TaqMan qRT-PCR Assay for Detecting Bovine Kobuvirus
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摘要:目的 建立一种快速、准确且能定量分析牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKoV）的检测方法。方法 根据GenBank上发布的牛嵴病毒3D基因序列设计合成一对特异性引物和一条探针，通过优化反应体系建立牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法，并对临床样品进行检测。结果 该方法最佳上下游引物浓度均为300 nmol·L−1，探针浓度为400 nmol·L−1，在1×101～1×108 copies·µL−1呈现良好的线性关系，线性相关系数R2=0.999，扩增效率为103%；特异性较强，在多个犊牛腹泻相关病原中，只检测出牛嵴病毒；敏感性较高，对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×101 copies·µL−1，而普通RT-PCR对BKoV质粒标准品最低检测下限为1×102 copies·µL−1；重复性较好，组内变异系数和组间变异系数均小于3%。2021年3～5月采自内蒙古地区牧场的37份犊牛粪样中BKoV的检出率为24.3%，通过标准曲线计算其病毒载量，其中腹泻粪样平均病毒载量为3.7×105 copies·µL−1，健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×103 copies·µL−1。结论 建立的牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异性强、稳定性好、灵敏度高，为BKoV的检测和分子流行病学调查提供了有力的手段。Abstract:Objective A rapid, accurate qRT-PCR method for detecting bovine kobuvirus (BKoV) was established and clinically tested for application.Method A pair of specific primers and a probe were designed and synthesized according to the 3D gene sequence of BKoV published on GenBank for the establishment of a TaqMan fluorescence qRT-PCR assay. The reaction system of the analytic was optimized prior to verification on clinical specimens.Result The optimal upstream and downstream primers were 300 nmol·L−1 in concentration, and the applied probe 400 nmol·L−1. A linearity with a correlation coefficient of R2= 0.999 was achieved in the range of 1×101−1×108 copies·μL−1. The amplification efficiency reached 103%. The assay demonstrated a high specificity among the pathogens related to diarrhea in calves, a high sensitivity with the minimum detection limit of 1×101 copies·μL−1 on BKoV plasmid standard, in comparison to that of 1×102 copies·μL−1 by conventional RT-PCR, and a high repeatability with a coefficient of variation of less than 3% within and between groups. In 37 bovine fecal samples collected from different pastures in Inner Mongolia from March to May 2021, the assay showed a positive detection rate of 24.3%. The calculated viral loads using the standard curve had an average on the feces from diarrheal animals at 3.7×105 copies·μL−1 and at 8.65×103 copies·μL−1 on the specimens from healthy calves.Conclusion The newly developed TaqMan fluorescent qRT-PCR assay was specific, repeatable, and sensitive in detecting BKoV. It could be applied for clinic diagnosis and epidemiological investigation on the disease.
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Keywords:
- Bovine kobuvirus /
- fluorescence qRT-PCR /
- calf diarrhea /
- specificity /
- sensitivity /
- repeatability
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0. 引言
【研究意义】犊牛腹泻在全国各地均常年发生，涉及范围广，危害影响大，其病原较为复杂，同时多伴随混合感染现象出现，发病率和致死率居高不下，养殖产业遭受巨大冲击，严重制约牛养殖业发展与壮大。根据近几年的流行病学调查发现，牛嵴病毒（Bovine kobuvirus，BKoV）可导致两周以上、二月龄以下犊牛严重腹泻、脱水、体温明显升高[1]，容易与其他致犊牛腹泻病原，如牛轮状病毒等混合感染[2]，且腹泻犊牛粪样牛嵴病毒检出率明显高于健康犊牛样本检出率，表明此病毒可以单独致病或促进犊牛腹泻，因此亟需建立一种高效、灵敏、特异的TaqMan荧光定量RT-PCR检测牛嵴病毒的方法，为开展内蒙古地区犊牛腹泻分子流行病学调查提供技术支撑。【前人研究进展】牛嵴病毒是国内近几年发现的引起犊牛腹泻的新病原，是小RNA病毒科嵴病毒属的一种无囊膜单链 RNA病毒[1]，其基因组长度约8.3 kb，由5′、3′非翻译区（UTR）、前导蛋白L和一个编码大型多聚蛋白的开放阅读框（ORF）组成[3]，ORF水解后包含编码结构蛋白的P1区和编码非结构蛋白的P2、P3区，其中P1区分为VP0、VP3、VP1这3种结构蛋白，P2区切割为2A、2B、2C等3种非结构蛋白，P3区切割为3A、3B、3C、3D等4种非结构蛋白[4]。该病毒直径27～30 nm[5]，因病毒颗粒表面结构凹凸不平或呈旋钮状而得名。目前检测牛嵴病毒的方法已有RT-PCR检测方法[6]、染料法实时荧光PCR方法[2]、荧光探针PCR方法[7]。2018年，王文佳等[6]通过建立RT-PCR检测方法对河南省地区的牛场进行牛嵴病毒的调查研究，检测到牛嵴病毒的阳性率为4.72%，敏感性为2.23×106 copies·µL −1；2021年，师志海等[2]首次建立了染料法实时荧光PCR方法检测牛嵴病毒，该方法的敏感性达1.08×101 copies·µL −1，2022年，该学者又建立荧光探针PCR方法对BKoV进行定量检测，其对BKoV的最低检出量为1.1×101 copies·µL −1[7]。【本研究切入点】锁核酸结构可以增加引物的熔解温度，提高其识别能力以及对错配碱基的分辨能力[8]，本研究在引物3′末端添加了锁核酸结构，以便提高定量RT-PCR的敏感性和特异性。【拟解决的关键问题】通过荧光定量RT-PCR引物和探针浓度的优化，建立高效、灵敏、特异的检测牛嵴病毒的方法，进一步提高牛嵴病毒检测检测效率。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
牛病毒性腹泻病毒1型（Bovine viral diarrhea virus 1，BVDV-1）、牛病毒性腹泻病毒2型（Bovine viral diarrhea virus 2，BVDV-2），牛轮状病毒（Bovine rotavirus，BRV）、牛冠状病毒（Bovine coronavirus，BCoV）、沙门菌（Salmonella）、大肠杆菌（Escherichia coli，E.coli），均由内蒙古农业大学兽医学院兽医传染病学教研室保存；37份犊牛粪样来源于内蒙古地区牧场，所有样本于–80 ℃保存[9]。
1.2 主要试剂
RNeasy Mini Kit 购自QIAGEN公司；One Step qRT-PCR Kit均购自promega公司；pMD19-T载体、DH5ɑ感受态细胞、Premix TaqTM、EASY Dilution、6×Loading Buffer、500 bp DNA Ladder Marker均购自TaKaRa公司；DNA凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；质粒小提试剂盒、RNase-Free ddH2O 购自TIANGEN公司[9]。
1.3 引物和探针的设计与合成
根据GenBank的BKoV-3D基因序列（KF728683、KY260614、AB097153、AB084788、HQ650180、MN336260），利用Lasergene软件中MegAlign程序进行同源性分析，选取保守序列设计了一对BKoV引物和一条探针，引物由上海生工生物工程有限公司合成，探针由宝生物工程（北京）有限公司合成。引物及探针序列见表1。
表 1 牛嵴病毒引物及探针序列信息Table 1. Sequences of BKoV primers and probe项目
Items名称
Names序列(5'-3')
Sequences(5'-3')扩增长度
Amplification length/bp引物 Primers BKoV-F-221 TYTCACCYGCTTGGCTCTC 200 S-BKoV-R-421 AGTGTAGGTGCCRCGCAT+A 探针 Probe BKV-TZ FAM-CTTCACACAGTGGCGTGGTGAACT-BHQ1 1.4 牛嵴病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立
1.4.1 标准品的制备
按照RNeasy Mini Kit试剂盒说明书对预试验BKoV核酸阳性粪样提取RNA，用上下游引物扩增目的基因，胶回收纯化PCR产物，连接至pMDl9-T载体并转化到大肠杆菌DH5α感受态细胞中，涂板，筛选出阳性克隆菌并进行增菌培养，提取质粒进行测序鉴定。以鉴定正确的阳性重组质粒命名为pMD19T-BKoV，测定重组质粒DNA浓度，计算拷贝数，10倍梯度稀释成1～1×1010 copies·µL−1作为标准品。
1.4.2 荧光定量RT-PCR方法的条件优化
模板为牛嵴病毒的阳性重组质粒DNA，分别吸取上下游引物各0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 µL（终浓度分别为100、200、300、400、500 nmol·L−1）进行引物浓度优化。再取优化好的引物浓度，探针各吸取0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 µL（终浓度分别为100、200、300、400、500 nmol·L−1），模板为牛嵴病毒的阳性重组质粒DNA，进行探针浓度优化。利用优化好的引物和探针浓度进行荧光定量PCR扩增，扩增体系：2×One Step RT-PCR Buffer 10 µL， TaKaRa Ex Taq HS 0.4 µL，PrimeScript RT enzyme Mix 0.4 µL，10 µmol·L−1 上下游引物各0.6 µL，10 µmol·L−1探针0.8 µL，cDNA模板2 µL，RNase-Free ddH2O 5.2 µL，总体积为20 µL；扩增程序：42 ℃反转录 5 min；95 ℃预变性 10 s；95 ℃ 变性15 s，59 ℃ 退火延伸45 s，共45个循环。
1.4.3 标准曲线的建立
选取含量为1.0×101～1.0×108 copies·µL−1质粒DNA作为模板进行扩增，以无酶水为阴性对照，用优化的荧光定量RT-PCR扩增体系及程序进行扩增，绘制标准曲线[9]。
1.4.4 特异性试验
按照RNA/DNA提取试剂盒说明书提取牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、沙门菌以及大肠杆菌核酸，以1.0×106 copies·µL−1的牛嵴病毒阳性重组质粒标准品作为阳性对照，无酶水为阴性对照。利用上述优化的反应体系进行荧光定量RT-PCR，评价该方法的特异性。
1.4.5 敏感性试验
选取含量为1.0×100～1.0×108 copies·µL−1质粒DNA作为模板，进行普通RT-PCR和荧光定量RT-PCR扩增，得出两种检测方法能够检出的最低拷贝数[9]。
1.4.6 重复性试验
选取含量为1.0×102～1.0×106 copies·µL−1 5个梯度的质粒DNA，利用上述优化的反应体系进行荧光定量RT-PCR，进行组内和组间重复性试验，并分别计算组内和组间Ct值的变异系数，检测该方法的重复性。
1.5 临床样品的检测
按照RNA快速提取试剂盒说明书提取37份临床样品核酸，应用本试验建立的牛嵴病毒荧光定量RT-PCR方法和普通RT-PCR方法对在内蒙古地区牧场采集的37份犊牛粪样进行检测，并比较二者的一致性。
2. 结果与分析
2.1 荧光定量RT-PCR方法优化
在优化后的20 µL扩增体系中，选取Ct值最小、荧光量最高为参考标准。结果表明，牛嵴病毒的最佳上下游引物浓度均为300 nmol·L−1（图1），最佳探针浓度为400 nmol·L−1（图2）。
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图 1 BKoV荧光定量RT-PCR引物优化结果A～E：引物浓度分别为500、400、300、200、100 nmol·L−1。Figure 1. Optimization on primer concentration for detecting BKoV by qRT-PCRA–E: Concentrations of primers at 500, 400, 300, 200, and 100 nmol·L−1, respectively.![]()
图 2 BKoV荧光定量RT-PCR探针优化结果A～E：探针浓度分别为500、400、300、200、100 nmol·L−1。Figure 2. Optimization on probe concentration for detecting BKoV by qRT-PCRA–E: Concentrations of probe at 500, 400, 300, 200, and 100 nmol·L−1, respectively.2.2 荧光定量RT-PCR标准曲线的建立
将重组质粒标准品pMD19T-BKoV 梯度稀释成1.0×101～1.0×108 copies·µL−1作为模板进行扩增，获得牛嵴病毒荧光定量RT-PCR的扩增曲线和标准曲线（图3）。结果显示，牛嵴病毒的标准曲线参数斜率为–3.252；R2值为0.999；扩增效率（E）为103%，说明建立的方法相关性较高，可用于牛嵴病毒的定量检测。
2.3 特异性试验
采用本试验建立的牛嵴病毒荧光定量RT-PCR方法对牛病毒性腹泻病毒、牛轮状病毒、牛冠状病毒、沙门菌以及大肠杆菌核酸进行检测，结果（图4）显示，只检测出牛嵴病毒，其他病原和阴性对照均无扩增曲线，证明该方法具有较好特异性，可用于牛嵴病毒检测。
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图 4 BKoV荧光定量RT-PCR特异性试验结果A：牛嵴病毒；B：其他病原和阴性对照。Figure 4. Specificity of qRT-PCR assay for BKoV detectionA: BKoV; B: other pathogens and negative control.2.4 敏感性试验
牛嵴病毒的荧光定量RT-PCR最低检出量达1.0×101 copies·µL−1（图5），而应用相同引物扩增的普通RT-PCR最低检出量为1.0×102 copies·µL−1（图6），表明本试验所建立方法具有较好的敏感性。
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图 5 BKoV荧光定量RT-PCR敏感性试验结果A～H分别为质粒DNA 含量1.0×108～1.0×101 copies·µL−1；I：阴性对照；J：1.0×100 copies·µL−1质粒DNA。Figure 5. Sensitivity of qRT-PCR assay for BKoV detectionA–H: plasmid DNA at 1.0×108−1.0×101 copies·μL−1, respectively; I: negative control ; J:1.0×100 copies·μL−1 plasmid DNA.![]()
图 6 BKoV普通RT-PCR敏感性试验结果M：500 bp Ladder DNA Marker；1～9：质粒DNA用量分别为 1.0×108～1.0×100 copies·µL−1；10：阴性对照。Figure 6. Sensitivity of qRT-PCR assay for BKoV detectionM: 500 bp ladder DNA marker; 1–9: plasmid DNA concentrations at 1.0×108−1.0×100 copies·μL−1, respectively; 10: negative control.2.5 重复性试验
以含量分别为1.0×102～1.0×106 copies·µL−1的牛嵴病毒重组质粒标准品作为模板进行3次重复性试验，结果组内和组间试验Ct值的变异系数均小于3.0%，表明该方法重复性和稳定性良好，见表2。
表 2 牛嵴病毒荧光定量RT-PCR组内及组间重复性Table 2. Intra- and inter-group repeatability of qRT-PCR assay for BKoV detection标准品
Plasmid standard
concentration/
(copies·µL−1)组内重复性
Reproducibility intra-group组间重复性
Reproducibility intra-group平均值
（M±SD）/%变异系数
CV/%平均值
（M±SD）/%变异系数
CV/%1×106 21.99±0.23 1.0 22.02±0.04 0.2 1×105 25.30±0.03 0.1 25.31±0.09 0.4 1×104 28.76±0.24 0.8 28.91±0.13 0.4 1×103 32.04±0.03 0.1 32.19±0.29 0.9 1×102 34.82±0.49 1.4 34.77±0.63 1.8 2.6 临床样品检测结果
应用普通RT-PCR方法和本试验所建立的牛嵴病毒荧光定量RT-PCR方法对采集的37份犊牛粪样进行检测，同时设置阳性对照和阴性对照。普通RT-PCR方法只检出6份牛嵴病毒阳性病料，阳性率为16.2%，而应用本试验建立的荧光定量RT-PCR方法则检出9份牛嵴病毒阳性病料，阳性率为24.3%（表3），说明本试验建立的荧光定量RT-PCR方法的敏感性高于普通RT-PCR方法的敏感性。
表 3 犊牛粪样牛嵴病毒载量检测Table 3. Detection of BKoV load on calf fecal samples粪样
Fecal samples数量
Number阳性数量
Positive
number最低拷贝数
Minimum copies/
（copies·µL−1）最高拷贝数
Maximum copies/
（copies·µL−1）平均拷贝数
Average copies/
（copies·µL−1）腹泻
Diarrhea30 7 2.33×103 1.90×106 3.70×105 健康
Healthy7 2 3.54×103 1.38×103 8.65×103 3. 讨论与结论
近年来，我国乃至世界各国都发生了大面积犊牛腹泻（俗称小牛痢疾），严重影响当地经济与畜牧养殖业的发展，因此犊牛腹泻被称为新生犊牛的杀手[10]，部分牧场犊牛腹泻发病率高达90%[11]。犊牛腹泻是一种消化系统疾病，主要指刚出生的小牛与外界环境不适应，表现出腹泻、乏力、蜷躯卧地、食欲不振、身体消瘦、体温升高、排水样便、软粪便等症状。该病多季节都可发生，尤其在气候多变季节（初春及秋末初冬）多发[12]，发病率和死亡率都很高，可直接影响犊牛早期的生长发育和成年后的泌乳性能[12]，也危害养殖业的经济效益和可持续发展。目前引起犊牛腹泻的原因有很多，包括环境和饲料等非感染性原因，细菌、寄生虫以及病毒等重要感染性病因，这些病因可能单独存在，也可能合并存在。
2008年，首次在腹泻牛的粪便样品中检出BKoV[13]。2013年，常继涛等[14]在内蒙古、安徽、新疆等地进行 BKoV流行病学调查，结果表明牛嵴病毒在我国西北部地区广泛存在，近年来大部分数据表明BKoV作为我国新发病原已经在我国各省市地区广泛流行并且可发生混合感染，对养殖户的影响较大。此类现象存在主要有以下两方面原因：一方面可能是由于工作人员对新发病原不了解，不重视，导致疏忽奶牛引种过程中的必要检测与步骤；另一方面可能是人为因素，未及时消毒，未按规定操作等造成交叉感染，同时多种肠道病毒共同作用，引发患病牛群腹泻现象更为严重，从而加大对犊牛腹泻的诊断和控制。因此，在牛群培育生产中，建议将新发腹泻病原纳入日常检测范围[15]。
本试验进行RT-PCR预试验时产生非特异条带，在引物中加入锁核酸结构后，增加引物的Tm值[16]，扩增出单一的特异性条带，进而提高荧光定量RT-PCR的特异性和敏感性。本试验建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强，从牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒、牛轮状病毒、大肠杆菌以及沙门菌核酸中能特异性检测牛嵴病毒；灵敏度高，最低检出量达1.0×101 copies·µL−1，敏感性高于文献报道的普通RT-PCR检测方法[6]；稳定性好，在1.0×102～1.0×106 copies·µL−1的5个梯度范围内具有良好的重复性（变异系数 ＜3.0%）。应用建立的方法首次检测了犊牛粪样BKoV载量，其中腹泻粪样平均病毒载量为3.70×105 copies·µL−1，健康犊牛粪样平均病毒载量为8.65×103 copies·µL−1，且样品BKoV阳性率为24.3%。从数据看出腹泻粪样牛嵴病毒载量明显高于健康犊牛粪样病毒载量，证明牛嵴病毒可以引起混合感染或促进犊牛腹泻的发生，是导致犊牛腹泻的新病原。本试验建立的检测BKoV的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好，可以为BKoV的快速检测和分子流行病学调查提供技术支撑。
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图 1 BKoV荧光定量RT-PCR引物优化结果
A～E：引物浓度分别为500、400、300、200、100 nmol·L−1。
Figure 1. Optimization on primer concentration for detecting BKoV by qRT-PCR
A–E: Concentrations of primers at 500, 400, 300, 200, and 100 nmol·L−1, respectively.
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图 2 BKoV荧光定量RT-PCR探针优化结果
A～E：探针浓度分别为500、400、300、200、100 nmol·L−1。
Figure 2. Optimization on probe concentration for detecting BKoV by qRT-PCR
A–E: Concentrations of probe at 500, 400, 300, 200, and 100 nmol·L−1, respectively.
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图 4 BKoV荧光定量RT-PCR特异性试验结果
A：牛嵴病毒；B：其他病原和阴性对照。
Figure 4. Specificity of qRT-PCR assay for BKoV detection
A: BKoV; B: other pathogens and negative control.
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图 5 BKoV荧光定量RT-PCR敏感性试验结果
A～H分别为质粒DNA 含量1.0×108～1.0×101 copies·µL−1；I：阴性对照；J：1.0×100 copies·µL−1质粒DNA。
Figure 5. Sensitivity of qRT-PCR assay for BKoV detection
A–H: plasmid DNA at 1.0×108−1.0×101 copies·μL−1, respectively; I: negative control ; J:1.0×100 copies·μL−1 plasmid DNA.
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图 6 BKoV普通RT-PCR敏感性试验结果
M：500 bp Ladder DNA Marker；1～9：质粒DNA用量分别为 1.0×108～1.0×100 copies·µL−1；10：阴性对照。
Figure 6. Sensitivity of qRT-PCR assay for BKoV detection
M: 500 bp ladder DNA marker; 1–9: plasmid DNA concentrations at 1.0×108−1.0×100 copies·μL−1, respectively; 10: negative control.
表 1 牛嵴病毒引物及探针序列信息
Table 1 Sequences of BKoV primers and probe
项目
Items名称
Names序列(5'-3')
Sequences(5'-3')扩增长度
Amplification length/bp引物 Primers BKoV-F-221 TYTCACCYGCTTGGCTCTC 200 S-BKoV-R-421 AGTGTAGGTGCCRCGCAT+A 探针 Probe BKV-TZ FAM-CTTCACACAGTGGCGTGGTGAACT-BHQ1 
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表 2 牛嵴病毒荧光定量RT-PCR组内及组间重复性
Table 2 Intra- and inter-group repeatability of qRT-PCR assay for BKoV detection
标准品
Plasmid standard
concentration/
(copies·µL−1)组内重复性
Reproducibility intra-group组间重复性
Reproducibility intra-group平均值
（M±SD）/%变异系数
CV/%平均值
（M±SD）/%变异系数
CV/%1×106 21.99±0.23 1.0 22.02±0.04 0.2 1×105 25.30±0.03 0.1 25.31±0.09 0.4 1×104 28.76±0.24 0.8 28.91±0.13 0.4 1×103 32.04±0.03 0.1 32.19±0.29 0.9 1×102 34.82±0.49 1.4 34.77±0.63 1.8
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表 3 犊牛粪样牛嵴病毒载量检测
Table 3 Detection of BKoV load on calf fecal samples
粪样
Fecal samples数量
Number阳性数量
Positive
number最低拷贝数
Minimum copies/
（copies·µL−1）最高拷贝数
Maximum copies/
（copies·µL−1）平均拷贝数
Average copies/
（copies·µL−1）腹泻
Diarrhea30 7 2.33×103 1.90×106 3.70×105 健康
Healthy7 2 3.54×103 1.38×103 8.65×103
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1. 苗艳. 牛嵴病毒研究进展. 现代畜牧科技. 2024(06): 119-121 . 
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