg·m-3)、G4：80尾·m-3(2.02 kg·m-3)，每个密度设3个重复。试验期间水温控制26～28℃，pH值7.0～8.0，溶解氧4～6 mg·L-1，氨氮、亚硝酸盐等参考国家渔业用水标准；投喂福建正源饲料有限公司生产的黄颡鱼幼鱼配合饲料(饲料营养参数：粗蛋白质≥38.0%，赖氨酸≥1.9%，粗脂肪≥3.5%，粗纤维≤4.0%，粗灰分≤16.0%，食盐≤3.0%，水分≤10%)。试验过程采用饱食投喂方式，分别于每日9:00和18:00投喂，1 h后虹吸清除残饵、捡出死鱼，称重记录。试验周期60 d。
1.2.2 样品采集与分析
(1) 生长指标：试验结束后停食24 h，计算成活率，测定各组鱼体重、体长，计算特定生长率(SGR)、饲料系数(FC)、肥满度(K)。
饲料系数(FC)=F/(Wt-W0)
特定生长率(SGR, %·d-1)= (lnW′t-lnW′0)/t×100
肥满度(K, %)=W/L3×100
式中，W0与Wt分别表示正式试验开始前后各实验池鱼体总质量(g)，F为相应各实验池所投喂的饲料质量(g)，W′0与W′t分别表示正式试验开始前后各实验池鱼体平均质量(g)，W表示鱼体质量(g)，L表示鱼体长(cm)。
(2) 肌肉组分及血液生理生化指标：养殖试验结束停食24 h后取样。从每个池中随机捞取5尾鱼，立即放入200 mg·L-1的三卡因甲基磺酸盐(MS-222)水中进行麻醉，用1 mL一次性注射器进行尾静脉取血，部分置于含有抗凝剂枸橼酸钠的离心管中摇匀，4℃保存待检；部分血液4℃冰箱静置4 h后，12 000 r·min-1离心10 min，取上层血清于-80℃冰箱保存待检。取下鱼体背部、腹部肌肉混匀，用组织捣碎机捣碎后，待测。利用凯氏定氮法，根据GB/T 5009.5-2010测定蛋白质(丹麦FOSS公司kjeltec 2300型全自动凯氏定氮仪)；利用索氏提取法，按照GB/T 5009.6-2003测定粗脂肪；利用灼烧恒重法，按照GB/T 5009.4-2016测定灰分(丹麦FOSS公司L4/-10马弗炉)；酸性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶利用采购自南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测试。其他血液生化指标采用贝克曼全自动生化分析仪(AU-5800)测定。
1.3 数据统计
数据以平均值±标准差(X±SD)表示，利用Excel和SPSS 17.0统计软件进行数据分析，单因素方差分析(one-way ANOVA)检验不同试验组间生长、肌肉组分及非特异性免疫指标，以最小显著极差法(LSD)和Duncan′s多重比较检验组间差异显著性。
2. 结果及分析
2.1 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长的影响
瓦氏黄颡鱼生长参数如表 1所示。各密度组鱼初始体质量无显著差异(P＞0.05)。随着养殖密度的增大，瓦氏黄颡鱼终末体长、终末体重、特定生长率递减，G1组终末体长、终末体重、特定生长率显著高于其他组(P＜0.05)；G2组终末体重、特定生长率显著高于G3、G4组，终末体长与二者差异不显著；G3、G4组终末体长、终末体重、特定生长率无显著性差异(P＞0.05)。G1组瓦氏黄颡鱼鱼体肥满度显著高于G3、G4组(P＜0.05)。饲料系数随着养殖密度增加呈升高趋势，G4组显著高于G1、G2组(P＜0.05)。试验期间，各密度组瓦氏黄颡鱼存活率较大，随着养殖密度的增加，幼鱼存活率显著下降(P＜0.05)。生长性能分析结果表明：G1和G2组瓦氏黄颡鱼饲料系数及存活率无显著差异，从养殖产量及经济效益综合考虑，认为在本试验条件下，(25.23±0.09)g的瓦氏黄颡鱼在养殖密度为1.01 kg·m-3时的生长性能较好。
表 1 养殖密度对瓦氏黄颡鱼生长的影响Table 1. Growth parameters of Pelteobagrus vachelli juvenile at different stocking densities处理组 初始密度
/(kg·m-3)初始体重
/g终末体长
/cm终末体重
/g特定生产率
/(%·d-1)肥满度
/%饲料系数 存活率
/%G1 0.5 25.16±0.18 18.16±0.19a 60.88±1.10a 1.47±0.03a 1.02±0.02a 1.21±0.02c 96.67±2.89a G2 1.01 25.37±0.23 17.72±0.22b 54.38±0.94b 1.27±0.03b 0.98±0.05ab 1.22±0.04bc 95.00±2.50a G3 1.51 25.21±0.12 17.62±0.27b 52.31±1.37c 1.22±0.05c 0.96±0.03b 1.28±0.04ab 94.44±1.92b G4 2.02 25.19±0.17 17.58±0.13b 51.23±0.77c 1.18±0.02c 0.94±0.03b 1.30±0.03a 93.75±1.25b 注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(P＜0.05)，表 2、3同。 表 2 养殖密度对瓦氏黄颡鱼肌肉组分的影响Table 2. Effects of stocking density on the muscle composition of Pelteobagrus vachelli juvenile处理组 水分含量
/%蛋白质含量
/%脂肪含量
/%灰分含量
/%G1 71.48±0.23 16.34±0.08b 9.48±0.04a 1.61±0.04 G2 71.73±0.37 16.70±0.09a 9.02±0.18b 1.60±0.02 G3 71.75±0.22 16.77±0.07a 8.96±0.05b 1.64±0.01 G4 71.52±0.10 16.79±0.11a 8.86±0.13b 1.65±0.04 表 3 养殖密度对瓦氏黄颡鱼血液生理指标的影响Table 3. Blood biochemical parameters of Pelteobagrus vachelli juvenile under different stocking densities处理组 总蛋白/
(g·L-1)白蛋白/
(g·L-1)碱性磷酸酶
/(U·L-1)酸性磷酸酶
/(U·L-1)溶菌酶/
(U·mL-1)过氧化氢酶/
(U·mL-1)总超氧化物歧化酶/
(U·mL-1)丙二醛/
(nmol·L-1)谷丙转氨酶
/(U·L-1)谷草转氨酶
/(U·L-1)G1 40.29±0.91 11.35±0.82a 29.96±2.06 24.98±0.89 344.34±18.40a 3.99±0.29 50.21±3.33 8.09±0.22 12.73±0.70c 20.77±2.60c G2 40.69±1.66 10.60±0.58ab 30.69±2.93 25.17±1.04 346.16±9.23a 3.91±0.20 50.70±3.80 8.03±0.21 12.81±0.85c 20.51±3.13c G3 40.70±1.40 10.15±0.60bc 29.38±3.00 25.45±0.87 299.13±12.43b 3.98±0.27 51.15±3.30 8.09±0.17 22.79±1.85b 27.57±3.42b G4 40.69±1.02 9.59±0.31c 29.29±2.84 25.49±1.54 255.05±11.52c 4.14±0.38 50.27±2.45 8.12±0.20 32.58±3.22a 32.25±2.64a 2.2 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼肌肉组分含量的影响
瓦氏黄颡鱼肌肉组分含量变化如表 2所示。瓦氏黄颡鱼肌肉中蛋白质含量随养殖密度增大先明显升高后相对缓慢升高，G1组鱼体肌肉蛋白质含量显著低于其他组(P＜0.05)，G2、G3、G4组间无显著性差异(P＞0.05)；肌肉中脂肪含量随着养殖密度升高先明显降低后相对缓慢降低，G1组鱼体肌肉脂肪含量显著高于其他组(P＜0.05)，G2、G3、G4组间无显著性差异(P＞0.05)。不同养殖密度下瓦氏黄颡鱼肌肉水分、灰分含量无显著性差异(P＞0.05)。
2.3 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼非特异性免疫的影响
养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼血液生理指标的影响如表 3所示。各试验组瓦氏黄颡鱼血液中总蛋白、碱性磷酸酶、过氧化氢酶、总超氧化物歧化酶、丙二醛含量无显著差异(P＞0.05)；白蛋白水平随着养殖密度增高呈下降趋势，G1组显著高于G3、G4组(P＜0.05)，G1、G2组显著高于G4组(P＜0.05)；酸性磷酸酶水平随着养殖密度增高呈升高趋势，但各组间无显著性差异(P＞0.05)；溶菌酶水平变化趋势与白蛋白类似，G1、G2组＞G3组＞G4组(P＜0.05)；谷丙转氨酶、谷草转氨酶水平随着养殖密度增高呈升高趋势，G1、G2组＜G3组＜G4组(P＜0.05)，G1、G2组间无显著差异(P＞0.05)。
3. 讨论
3.1 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼生长和存活率的影响
养殖密度对不同鱼类、不同生长阶段的影响不一。一般情况下，养殖密度增高对鱼类的生长及饲料效率均有抑制作用[5, 14]。Christiansen等研究表明，随着养殖密度升高，北极红点鲑Salvelinus alpinus的摄食率和增重率显著降低[15]。本研究发现，初始养殖密度为0.5 kg·m-3时，瓦氏黄颡鱼的生长情况较好。随着养殖密度的提高，瓦氏黄颡鱼的生长性能(特定生长率、终末体重)均显著下降(P＜0.05)。这与部分鱼类养殖试验的结果相一致，银鲈Bidyanus bidyanus、欧洲鳇Huso huso、杂交鲟、白斑狗鱼等养殖中也存在养殖密度过高抑制鱼体生长现象[8, 16-18]。这可能是高密度养殖条件下，水体空间、溶解氧及食物的竞争加剧，鱼类新陈代谢能量消耗变大，导致其生长受到抑制。但部分学者对俄罗斯鲟鱼Acipenser gueldenstaedtii、宝石鲈Scortum barcoo、点带石斑鱼Epinephelus malabaricus的研究发现，过低的养殖密度也会降低鱼类的生长性能[6, 19-21]。但本试验并未发现瓦氏黄颡鱼有类似生长情况，分析认为本试验设置的养殖密度主要影响到瓦氏黄颡鱼占领域性行为，而对其集群行为影响较小。低密度组瓦氏黄颡鱼饲料系数显著低于高密度组(P＜0.05)也从侧面验证了这一点。综合考虑养殖成本及经济效益，瓦氏黄颡鱼在G1、G2养殖密度下，饲料系数及存活率没有显著差异，因此认为较高密度(1.01 kg·m-3)为其适宜养殖密度。
3.2 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼肌肉组分含量的影响
鱼肉蛋白质和脂肪含量是影响鱼类营养价值的主要因素[22]。温度、密度、饥饿等外界胁迫会对鱼体的肌肉组分产生影响[22-25]。任源远等[22]在对施氏鲟的研究中发现，养殖密度对其肌肉中的水分、灰分含量无显著性影响(P＞0.05)。肌肉中的蛋白质、脂肪含量随养殖密度的增大而降低(P＜0.05)。养殖密度对缘石脂鲤Brycon insigni)[23]、非洲鲶鱼Clarias gariepinus[24]、长丝异鳃鲶Heterobranchus longifilis[24]、草鱼Ctenopharyngodon idellus[25]肌肉成分也存在一定的影响。本研究结果表明，随养殖密度增大，瓦氏黄颡鱼肌肉的蛋白质有一定增加(P＜0.05)，肌肉脂肪含量明显降低(P＜0.05)，水分、灰分含量无显著差异(P＞0.05)。分析认为，当外界存在胁迫时，鱼类会通过增加新陈代谢水平，增加了机体内能源物质分解[8]。在高密度养殖条件下，瓦氏黄颡鱼为了适应胁迫，争夺食物、水体空间等，游动量增加，耗能增加，脂肪被分解产能。
3.3 养殖密度对瓦氏黄颡鱼幼鱼非特异性免疫的影响
外界胁迫会对鱼类免疫性能和抗氧化性能造成一定影响[26-29]，血液生化指标可以有效反映其机体健康水平及营养状况[8]，短期胁迫可能导致机体非特异性免疫能力增强，但长期的胁迫可能导致机体的部分非特异性免疫指标受到抑制。研究发现，瓦氏黄颡鱼血液中白蛋白、溶菌酶水平随养殖密度增高呈下降趋势，该研究结果与曹阳等[5]对俄罗斯鲟的研究结果相似。谷草转氨酶、谷丙转氨酶是肝功能的指示物，碱性磷酸酶是肾功能的指示物[8]。正常情况下，谷草转氨酶、谷丙转氨酶主要存在于机体肝细胞中。当机体组织细胞受到损伤时，酶会从细胞进入血液，引起血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶异常升高[30-31]。本研究中，瓦氏黄颡鱼血液中谷草转氨酶、谷丙转氨酶水平随着养殖密度增高呈升高趋势(P＜0.05)，表明过高的养殖密度会引起瓦氏黄颡鱼肝脏损伤，这与部分其他鱼类的研究结论相类似[6, 31]。碱性磷酸酶含量无显著性差异(P＞0.05)，表明在设置的养殖密度条件下，瓦氏黄颡鱼肾脏并未受到损伤。过氧化氢酶和超氧化物歧化酶是生物体抗氧化酶系的重要组成酶类，可以清除生物体内活性氧自由基。丙二醛是生物体内脂质过氧化的终产物，且会引起细胞损伤[32]。本试验中，不同密度组瓦氏黄颡鱼过氧化氢酶、超氧化物歧化酶、丙二醛水平无显著性差异(P＞0.05)，说明在试验设计的养殖密度区间，养殖密度对瓦氏黄颡鱼的抗氧化体系没有显著性影响。
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图 1 最佳退火温度 PCR 扩增
M：2000 DNA Marker；1～9 ：退火温度依次是52 、54、56、58、60、62、64、66、68 ℃。
Figure 1. PCR amplification under optimized annealing temperature
M: 2000 DNA Marker；1–9: annealing temperatures of 52 ℃, 54 ℃, 56 ℃, 58 ℃, 60 ℃, 62 ℃, 64 ℃, 66 ℃, and 68 ℃, respectively.
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图 2 最佳引物用量的双重 PCR 扩增
M：2000 DNA Marker；1～6：引物添加量分别为 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 和 0.6 μL。
Figure 2. PCR amplification with optimized primer concentration
M: 2000 DNA Marker; 1–6: amounts of added two pairs of primers 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, and 0.6 μL, respectively.
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图 3 双重PCR 敏感性试验结果
M：2000 DNA Marker；1：CyHV-2 和 CyHV-3混合质粒初始含量1×1011 copies·μL−1；2～12：以10倍比稀释1×1010 ～1×100 copies·μL−1混合质粒含量。
Figure 3. Sensitivity of Dual PCR Assay
M: 2000 DNA Marker; 1: mixed plasmid of CyHV-2 and CyHV-3 as template (initial concentration 1×1011 copies·μL−1) ; 2–12: diluted at 10 times ratio 1×1010–1×100 copies·μL−1.
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图 4 PCR 特异性试验结果
M：2000 DNA Marker；1：石斑鱼神经坏死病毒；2：石斑鱼虹彩病毒；3：大黄鱼虹彩病毒；4：蛙虹彩病毒；5：鳗疱疹病毒；6：CyHV-2 和 CyHV-3的混合样品；7：CyHV-2； 8：CyHV-3 。
Figure 4. Specificity of Dual PCR Assay
M: 2000 DNA Marker; 1: GNNV; 2: SGIV; 3: YCIV; 4: FV; 5: AHV; 6: mixed sample of CyHV-2 and CyHV-3; 7: CyHV-2; 8: CyHV-3.
表 1 双重PCR引物序列
Table 1 Sequence of primer for Dual PCR Assay
引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence (5′-3′)片段长度
Fragment length/bpCyHV-2-F CTGATTATTACGGAGAGTATGAC 715 CyHV-2-R CTGTGAGACTTTTGTAGATTATTC CyHV-3-F CTATGCTGGAACTGGTGATC 456 CyHV-3-R GAGAGATTCTGACGGTGAAG 
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表 2 样品检测结果
Table 2 Detection on clinical samples by Dual PCR Assay
检测方法
Detection method鱼种
Fish species阳性样品数/样品数
Positive samples/Total samplesCyHV-2 CyHV-3 《金鱼造血器官坏死病毒检测方法》（GB/T 36194—2018）
Detection method of goldfish haemotopoietic necrosis virus金鱼 3/9 — 混合样 2/2 — 《鲤疱疹病毒检测方法第一部分：锦鲤疱疹病毒》（SC/T 7212.1—2011）
Detection methods of cyprinid herpesvirus(CyHV)Part 1: Koi herpevirus锦鲤 — 3/9 混合样 — 2/2 双重PCR方法
Double PCR detection金鱼 3/9 — 锦鲤 — 3/9 混合样 2/2 2/2
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