Expressions of Flavonoid Biosynthesis Genes in Acorus gramineus Determined by Transcriptome Sequencing
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摘要:目的 高通量测序获取金钱蒲（Acorus gramineus）7个不同组织转录组信息，为不同组织中类黄酮化学成分合成差异提供分子信息，进而在分子水平上研究金钱蒲不同组织内类黄酮化学成分合成差异。方法 利用高通量测序技术平台完成金钱蒲7个不同部位的转录组测序，对unigenes进行功能注释，借助注释结果挖掘类黄酮生物合成通路，筛选通路中的差异表达基因（Differentially expressed genes，DEGs）并进行表达量分析。结果 共获得高质量数据39.91～42.97 M，总碱基量为5.98～6.45 Gb，Q30碱基百分比大于94.05%，GC含量为47.81%～50.32%。18616条unigenes在GO数据库中获得62 506个注释，根据功能划分为细胞组分、分子功能及生物过程三大类，分别对应 6、14、21个亚类，大量基因分布在细胞解剖实体、连接、催化活性和细胞过程等亚类中。10124条unigenes 富集在 KEGG 数据库的5大类19个亚类中，从其中筛选出4条类黄酮生物合成途径，14个关键酶，63个差异表达酶基因。这些基因在金钱蒲7个组织中具有表达差异性，表明这些结构基因在类黄酮生物合成过程中于不同部位发挥作用。结论 研究结果丰富了金钱蒲的遗传信息，也为进一步解析金钱蒲类黄酮生物合成基因功能提供参考依据。Abstract:Objective Transcriptomes of Acorus gramineus tissues were applied to molecularly differentiating flavonoid synthesis genes in the organs.Methods The high-throughput sequencing technology was employed to obtain the transcriptomes of the genes in 7 organs of A, gramineus. Thereby, the functions of unigenes were annotated, the flavonoid biosynthesis pathway deciphered, the differentially expressed genes (DEGs) in the pathway screened, and an expression analysis performed.Results A total of 39.91 to 42.97 M of high-quality data were secured with 5.98–6.45 Gb bases, more than 94.05% Q30 bases, and a GC content of 47.81%–50.32%. From the GO database, 62506 were annotated to classify the 18616 unigenes into 3 functional groups that included cellular components, molecular functions, and biological processes corresponding to 6, 14, and 21 subcategories, respectively. Numerous genes were distributed in the subcategories, such as cellular anatomical entities, connections, catalytic activities, and cellular processes. There were 10124 unigenes enriched in the 5 major categories and 19 subclasses of the KEGG database. From which, 4 flavonoid biosynthesis pathways, 14 key enzymes, and 63 DEGs were screened. The transcriptomes in 7 tissues of A. gramineus obtained in this study led to the identification of 63 DEGs involved in 4 flavonoid biosynthesis pathways. These genes differed in expressions in the organs indicating their diversified roles in the flavonoid biosynthesis in A. gramineusConclusion The research results have enriched the genetic information of A. gramineus and provided a reference for further elucidating the functional genes involved in the biosynthesis of flavonoids in A. gramineus.
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Keywords:
- Acorus gramineus /
- transcriptome /
- flavonoids /
- expression analysis
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0. 引言
【研究意义】我国是世界上绿肥种植年限最长、面积最大、范围最广的国家。然而，随着化肥的推广应用，绿肥种植面积迅速减少，过量施用化肥以及不合理的耕作模式导致土壤环境逐渐恶化[1]。目前，柑橘在广西的种植面积已超过40万hm2，种植户单纯追求产量，导致过度依赖化肥，其肥料利用率低，生产成本居高不下，且果品质量欠佳，制约了柑橘产业的可持续发展[2]。绿肥作为一种清洁的有机肥源，压青还田后在改善土壤化学及生物学性状，促进对主栽作物的养分供给和保障作物稳产、高产方面具有明显优势[3-4]。因此，在柑橘园种植和利用绿肥，提高土壤肥力、改善橘园土壤环境是推进农业绿色发展的重要方式。【前人研究进展】前人利用尼龙网袋法、同位素标记法、红外光谱法和13C核磁共振法等手段掌握了绿肥作物的腐解方法[5]。绿肥还田后秸秆腐解及养分释放过程受绿肥作物自身化学性质、环境条件以及田间管理措施等[5]多种因素影响，其腐解过程主要分为快速腐解期、缓慢腐解期和腐解停滞期[6-7]。而养分矿化速率不同的主要原因是绿肥茎秆中钾元素以K+存在于细胞中或植物组织内，很容易被水浸提而快速释放，磷、氮和碳等则以难分解的有机态为主，在物理作用下分解释放较慢[8]。【本研究切入点】近年来，拉巴豆（Dolichos lablab）作为多年生绿肥，紫云英（Astragalus sinicus）、光叶苕子（Viciavillosa rothvar）、紫花苜蓿（Medicago sativa）、黑麦草（Lolium multiflorum）等作为冬季绿肥在广西柑橘园行间种植并应用推广[9]，但这5种绿肥在柑橘地的腐解和养分释放还鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究采用尼龙网袋法，研究拉巴豆、紫云英、光叶苕子、紫花苜蓿、黑麦草在柑橘园行间还田后的腐解情况，分析其腐解规律和养分释放动态特征，为橘园绿肥的合理利用和柑橘养分管理提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验开展于广西南宁市义平水果种植专业合作社柑橘基地，该地属亚热带季风气候，年平均气温21.6 ℃，东经108°5′、北纬23°1′，海拔255 m。柑橘品种为沃柑，绿肥品种为多年生豆科绿肥：拉巴豆（DL）；冬季豆科绿肥：紫云英（AS）、光叶苕子（VR）、紫花苜蓿（MS）；冬季禾本科绿肥：黑麦草（LM）。绿肥种质资源来源于广西农业科学院农业资源与环境研究所，均为同批次，干基养分含量见表1。试验地土壤类型为红壤，基本理化性质为：碱解氮86.3 mg·kg−1，有效磷7.5 mg·kg−1，速效钾96 mg·kg−1，有机质18.67 g·kg−1，pH5.7。试验地在试验期间的降雨量见图1，平均气温见图2。
表 1 供试绿肥的含水率及碳、氮、磷、钾养分含量Table 1. Contents of water, C, N, P, and K in 5 green manures绿肥品种
Green manure varieties含水率
Moisture content/%全碳
Carbon/%全氮
Nitrogen/%全磷
Phosphorus/%全钾
Potassium/%碳氮比
Ratio of carbon and nitrogen拉巴豆 Dolichos lablab 76.5 46.25 2.81 0.64 3.15 16.46 紫云英 Astragalus sinicus 84.52 45.27 2.82 0.36 2.74 16.05 光叶苕子 Viciavillosa Rothvar 85.00 39.85 2.44 0.29 3.08 16.33 紫花苜蓿 Medicago sativa 75.79 44.37 2.43 0.22 2.08 18.26 黑麦草 Lolium multiflorum 83.64 42.87 2.12 0.72 3.87 20.22 1.2 试验设计
5种绿肥均于2017年10月下旬种植，于2018年4月10日对5种绿肥进行收割，将地上部分切成2 cm小段，混匀后装入尼龙网袋，每袋装入200 g，将袋展平、封好口袋，在柑橘两行之间的小区内翻压绿肥，还田深度为20 cm，间距为30 cm。根据李帅等方法[10]，还田后第0、20 、40 、60 、80 、100 d进行取样，即当年7月19日试验结束。每次每种绿肥处理取3袋，样品取回后用蒸馏水冲洗干净，烘干称其质量、磨碎后测定碳、氮、磷、钾含量。
1.3 指标测定
植物样全碳含量采用重铬酸钾容量法-外加热法测定，样品经浓硫酸-过氧化氢消解后，采用凯氏定氮法测定全氮含量，用钒钼黄比色法测定全磷含量，采用火焰光度计法测定全钾含量。
1.4 数据处理与统计
本文数据处理中均以干样进行计算。利用Microsoft Excel软件进行数据处理和绘图，用SPSS22.0进行方差分析。
累积腐解量(g)=m0−mt (1) 平均腐解速率(g⋅d−1)=(m0−mt)/t (2) 累积腐解率(%)=[(m0−mt)/m0]×100% (3) 养分累积释放率(%)=[(w0−wt)/w0]×100% (1) 式中，m0为绿肥初始干物质量，mt为翻压t天的绿肥干物质量；w0为绿肥初始养分含量，wt为翻压t天的绿肥养分含量。
2. 结果与分析
2.1 绿肥腐解特征
经过100 d的腐解试验，结果表明（表2）：拉巴豆的累计腐解量在整个腐解阶段均为全组最高，且显著高于其他处理（P＜0.05）。5种绿肥的腐解分为前期快速腐解期（0～20 d）和中后期的缓慢腐解期（20～100 d）。前20 d，5种绿肥的腐解速率达0.53～1.74 g·d −1，到了第20～40 d则降至0.06～0.31 g·d −1，随后2次取样结果表明，5种绿肥的腐解速率依旧较低，但到了第80～100 d，5种绿肥腐解速率均有所升高，这可能与该时间段（7月份）气温高有关，根据当地气象局提供的数据显示，第80～100 d的腐解期平均气温为整个试验期的最高（图1）。
表 2 不同绿肥腐解量、腐解速率及腐解率Table 2. Quantity, speed, and rate of manure decomposition绿肥品种
Green manure varieties拉巴豆
Dolichos lablab紫云英
Astragalus sinicus光叶苕子
Viciavillosa Rothvar紫花苜蓿
Medicago sativa黑麦草
Lolium multiflorum累计腐解量
Accumulative decomposition amount/g第20 d
The 20th day34.76±0.10 a 21.09±0.24 c 10.66±0.16 e 23.29±0.22 b 16.64±1.11 d 第40 d
The 40th day35.92±0.65 a 21.84±0.63 c 16.17±2.54 d 29.45±3.65 b 20.37±1.56 c 第60 d
The 60th day37.75±0.58 a 23.93±0.04 c 18.57±0.90 d 32.00±3.95 b 23.98±0.25 c 第80 d
The 80th day39.40±0.96 a 25.28±0.05 c 20.05±0.43 d 33.85±3.32 b 25.40±0.75 c 第100 d
The 100th day42.10±0.20 a 27.94±0.25 d 23.74±0.75 e 40.98±0.22 b 30.33±0.47 c 腐解速率
Decomposing speed/（g·d −1）第20 d
The 20th day1.74±0.01 a 1.05±0.02 b 0.53±0.01 d 1.16±0.02 b 0.83±0.09 c 第40 d
The 40th day0.06±0.02 bc 0.04±0.01 c 0.28±0.06 a 0.31±0.12 a 0.19±0.06 abc 第60 d
The 60th day0.09±0.01 a 0.10±0.02 a 0.12±0.05 a 0.13±0.01 a 0.18±0.04 a 第80 d
The 80th day0.08±0.01 a 0.07±0.00 a 0.07±0.02 a 0.09±0.02 a 0.07±0.02 a 第100 d
The 100th day0.13±0.02 b 0.13±0.06 b 0.18±0.02 b 0.36±0.09 a 0.25±0.01 ab 腐解率
Decomposing rate/%第20 d
The 20th day73.96±0.35 a 68.11±1.23 a 35.52±0.82 c 48.11±0.71 b 50.86±5.34 b 第40 d
The 40th day76.43±0.80 a 70.55±1.12 ab 53.90±4.88 c 60.82±4.35 bc 62.25±2.76 bc 第60 d
The 60th day80.33±0.71 a 77.28±0.08 a 61.90±1.73 b 66.09±4.59 b 73.28±2.02 a 第80 d
The 80th day83.84±1.18 a 81.66±0.09 a 66.82±0.83 b 66.92±3.97 b 77.63±1.31 a 第100 d
The 100th day89.57±0.24 a 90.25±0.46 a 79.13±1.45 c 84.64±0.26 b 87.03±2.12 ab 注：不同小写字母之间表示同一取样批次不同绿肥的试验结果之间有显著差异（P＜0.05），下表同。
Note: Data with different lowercase letters indicate significant differences in same sampling batch (P＜0.05). Same for following tables.腐解率方面，5种绿肥的腐解均较为彻底，这与本试验地高温多雨有关，试验期间，试验地平均气温达27.68 ℃（图1），日平均降雨量达到4.15 mL（图2）。其中，腐解至20 d，5种绿肥的腐解率达到35.52%～73.96%，腐解至100 d，其腐解率分别达79.13%～90.25%。在前4次取样中，拉巴豆的腐解率均为最高，第100 d取样时，紫云英的腐解率为全组最高。5种绿肥累计腐解率分别表现为紫云英＞拉巴豆＞黑麦草＞紫花苜蓿＞光叶苕子，紫云英和拉巴豆累计腐解率显著高于光叶苕子和紫花苜蓿。因此，5种绿肥的累计腐解量最高为拉巴豆，累计腐解率最高的为紫云英，光叶苕子的累计腐解量及腐解速率均为全组最低。
2.2 碳释放特征
由表3可知，5种绿肥的碳释放均大致表现出0～20 d释放快，20～100 d相对较慢的特征，但不同绿肥之间仍有较大差异。腐解至20 d时，拉巴豆、紫云英、光叶苕子、紫花苜蓿、黑麦草的碳累计释放率分别为78.59%、72.99%、38.10%、53.93%、56.82%，拉巴豆和紫云英的碳累计释放率显著高于其余几组（P＜0.05）。腐解至100 d时，5种绿肥碳累计释放率表现为黑麦草＞拉巴豆＞紫云英＞紫花苜蓿＞光叶苕子，分别达到95.48%、94.06%、92.58%、86.69%、80.90%，除拉巴豆外，黑麦草的碳累计释放率显著高于其余几组，光叶苕子的累计释放率均为全组最低。
表 3 不同绿肥碳释放特征Table 3. C releases of 5 green manures绿肥品种
Green manure varieties碳释放率 Release rates of C/% 第20 d
The 20th day第40 d
The 40th day第60 d
The 60th day第80 d
The 80th day第100 d
The 100th day拉巴豆 Dolichos lablab 78.59±0.17 a 83.21±0.63 a 85.28±0.66 a 89.80±0.85 a 94.06±0.17 ab 紫云英 Astragalus sinicus 72.99±1.70 a 76.59±1.08 a 81.11±0.17 ab 90.28±0.02 a 92.58±0.31 b 光叶苕子 Viciavillosa Rothvar 38.10±1.55 c 56.55±4.97 c 63.80±2.10 d 68.11±0.72 c 80.89±1.55 d 紫花苜蓿 Medicago sativa 53.93±1.26 b 67.04±3.54 b 71.27±3.60 c 75.46±2.98 b 86.69±0.34 c 黑麦草 Lolium multiflorum 56.82±4.18 b 66.83±1.95 b 77.85±0.29 c 87.92±0.62 a 95.48±0.53 a 2.3 氮释放特征
如表4可知，5种绿肥还田后，氮的释放在0～20 d较为迅速。腐解至20 d，5种绿肥的氮累计释放率均高于60%，其中，拉巴豆、紫云英、光叶苕子、紫花苜蓿、黑麦草的氮释放率分别达到87.63%、79.94%、69.04%、66.92%、66.99%，拉巴豆的氮释放率为全组最高，显著高其余几组（P＜0.05）。试验结束时，5种绿肥氮释放较为彻底，累计释放率均高于90%，5种绿肥氮累计释放率表现为拉巴豆＞黑麦草＞紫云英＞紫花苜蓿＞光叶苕子，分别达到97.64%、96.73%、96.48%、95.35%、94.63%。拉巴豆的氮累计释放率均为全组最高，光叶苕子为全组最低。
表 4 不同绿肥氮释放率特征Table 4. N releases of 5 green manures绿肥品种
Green manure varieties氮释放率 Release rates of N/% 第20 d
The 20th day第40 d
The 40th day第60 d
The 60th day第80 d
The 80th day第100 d
The 100th day拉巴豆 Dolichos lablab 87.63±0.42 a 89.79±0.35 a 92.89±0.43 a 95.12±0.24 a 97.64±0.12 a 紫云英 Astragalus sinicus 79.94±0.71 b 83.54±0.50 b 89.04±0.13 ab 92.50±0.11 ab 96.48±0.28 ab 光叶苕子 Viciavillosa Rothvar 69.04±1.80 c 80.01±1.31 bc 85.89±0.31 bc 90.60±0.21 bc 94.63±0.52 c 紫花苜蓿 Medicago sativa 66.92±1.79 c 78.40±2.30 c 83.92±2.92 c 88.55±1.96 c 95.35±0.20 c 黑麦草 Lolium multiflorum 66.98±2.28 c 78.15±1.69 c 85.80±0.26 bc 88.96±0.51 c 96.85±0.32 ab 2.4 磷释放特征
由表5可知，磷的释放也表现出前期快（0～20 d），中后期（20～100 d）慢的特征，但不同绿肥之间仍有较大差异。腐解20 d时，拉巴豆、紫云英、光叶苕子、紫花苜蓿、黑麦草的磷累计释放率分别为80.92%、49.90%、41.39%、28.60%、78.85%，此时拉巴豆的磷累计释放率最高，较磷累计释放率最低的紫花苜蓿高出182.93%。腐解至100 d时，5种绿肥磷累计释放率表现为黑麦草＞拉巴豆＞紫云英＞光叶苕子＞紫花苜蓿，分别达96.28%、95.70%、83.50%、66.85%、59.66%。可能与绿肥初始磷含量有关，拉巴豆和黑麦草在整个腐解期间的释放率都显著高于另外几种绿肥（P＜0.05）。
表 5 不同绿肥磷释放率Table 5. P releases of 5 green manures绿肥品种
Green manure varieties磷腐解率 Release rates of P/% 第20 d
The 20th day第40 d
The 40th day第60 d
The 60th day第80 d
The 80th day第100 d
The 100th day拉巴豆 Dolichos lablab 80.92±0.42 a 85.44±0.60 a 88.77±0.54 a 92.15±0.75 a 95.70±0.40 a 紫云英 Astragalus sinicus 49.90±6.26 b 49.80±4.55 b 52.71±2.54 b 68.89±1.07 c 83.50±1.77 b 光叶苕子 Viciavillosa Rothvar 41.39±4.35 b 45.71±1.63 b 46.07±3.51 bc 55.82±0.50 d 66.85±1.36 c 紫花苜蓿 Medicago sativa 28.60±2.04 c 33.43±2.22 c 40.14±2.29 c 49.40±2.58 e 59.66±0.67 d 黑麦草 Lolium multiflorum 78.85±2.73 a 79.04±2.18 a 83.72±1.15 a 86.17±1.00 b 96.28±0.38 a 2.5 钾释放特征
由表6所示，与C、N、P相比，钾的释放相对迅速并彻底。腐解至20 d时，拉巴豆、紫云英和光叶苕子的钾累计释放率均超过90%，分别为93.04%、96.72%、92.24%，紫花苜蓿和黑麦草分别达到87.09%、80.22%，该阶段紫云英的钾累计释放率显著高于其余几组；试验结束时，几种绿肥的钾释放十分彻底，均在94%以上，5种绿肥的钾累计释放率表现为拉巴豆＞光叶苕子＞紫云英＞黑麦草＞紫花苜蓿，分别为99.64%、99.43%、98.02%、97.73%、94.46%。由于拉巴豆和黑麦草的初始钾含量高于另外几种绿肥，因此在整个腐解期间，拉巴豆和黑麦草的钾累计释放率一直较高，腐解至100 d时，拉巴豆的钾累计释放率为全组最高，紫花苜蓿为全组最低。
表 6 不同绿肥钾释放率特征Table 6. K releases of 5 green manures绿肥品种
Green manure varieties钾腐解率 Release rates of K/% 第20 d
The 20th day第40 d
The 40th day第60 d
The 60th day第80 d
The 80th day第100 d
The 100th day拉巴豆 Dolichos lablab 93.04±0.28 b 98.09±0.13 a 98.31±0.12 a 99.36±0.06 a 99.64±0.01 a 紫云英 Astragalus sinicus 96.72±0.12 a 98.67±0.09 a 98.62±0.13 a 97.99±0.39 ab 98.02±0.14 b 光叶苕子 Viciavillosa Rothvar 92.24±0.14 b 95.76±0.36 b 97.06±0.04 b 98.79±0.70 ab 99.47±0.04 b 紫花苜蓿 Medicago sativa 87.09±0.46 c 88.27±0.84 c 90.10±0.45 d 93.97±0.88 c 94.46±0.13 c 黑麦草 Lolium multiflorum 80.22±2.39 d 94.40±0.50 b 93.46±0.28 c 97.38±0.20 b 97.73±0.24 b 2.6 碳氮比
由图3可知，除个别取样结果外，5种绿肥的碳氮比随腐解的进行大致呈现上升的趋势，拉巴豆、紫云英、光叶苕子、紫花苜蓿、黑麦草在初始时的碳氮比分别为16.46、16.05、16.32、18.27、20.19，试验结束时，其碳氮比分别为41.68、42.13、58.31、52.49、28.92。由此可看出，作为豆科绿肥，其氮含量相对较高，故其初始碳氮比均低于黑麦草，试验结束时却均高于黑麦草，说明豆科植物的氮素释放较禾本科更为彻底。
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图 3 不同绿肥碳氮比注：DL-拉巴豆、AS-紫云英、VR-光叶苕子、MS-紫花苜蓿、LM-黑麦草。Figure 3. C/N ratios of 5 green manuresNote: DL-D. lablab; AS-A. sinicus; VR-V. rothvar; MS-M. sativa; LM-L. multiflorum.3. 讨论与结论
绿肥的腐解变化情况是评价其在保持和改善土壤有机质作用、预测土壤有机质含量的动态变化等方面所必需的资料。根据绿肥不同腐解特点，确定其利用方式，可提高其利用率[11]。秸秆中水溶性物质、苯醇溶性物和粗蛋白物质分解最快，半纤维次之，纤维素再次之，木质素最难分解[12]，随着绿肥腐解时间的延长，绿肥中难分解的纤维素和木质素等组分比例不断升高，腐解速率随之变慢[13]。大量研究结果表明，绿肥在还田后表现出前期腐解快，后期腐解慢的规律[14-15]，本研究结果也与之吻合，薄晶晶等[16]研究发现，0～105 d是长武怀豆和黑麦草腐解的快速上升时期，105～238 d进入缓慢腐解阶段，238～281 d为中低速增长时期，试验结束时（281 d）长武怀豆和黑麦草的累计腐解率分别达82.64%和81.04%。本研究中，5种绿肥腐解至20 d的腐解率为35.52%～73.96%，腐解至100 d的腐解率达79.13%～90.25%，本研究试验时间更短，但绿肥腐解程度相当，这可能与试验地温度与降雨量有关，前者年均温度仅为9.1 ℃，而本研究试验地年均温度达到21.6 ℃，其中，本试验开展期间的平均气温达到27.68 ℃。气候条件是影响土壤微生物活性和物质腐解的重要因素，尤其以气温和降水最为关键[17]。前人研究表明[18-19]，在一定范围内温度（10～30 ℃）升高、土壤含水量（30%～105%最大田间持水量）加大，物质腐解加速。崔志强等研究表明[14]，北方温度和水分相对较低，限制了微生物对绿肥的分解，较少的降水限制了绿肥中可溶性物质随水淋失的数量。同时，本研究中，5种绿肥之间的腐解率亦有一定差异，拉巴豆的腐解率最高（90.25%），较腐解率最低的光叶苕子（79.13%）高出14.05%，这主要是由于不同种类的绿肥化学性质如组成（半纤维素、纤维素及木质素各自所占的比例）及其养分含量不同所导致的[5]。
绿肥翻压后通过腐解可提高土壤肥力，绿肥快速腐解期同时也是养分的快速释放阶段[20-21]，因此，绿肥养分的释放率与腐解速率同步，亦受气温和降雨的影响。赵娜等[15]在陕西长武县的研究发现，大豆、怀豆、绿豆3种绿肥还田287 d后，N、P、K的平均残留率还分别有50.0%、53.0%和4.1%，明显高于本研究的养分残留率，前者研究地属西北内陆暖温带半湿润大陆性气候，年均气温仅9.1 ℃。此外，绿肥营养元素与植物组织的结合程度决定了该元素释放率的大小。茎秆中钾不以化合态形式存在，而是以K+形态存在于细胞或组织内，很容易被水浸提释放出来，因此钾的释放非常迅速且彻底，大量研究发现钾累计释放率大于90%[8，22]。碳、氮、磷元素主要以难分解的有机态为主[15]，释放速率相对较慢。本研究结果表明，不同绿肥翻压还田后，不同养分累计释放率有明显差异。李帅等[10]的研究发现，不同地区的绿肥翻压还田后，碳、氮、磷、钾的累计释放率分别为81.39%～87.78%、73.61%～90.11%、80.71%～85.82%、99.55%～99.87，养分累计释放率表现为钾＞氮＞碳＞磷，钾素累计释放量较大且速度较快，本研究结果与之吻合，试验结束时，碳、氮、磷、钾的累计释放率分别为80.90%～95.48%、94.63%～97.64%、59.66%～96.28%、94.46%～99.64%，养分累计释放率亦表现为钾＞氮＞碳＞磷。潘福霞等[23]研究表明，绿肥翻压可为土壤提供速效养分，土壤无机氮的增加量为释放量的38.3%～69.0%，土壤速效磷的增加量仅为释放率的2.4%～6.0%，土壤速效钾增加量达绿肥释放率的80.8%～88.5%，钾的循环利用程度高，并且与化学钾肥具有相同的营养功效[24]，因此在翻压绿肥后可根据养分需求规律适当减少钾肥用量并延后施用。本研究未对翻压绿肥的土壤养分指标进行同步分析，5种绿肥释放的养分有多少转化为土壤养分以及在不同腐解阶段绿肥释放的养分有多大比例是可以作为吸收的形态存在，这些方面还需进一步探究，进而更科学地为柑橘地绿肥翻压提供依据。此外，在开展20 cm土埋还田的同时，本团队还开展了覆盖还田下5种绿肥的腐解特征研究，结果表明：腐解至100 d时，5种绿肥腐解率达44.68%～84.28%，低于本研究的土埋还田下的腐解率；覆盖还田下5种绿肥的碳累计释放率为53.43%～87.67%、氮累计释放率为71.56%～92.16%、磷累计释放率为60.66%～91.39%、钾累计释放率为91.22%～99.52%，碳和氮的累计释放率明显低于土埋还田，而磷和钾的累计释放率则较为接近。因此，在条件允许的情况下，建议采用土埋还田的方式对以上5种绿肥进行还田。覆盖还田的研究结果将在另一篇研究论文中进行发表。
作物碳氮比与作物腐解速率有一定关系，本研究中，5种绿肥初始碳氮比为16.46～20.19，试验结束时，其碳氮比上升为28.92～58.31，这与本研究中氮的养分释放率高于碳的释放率结果吻合。研究表明，碳氮比小的作物更易于腐解[25]，因此，本研究中碳氮比在腐解过程中呈现大致升高的趋势，而5种绿肥的腐解速率则随腐解进程呈下降趋势。
综上，5种绿肥的腐解及养分释放均表现为前期（0～20 d）快，中后期（20～100 d）慢的特征。腐解至20 d，腐解率达到35.52%～73.96%；腐解至100 d，其腐解率达79.13%～90.25%。腐解至20 d，5种绿肥的C、N、P、K的释放率分别为38.10%～78.59%、66.92%～87.63%、28.60%～80.92%、80.22%～96.72%；腐解至100 d时，5种绿肥的C、N、P、K的释放率分别为80.90%～95.48%、94.63%～97.64%、59.66%～96.28%、94.46%～99.64%。累计腐解率、C累计释放率、N累计释放率、P累计释放率、K累计释放率的最高分别为紫云英、黑麦草、拉巴豆、黑麦草、拉巴豆。在实际生产中，可根据柑橘地土壤养分情况选择最适宜的绿肥品种进行土埋翻压，具体还田量需结合柑橘地土壤背景值、柑橘对养分的需求以及配施的化肥进行综合分析。研究表明，在柑橘地中，5种绿肥的养分释放较为彻底，可以直接为柑橘提供养分，但腐解100 d后难以持续对土壤进行养分供应，需结合其他肥料为柑橘提供养分；在翻压绿肥后可适当根据柑橘养分需求规律适当减少钾肥用量并延后施用。今后还需增加土壤理化性状的分析检测，力求全面评价绿肥腐解的实际效益。
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图 1 金钱蒲7个不同组织
A：叶；B：花；C：花序；D：果序；E：果实；F：根；G茎。
Figure 1. Seven sampled organs of A. gramineus
A: leaves; B: flower; C: inflorescence; D: infructescence; E: fruit; F: root; G: stem.
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图 2 金钱蒲转录组unigenes的GO功能分类
Figure 2. GO function classification on unigenes of A. gramineus transcriptomes
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图 3 金钱蒲转录组基因的KEGG代谢通路分类
Figure 3. KEGG metabolic pathways of unigenes of A. gramineus transcriptomes
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图 4 金钱蒲类黄酮生物合成差异表达基因热图
A：苯丙素合成中的差异表达基因；B：类黄酮化合物生物合成中的差异表达基因；C：异黄酮代谢通路中的差异表达基因 ；D：黄酮和黄酮醇生物合成中的差异表达基因。 I：花序；II：花 ；III：叶 ；IV：茎；V：根；VI：果序；VII：果。高表达水平为红色，低表达水平为蓝色。
Figure 4. Heat map of DEGs in flavonoid biosynthesis of A. gramineus
A: DEGs in phenylpropanoid synthesis; B: DEGs in flavonoid synthesis; C: DEGs in isoflavone metabolic pathway；D: DEGs in biosynthesis of flavonoids and flavonols. I: inflorescence; II: flowers; III: leaves; IV: stems; V: roots; VI: infructescence; VII: fruits. High levels shown in red, and low in blue.
表 1 转录组过滤数据统计和参考基因组比对结果
Table 1 Statistically filtered transcriptome data vs. reference genomes
样品名称
Sample nameClean reads 数量
Number of clean reads/M高质量总碱基量
Total clean bases/GbQ30碱基百分比
Clean reads Q30/%GC含量
GC content%比对上参考基因组的
Clean reads 比例
Total mapping/%比对上参考基因组
唯一位置的
Clean reads 比例
Uniquely mapping/%花序 Inflorescence 42.74 6.41 93.68 49.55 86.50 50.81 花 Flower 42.76 6.41 93.56 50.32 86.26 49.96 叶 Leaf 42.69 6.40 94.05 49.67 82.74 47.88 茎 Stem 42.77 6.41 93.87 50.07 85.80 51.13 根 Root 42.97 6.45 93.55 47.81 87.49 50.39 果序 Infructescence 42.86 6.43 93.99 48.73 77.57 43.82 果 Fruit 39.91 5.98 93.31 50.30 83.38 46.93 
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表 2 金钱蒲转录组类黄酮生物合成途径中的酶基因
Table 2 Genes of enzymes inA. gramineus transcriptomes involved flavonoid synthesis pathways
代谢通路
Metabolic pathwayko编号
Ko ID酶
Enzyme缩写
Abbreviation差异基因数量
Number of DEGs苯丙素合成
Phenylpropanoid biosynthesisko00940 苯丙氨酸解氨酶
Phenylalanine ammonia-lyasePAL 6 咖啡酰辅酶A-O-甲基转移酶
Trans-cinnamate 4-monooxygenaseCCOMT 4 4-香豆酸-CoA 连接酶
4-coumarate--CoA ligase4CL 4 类黄酮化合物的生物合成
Flavonoid biosynthesisko00941 查尔酮异构酶
chalcone isomeraseCHI 11 查尔酮合成酶
Chalcone synthaseCHS 5 柚皮素3-双加氧酶
Naringenin 3-dioxygenaseF3H 4 二氢黄酮醇4-还原酶
Dihydroflavonol 4-reductaseDFR 1 花青素合成酶
Anthocyanidin synthaseANS 2 异黄酮代谢通路
Isoflavone metabolic pathwayko00943 2-羟基异黄酮脱水酶
2-hydroxyisoflavanone dehydrataseHIDH 6 4’-甲氧基异黄酮2’-羟化酶
4'-methoxyisoflavone 2'-hydroxylaseCYP81E 5 异黄酮7-O-葡萄糖苷-6’’-O-丙二酰基转移酶
isoflavone 7-O-glucoside-6’-O-malonyltransferaseIF7MAT 5 黄酮和黄酮醇的生物合成
Flavone and flavonol biosynthesisko00944 黄酮醇3-O-葡萄糖基转移酶
Flavonol 3-O-glucosyltransferaseF3G 1 黄酮醇-3-O-葡萄糖苷L-鼠李糖基转移酶
Flavonol-3-O-glucoside L-rhamnosyltransferaseF3GL 2 类黄酮3’-单加氧酶
Flavonoid 3'-monooxygenaseCYP75B1 6
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