DUS Traits and Classification of Antirrhinum majus L.
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摘要:目的 验证国际植物新品种保护联盟（UPOV）发布的金鱼草品种特异性、一致性和稳定性（DUS）测试指南中数量性状在我国的适应性，为建立金鱼草种质数量性状的科学评价方法、研制适应我国生态气候的金鱼草DUS测试指南奠定基础。方法 以UPOV发布的金鱼草新品种测试指南（TG/221/1）为标准，对40份金鱼草种质开展种植试验，对植株、叶、花等部位的13个主要数量性状进行数据采集，应用SPSS软件对采集数据进行变异程度、数量性状分级和主成分分析。结果 11个指南性状与2个非指南性状种间变异系数为16.9%～65.9%，种内变异系数为5.3%～12.2%，符合指南性状的选择标准；通过最小显著差法得到13个性状的表达状态分级，可作为金鱼草种质鉴定和DUS指南研制的参考；通过主成分分析法得到4个重要因子并新增了2个指南分组性状。结论 通过金鱼草种质数量性状数据分析，初步确定了各性状不同分级的数值范围，验证了UPOV指南在我国的适应性并对其中花序长度的分级数量进行优化，新增主茎长度和主茎一级分枝数量作为指南分组性状候选，为我国金鱼草指南的研制提供支持。Abstract:Objective Applicability of the guidelines recently released by the International Union for the Protection of New Varieties of Plants (UPOV) for quantitative DUS traits determination and classification of Antirrhinum majus L. in China was examined.Method An experimental planting of 40 germplasms of A. majus L. was conducted following the guidelines TG/221/1 issued by the UPOV. Thirteen DUS traits of the plants, leaves, flowers, and other parts were collected to statistically analyze their variations, classes, and principal components using SPSS for the application on the plant varieties in China.Result The variation coefficients that met the selection criteria set by the guidelines were 16.91%-65.87% among different species and 5.29%-12.18% within a same species on 11 traits, which were specified by the guidelines, as well as two additional ones identified by this study. The expressions of these 13 traits differentiated by least significant difference could all be applied to adequately identify the germplasms and for the DUS guideline development on A. majus L in China. In addition to the 4 factors listed in the UPOV guidelines, the principal component analysis suggested 2 new criteria for the plant classification.Conclusion The current UPOV guidelines provide quantitative DUS traits of A. majus L. germplasms for the species classification. A close examination with a specially designed experimentation revealed additional criteria on inflorescence length, plant height, and number of primary branches on the plant for establishing guidelines applicable in China.
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Keywords:
- Antirrhinum majus L. /
- DUS /
- quantitative trait /
- trait classification
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0. 引 言
【研究意义】沙门氏菌是最主要的病原微生物之一，由其引起的食物中毒占食物中毒病例的第1或第2位[1]。仅在2005—2011年，国外发生的19起蔬菜因病原微生物污染而引起的食源性疾病案例中，有11起是由沙门氏菌污染引起的，占比高达58%[2]。沙门氏菌也是我国食源性疾病的主要病原体，我国发生的细菌性食源性中毒事件中有80%左右由沙门氏菌引起[3]。国内已有多篇研究文献发现胡萝卜、香菜、香葱、生菜等新鲜蔬菜中存在沙门氏菌污染风险[4-6]。蔬菜的沙门氏菌污染可能发生在从农田到餐桌的每个环节[7-8]，近年来，随着对蔬菜供应链主要环节中沙门氏菌污染风险和来源的深入研究，发现沙门氏菌污染风险虽然贯穿供应链的每个主要环节，但仍以栽培环节，特别是蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染风险最大，也是沙门氏菌检测和风险控制的重点[8-11]。【前人研究进展】目前环介导等温扩增技术（loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP）已经运用到多种食品中沙门氏菌的快速检测中，因其具有快速、灵敏的优点备受关注。Hara-Kudo等[12]采用环介导等温扩增技术，可以检出沙门氏菌最低含量为2.2 CFU·管−1，并在1 h以内获得检测结果；张宏伟等[13]采用环介导等温扩增技术检测食品样品中沙门氏菌最低检出限为1.5 CFU·hg−1；王瑾等[14]采用实时荧光环介导等温扩增技术，可检测沙门氏菌最低含量为6 CFU·管−1，人工污染鸡肉的检出限为450 CFU·g−1，全程用时约7 h；Wu等[15]利用实时荧光定量环介导等温扩增技术对生菜中沙门氏菌进行检测，灵敏度达到了4 CFU.g−1，而检测过程仅需3 h左右；庞心怡等[16]采用环介导等温扩增技术快速检测肉类中沙门氏菌，对人工污染的沙门氏菌肉样检测灵敏度达98 CFU·mL−1，而全程仅用时15 h。【本研究切入点】目前对沙门氏菌检测多采用国标《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016）方法，但该方法需要对待检样品进行预增菌、选择性分离和生化试验鉴定，操作繁琐，耗时费力，仅筛选出沙门氏菌可疑菌落就需要3～4 d，后续的生化试验还需2～3 d[17]，满足不了沙门氏菌快速检测的要求。而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）最早在2000年由日本科学家Notomi[18]发明，该技术可在恒温条件下（60～65 ℃）1h内完成核酸的高倍扩增，灵敏度比PCR技术高2～7个数量级，反应产物不仅可以通过琼脂糖电泳、浊度仪和定量PCR进行检测，也可以通过钙黄绿素、羟基萘酚蓝、SYBR Green I显色后观察[19, 20]，目前已成功应用于沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血弧菌、志贺氏菌等多种病原微生物的检测[14, 21-23]，但国内尚未见有关蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测方法的研究报道。【拟解决的关键问题】本研究以沙门氏菌特有侵袭蛋白A （invA）基因序列设计可视化LAMP检测引物，建立基于钙黄绿素显色的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌可视化快速检测方法，以期为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的防控提供技术支撑。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 蔬菜栽培土壤
供试蔬菜栽培土壤样品集自闽清县东桥镇绿辉蔬菜种植农场，样品按S型多点采集土壤表层（0～20 cm）的混合样，采样后立即用冰袋包装新鲜样品带回实验室，人工除去植物残体、根系和石头，过2 mm筛后测定土壤理化指标。供试蔬菜栽培土壤具体理化指标如下：土壤类型为黄红壤，0～20 cm土层pH值5.31，有机质含量16.61 g·kg−1，碱解氮含量126.54 mg·kg−1，速效磷含量18.25 mg·kg−1，速效钾含量113.79 mg·kg−1。
1.1.2 材料与试剂
胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）（北京陆桥技术有限责任公司），DL2000 Marker、dNTP（Takara公司），Bst 2.0 DNA polymerase（美国NEB公司），琼脂糖（西班牙Biowest），Betaine、Tween-20（上海生工），MnCl2、NaCl、Calcein（阿拉丁公司），FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒（美国MP Bio公司），无菌均质袋（北京陆桥）。
1.1.3 仪器与设备
PCR仪（BIO-RADTM S1000），凝胶成像系统（BIO-RADTM Gel Doc XR+），FastPrepTM FP120核酸提取仪（美国MP Bio公司），easyMixTM拍击式均质器（法国AES Chemunex公司），电泳仪及电源（北京六一仪器厂），恒温水浴锅（上海一恒），恒温培养箱（上海一恒）。
1.1.4 菌株
表1为供试7种微生物菌株，分别来自中国工业微生物菌种保藏管理中心（CICC）、中国普通微生物菌种保藏管理中心（CGMCC）和美国典型培养物保存中心（ATCC）。
表 1 供试菌株Table 1. Bacteria used for testing菌株名称 Strains name 拉丁学名 Scientific name of strains 菌株编号 Strains number 菌株来源 Source of strains 鼠伤寒沙门氏菌 Salmonella typhimurium 1.1174 CGMCC 金黄色葡萄球菌 Staphylococcus aureus 25923 ATCC 大肠埃希氏菌 Escherichia coli 25922 ATCC 产气肠杆菌 Enterobacter aerogenes 1.0876 CGMCC 大肠埃希氏菌O157:H7 Escherichia coli O157:H7 10907 CICC 单核细胞增生李斯特氏菌 Listeria monocytogenes 1.9136 CGMCC 英诺克李斯特氏菌 Listeria innocua 1.7730 CGMCC 1.2 试验方法
1.2.1 引物设计
根据Genbank登录的沙门氏菌特有侵袭蛋白A （invasion protein A，invA）基因序列（Accession: M90846.1），在网站（http://primerexplorer.jp/e/）上使用Primer Explorer 5.0在线软件设计3对LAMP引物用于沙门氏菌检测，包括1对外引物（F3/B3）、1对内引物（FIP/BIP）和1对环引物（Loop F/Loop B）。检测引物交由上海生工合成。具体检测引物序列见表2。
表 2 环介导等温扩增引物Table 2. Primers of LAMP引物
Primer序列
SequenceFIP 5′-GCGCGGCATCCGCATCAATATGCCCGGTAAACA
GATGAGT-3′BIP 5′-GAACGGCGAAGCGTACTGGACATCGCACCGTC
AAAGGAA-3′F3 5′-CGGCCCGATTTTCTCTGG-3′ B3 5′-CGGCAATAGCGTCACCTT-3′ Loop F 5′-GGCCTTCAAATCGGCATCAAT-3′ Loop B 5′-AAGGGAAAGCCAGCTTTACG-3′ 1.2.2 沙门氏菌培养、计数及基因组DNA提取
将TSA平板内活化的沙门氏菌，挑取单个菌落接种于5 mL TSB液体培养基中，37 ℃、180 r·min−1过夜培养15～18 h，以1∶100比例转接于100 mL TSB液体培养基，37 ℃、180 r·min−1培养3 h左右至细菌对数生长期（OD600≈0.55）。菌液使用生理盐水按10倍梯度依次稀释后，分别取100 μL不同浓度稀释液涂于TSA平板上，37 ℃倒置培养18～24 h计数。
沙门氏菌DNA模板采用热裂解法提取，取1 mL沙门氏菌菌液在台式离心机上10 000 r·min−1离心5 min，弃上清液，沉淀重悬于0.5 mL生理盐水，加入等体积2×TZ裂解液，于99.5 ℃加热10 min，冰上冷却2 min后，在10 000 r·min−1离心5 min，取上清液即为沙门氏菌DNA模板，−20 ℃保存备用。
1.2.3 LAMP反应体系和反应条件优化
分别对LAMP反应体系中dNTPs浓度、MgSO4浓度以及Betaine浓度，反应条件中反应温度和反应时间进行优化，其中dNTPs终浓度分别为0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 mmol·L−1，MgSO4终浓度分别为2、4、6、8、10、12 mmol·L−1，Betaine终浓度分别为0.6、0.8、1.2、1.4、1.6 mol·L−1；反应温度分别设置58、59、60、61、62、63、64、65 ℃，反应时间分别为30、40、50、60、70、80、90 min。选用50 μmol·L−1 Calcein-500 μmol·L−1 MnCl2作为指示剂[24]，阳性反应显绿色，阴性反应显橘黄色，每个因子设置3个重复，以确定最佳反应体系和反应条件。
1.2.4 LAMP反应特异性检测
分别以鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、产气肠杆菌、大肠埃希氏菌O157:H7、单核细胞增生李斯特氏菌和英诺克李斯特氏菌菌株为材料，以热裂解法制备各菌株DNA，验证所建立LAMP检测方法的特异性。取1 μL各菌株的DNA作为模板，采取已优化的反应体系和条件进行特异性分析，反应结束后，以管内颜色变化来判断阴阳性，阳性为绿色，阴性为橘黄色；或将扩增产物在1.5%琼脂糖电泳上检测，阳性反应可观察到特征性梯形带，阴性反应则没有出现扩增条带。
1.2.5 LAMP反应灵敏度检测
以10倍递减将沙门氏菌浓度稀释为7×108～7×102 CFU·mL−1 7个梯度，以热裂解法提取沙门氏菌DNA，然后取1 μL不同含量的沙门氏菌DNA作为模板，对LAMP反应灵敏度进行检测。结果直接肉眼观察，阳性反应显绿色，阴性反应显橘黄色，同时在2%琼脂糖凝胶电泳上检测。
1.2.6 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测
取10 g经国标方法检测沙门氏菌阴性的蔬菜栽培土壤样品，置于装有90 mL蛋白胨缓冲水（BPW）的无菌均质袋中，分别加入灭菌生理盐水稀释至适宜含量的沙门氏菌0.5 mL，以制备含沙门氏菌含量为0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105 CFU·g−1的人工污染样品，将均质袋放置在拍击式均质器中拍打1 min，置37 ℃的恒温培养箱中预增菌4 h。预增菌后重新混匀土壤样品，吸取1 mL混匀土壤样品至FastDNA® Spin Kit for Soil试剂盒中的土壤裂解管中，12 000 r·min−1离心3 min，吸弃上清，然后在FastPrepTM FP120核酸提取仪上提取土壤微生物总DNA，100 μL溶解土壤微生物总DNA，取1 μL作为LAMP反应扩增模板。
1.2.7 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测
利用所建立的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测方法对采自全省不同蔬菜产区的41份土壤样品进行沙门氏菌检测，同时采用国标方法（GB 4789.4—2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》）进行检测分析。
2. 结果与分析
2.1 LAMP检测方法的建立
通过反应温度和时间进行优化，确定LAMP最适反应温度为65 ℃，反应时间为1 h。优化后蔬菜栽培土壤中沙门氏菌LAMP检测最佳反应体系25 μL包括：2.5 μL 10×Isothermal Amplification Buffer，1.4 mmol·L−1 dNTPs，0.2 μmol·L−1 F3-B3，1.6 μmol·L−1 FIP-BIP，0.4 μmol·L−1 Loop F～Loop B，0.8 mol·L−1 Betaine，6.0 mmol·L−1 MgSO4，8 U Bst 2.0 DNA polymerase，50 μmol·L−1 Calcein和500 μmol·L−1 MnCl2，DNA模板1 μl，灭菌超纯水补足25 μL体积。优化的LAMP反应效果如图1所示。
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图 1 LAMP体系检测沙门氏菌注：A: LAMP产物琼脂糖电泳检测结果; B: LAMP产物钙黄绿素显色结果M: DL2 000 DNA Marker, 1: 鼠伤寒沙门氏菌, 2: 阴性对照Figure 1. Detection of Salmonella using optimized LAMP assayNote: A: LAMP products shown on 2.0% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: S. typhimurium; 2: Negative control.2.2 特异性检测结果
分别以鼠伤寒沙门氏菌菌株和非沙门氏菌菌株的DNA为模板进行LAMP反应特异性分析，结果表明，在Calcein-MnCl2指示剂的作用下，65 ℃温育1 h后，鼠伤寒沙门氏菌LAMP反应产物显绿色，而供试6个非沙门氏菌菌株的LAMP反应产物均显橘黄色（图2-A）。进一步取2 μL扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，结果除鼠伤寒沙门氏菌LAMP扩增产物出现梯形条带外，其他6个菌株均未出现任何条带（图2-B）。结果表明，本研究所建立的可视化LAMP检测方法对沙门氏菌具有良好的特异性。
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图 2 LAMP方法检测沙门氏菌的特异性注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果，B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2：鼠伤寒沙门氏菌，3：金黄色葡萄球菌，4：大肠埃希氏菌，5：产气肠杆菌，6：大肠埃希氏菌O157:H7，7：单核细胞增生李斯特氏菌，8：英诺克李斯特氏菌Figure 2. Specificity of LAMP assay in detecting SalmonellaNote: A: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2: S. typhimurium; 3: Staphylococcus aureus; 4: Escherichia coli; 5: Enterobacter aerogenes; 6: E. coli O157:H7; 7: Listeria monocytogenes; 8: Listeria innocua.2.3 灵敏度检测结果
分别以7个不同含量沙门氏菌DNA为模板进行扩增来验证LAMP体系的灵敏度，琼脂糖凝胶电泳检测结果显示，在每管25 μL LAMP反应体系中沙门氏菌DNA含量为7×105～7 CFU时均可以出现LAMP产物特有的梯形条带（图3-A），而当沙门氏菌DNA含量为7 ×10−1 CFU时没有出现任何条带。可视化显色结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致（图3-B），说明LAMP反应体系可以检测到7 CFU沙门氏菌DNA。
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图 3 LAMP方法检测沙门氏菌的灵敏度注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果，B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2～8：每管反应体系中分别含有7×105 CFU、7×104 CFU、7×103 CFU、7×102 CFU、7×101 CFU、7 CFU、7 ×10−1 CFUFigure 3. Sensitivity of LAMP assay in detecting SalmonellaNote: A: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2-8: Amplified products using DNA at concentration of 7×105 CFU, 7×104 CFU, 7×103 CFU, 7×102 CFU, 7×101 CFU, 7 CFU, and 0.7 CFU, respectively, in LAMP reaction tube.2.4 人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品检测结果
人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品经37 ℃预增菌4 h后，提取土壤微生物总DNA进行扩增检测。分别设置0、5×101、4×102、1×103、4×103、1×104、4×104、1×105 CFU·g−1共7组不同梯度进行LAMP扩增检测。琼脂糖电泳结果显示，当LAMP反应体系中沙门氏菌含量为4×102～1×105 CFU·g−1时均可以出现LAMP产物特有的梯形条带（图4-A），而当沙门氏菌含量为5×101 CFU·g−1时没有出现任何条带。可视化显色结果与琼脂糖凝胶电泳结果一致（图4-B），说明本LAMP反应体系检测蔬菜栽培土壤样品灵敏度为4×102 CFU·g−1。
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图 4 LAMP方法检测人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品注：A：LAMP产物琼脂糖电泳检测结果；B：LAMP产物钙黄绿素显色结果；M：DL2 000 DNA Marker，1：阴性对照，2~8：不同含量人工污染沙门氏菌的栽培土壤样品扩增产物（0~1×105 CFU·g−1）Figure 4. LAMP assay for detecting artificially inoculated Salmonella in soil samplesNote: a: LAMP products shown on 2% agarose gel electrophoresis; B: LAMP products after calcein staining; M: DL2 000 DNA marker; 1: Negative control; 2-8: Amplified products on different concentrations of Salmonella in artificially inoculated soil samples (0-1×105 CFU·g−1).2.5 蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的检测结果
应用上述LAMP检测方法和国标检测法，同时对全省不同蔬菜产区的41份土壤样品进行沙门氏菌检测，结果见表3。2种方法都检测到2份沙门氏菌阳性样品和39份沙门氏菌阴性样品，LAMP检测方法与国标方法（GB 4789.4—2016《食品微生物学检验 沙门氏菌检验》）检测结果一致，而LAMP检测将国标方法检测时间由5～7 d缩短至8 h内，大幅减轻了检测强度，提高了检测效率。
表 3 2种方法对比检测蔬菜栽培土壤沙门氏菌污染结果Table 3. Salmonella detection in soil by two different methods方法
Method土壤样品
Soil samples阳性
Positive阴性
Negative国标方法 National standard method 41 2 39 LAMP方法 LAMP method 41 2 39 3. 讨论与结论
快速检测技术是监测和防控沙门氏菌等食源性疾病最重要的环节之一，而衡量快速检测技术性能最关键指标是检测用时与灵敏度。目前采用的国标检测方法《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》（GB 4789.4—2016），需要对待检样品进行预增菌、选择性分离和生化试验鉴定等步骤，操作繁琐；最终拿到鉴定结果需要5～7d，耗时费力，难以满足沙门氏菌快速检测的要求。PCR方法虽然具有检测时间短、灵敏度高的特点，但需要专门的检测仪器（普通PCR仪或荧光定量PCR仪)，而环介导等温扩增技术（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）由于具有更高的灵敏度和视觉判断性的优点，且检测过程不需要专门的检测仪器，弥补了国标检测方法和PCR方法检测沙门氏菌的不足。
沙门氏菌侵袭蛋白（invasion protein）基因簇是沙门氏菌编码吸附和侵袭上皮细胞表面蛋白的基因，与沙门氏菌对肠道上皮细胞的侵袭有关，包括invA、invB、invC、invD、invE等基因，其中以invA基因应用最为广泛，目前根据invA基因序列设计特异性引物已成功应用于乳品、肉类、蔬菜等食品中沙门氏菌的检测[14, 15, 21]。本研究根据沙门氏菌侵袭蛋白A （invA）基因序列设计特异性LAMP引物，建立了一种基于颜色判定的简单、快速和灵敏的蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的快速检测方法，对沙门氏菌纯菌检测灵敏度可达7 CFU/25 μL，人工污染的栽培土壤样品检测灵敏度为4×102 CFU·g−1。采用该LAMP方法与国标检测方法对比检测蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染，结果表明LAMP检测结果与国标方法检测结果一致，说明该方法能成功应用于蔬菜栽培土壤中沙门氏菌的快速检测，可为蔬菜栽培土壤中沙门氏菌污染的及时防控提供技术支撑。
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表 1 40份金鱼草种质资源
Table 1 40 Germplasms of A. majus L.
序号
Number种质资源
Germplasm resource来源地
Origin序号
Number种质资源
Germplasm resource来源地
Origin1 阿波罗-象牙白 Apollo-Ivory 美国 America 21 马里兰-贝壳粉色 Maryland-Shell pink 美国 America 2 阿波罗-棕红色 Apollo-Brownish red 美国 America 22 马里兰-火焰 Maryland-Flames 美国 America 3 波托马克-白色 Potomac-White 美国 America 23 马里兰-深紫色 Maryland-Dark purple 美国 America 4 彩虹糖-橙色 Rainbow sugar-Orange 日本 Japan 24 美人鱼-品红 Mermaid-Magenta 美国 America 5 彩虹糖-红色 Rainbow sugar-Red 日本 Japan 25 梦得高-橙黄双色 Montego-Orange yellow 美国 America 6 传奇-黄色 Legend-Yellow 日本 Japan 26 梦得高-红晕 Montego-Flush 美国 America 7 号角-橘红色 Horn-Orange red 美国 America 27 摩纳哥-紫罗兰 Monaco-Violet 美国 America 8 花雨-丁香紫色 Flower rain-Lilac purple 日本 Japan 28 神箭-红黄双色 Divine arrow-Red yellow 美国 America 9 花雨-酒红双色 Flower rain-Wine red 日本 Japan 29 诗韵-猩红橙色 Poetic rhyme-Scarlet orange 日本 Japan 10 花雨-珊瑚双色 Flower rain-Coral 日本 Japan 30 双子星-古铜色 Gemini-Bronze 荷兰 Holland 11 火箭-红色 Rocket-Red 美国 America 31 跳跳糖-深紫色 Pop rocks-Dark purple 日本 Japan 12 火箭-渐变玫瑰红色 Rocket-Gradient rose red 美国 America 32 童音-黄色 Child voice-Yellow 荷兰 Holland 13 火箭-金黄色 Rocket-Gold 美国 America 33 香蒂尔-天鹅绒 Chantil-Velvet 日本 Japan 14 火箭-柠檬黄色 Rocket-Lemon yellow 美国 America 34 早生诗韵-粉红色 Early poetry rhyme-Pink 日本 Japan 15 火箭-青铜色 Rocket-Bronze 美国 America 35 至日-橙黄三色 Solstice-Orange three colors 美国 America 16 锦绣-酒红色 Splendid-Wine red 美国 America 36 重瓣双子星-黄色渐变 Double gemini-Yellow gradient 荷兰 Holland 17 凉爽-鲑红色 Cool-Salmon red 美国 America 37 重瓣双子星-紫色 Double Gemini Purple 荷兰 Holland 18 玲珑-桃色 Exquisite-Peach 美国 America 38 紫花卷 Purple flower roll 美国 America 19 玲珑-霞光 Exquisite-Sunglow 美国 America 39 自由经典-淡紫色 Libery-lavender 美国 America 20 玲珑-紫罗兰 Exquisite-Violet 美国 America 40 自由经典-猩红 Libery-Scarlet 美国 America 
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表 2 金鱼草数量性状及其测量方法
Table 2 Quantitative DUS traits and determinations for A. majus L.
性状代码
Trait Number性状
Traits单位
Unit测量方法
Measurement methodsT1 植株高度*
Height of plant*cm 测量地面至植株顶部的高度
Measure the height from the ground to the top of the plantT2 植株株幅*
Width of plant*cm 测量植株最大宽度
Measure the maximum width of the plantT3 主茎长度
Length of main stemcm 测量主茎基部至花序初始位置长度
Measure the length from the base of main stem to the initial position of inflorescenceT4 主茎直径
Diameter of main stemmm 测量植株中部位置主茎粗度
Measure the main stem thickness at the middle of the plantT5 主茎一级分枝数量
Number of primary branches on main stem个 测量主茎上一级分支数量
Measure the number of primary branches on the main stemT6 叶长度
Length of leafcm 测量主茎中部最大叶片长度
Measure the length of the maximum leaf in the middle of main stemT7 叶宽度
Width of leafcm 测量主茎中部最大叶片宽度
Measure the width of the maximum leaf in the middle of main stemT8 花序长度
Length of inflorescencecm 测量花序第一朵花至花序顶端长度
Measure the length from the first flower of inflorescence to the topT9 花长度
Length of flowercm 测量自然状态下花朵长度
Measure the length of flowers in natural stateT10 花宽度
Width of Flowercm 测量自然状态下花朵宽度
Measure the width of flowers in natural stateT11 花冠筒长度
Length of corolla tubecm 测量花冠筒底部至裂片分离处的长度
Measure the length from the bottom of corolla tube to the separation of lobesT12 上唇宽度
width of Upper lipcm 花朵上唇平展的宽度
The width of the flower's upper lipT13 下唇中尖瓣宽度
Width of middle cusp lobe on lower lipcm 花朵下唇中尖瓣平展的宽度
The spreading width of the middle cusp of the lower lip标注*的性状为本研究新增的非指南性状。
* indicates new trait not included in current UPOV guidelines.
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表 3 金鱼草种质资源数量性状变异情况
Table 3 Variation on quantitative DUS traits of A. majus L. germplasms
性状
Trait最大值
Maximum最小值
Minimum平均值
Average极差
Range品种内变异系数
Coefficient of variation
within varieties/%品种间变异系数
Coefficient of variation
among varieties/%T1 124.8 16.8 54 108 7.3 54.9 T2 64.6 25.4 39.7 39.2 8.7 21.3 T3 113.0 11.1 42.7 101.9 9.1 65.9 T4 11.3 2.0 4.2 9.3 7.4 59.1 T5 41.7 7.8 16.8 33.9 9.3 45.5 T6 13.2 5.0 8.0 8.2 7.5 24.3 T7 4.1 1.1 2.4 3.0 10.2 28.9 T8 18.8 6.7 11.7 12.1 12.0 28.6 T9 4.2 1.9 3.1 2.3 7.7 19.4 T10 4.1 1.8 2.8 2.3 9.4 18.4 T11 3.2 1.4 1.7 1.8 5.3 16.9 T12 4.8 2.0 3.3 2.8 7.0 22.6 T13 1.7 0.7 1.1 1.0 9.2 21.9
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表 4 金鱼草数量性状相关性分析
Table 4 Correlation coefficients of quantitative DUS traits of A. majus L.
性状
TraitT1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12 T13 T1 1 T2 0.605** 1 T3 0.993** 0.601** 1 T4 0.635** 0.263 0.656** 1 T5 0.246 0.182 0.218 0.156 1 T6 0.549** 0.314 0.562** 0.852** 0.289 1 T7 0.573** 0.199 0.587** 0.732** 0.310 0.807** 1 T8 0.469** 0.376* 0.376* 0.019 0.307 0.083 0.118 1 T9 −0.253 −0.315 −0.251 0.250 0.119 0.414** 0.356* −0.209 1 T10 0.198 0.239 0.191 0.465** 0.198 0.645** 0.479** 0.014 0.637** 1 T11 0.040 0.156 0.012 0.161 0.198 0.340* 0.198 0.167 0.404** 0.590** 1 T12 −0.159 −0.245 −0.145 0.329* 0.193 0.500** 0.483** −0.263 0.939** 0.714** 0.346* 1 T13 −0.109 −0.088 −0.101 0.385* 0.126 0.555** 0.462** −0.216 0.847** 0.726** 0.487** 0.878** 1 *. 表示在P值小于 0.05 水平，显著相关性；**. 表示在P值小于 0.01水平，极显著相关。
* Indicates significant correlation at P＜0.05; * * Indicates highly significant correlation at P＜0.01.
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表 5 金鱼草种质资源数量性状表达状态分级
Table 5 Classification on expressions of quantitative DUS traits of A. majus L. germplasms
性状
Trait性状表达状态分级及范围
Expression status grading and range of traits1 2 3 4 5 6 7 8 9 T1 (0，20] (20，30] (30，40] (40，50] (50，60] (60，70] (70，80] (80，90] (90，+∞) T2 (0，26] (26，30] (30，34] (34，38] (38，42] (42，46] (46，50] (54，58] (58，+∞) T3 (0，15] (15，25] (25，35] (35，45] (45，55] (55，65] (65，75] (75，85] (85，+∞) T4 (0，2] (2，3] (3，4] (4，5] (5，6] (6，7] (7，8] (8，9] (9，+∞) T5 (0，4] (4，8] (8，12] (12，16] (16，20] (20，24] (24，28] (28，32] (32，+∞) T6 (0，3.5] (3.5，5] (5，6.5] (6.5，8] (8，9.5] (9.5，11] (11，12.5] (12.5，14] (14，+∞) T7 (0，1] (1，1.5] (1.5，2] (2，2.5] (2.5，3] (3，3.5] (3.5，4] (4，4.5] (4.5，+∞) T8 (0，5] (5，8] (8，11] (11，14] (14，17] (17，20] (20，+∞) T9 (0，1.5] (1.5，2] (2，2.5] (2.5，3] (3，3.5] (3.5，4] (4，4.5] (4.5，5] (5，+∞) T10 (0，1] (1，1.5] (1.5，2] (2，2.5] (2.5，3] (3，3.5] (3.5，4] (4，4.5] (4.5，+∞) T11 (0，1.1] (1.1，1.3] (1.3，1.5] (1.5，1.7] (1.7，1.9] (1.9，2.1] (2.1，2.3] (2.3，2.5] (2.5，+∞) T12 (0，2] (2，2.5] (2.5，3] (3，3.5] (3.5，4] (4，4.5] (4.5，5] (5，5.5] (5.5，+∞) T13 (0，0.4] (0.4，0.6] (0.6，0.8] (0.8，1] (1，1.2] (1.2，1.4] (1.4，1.6] (1.6，1.8] (1.8，+∞)
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表 6 金鱼草种质数量性状总方差结果
Table 6 Total variance on quantitative DUS traits of A. majus L. germplasms
成分
Component特征根
Characteristic-root贡献率
Contribution
rate/%累积贡献率
Cumulative
contribution rate/%1 5.46 41.98 41.98 2 3.74 28.76 70.74 3 0.99 7.62 78.36 4 0.84 6.45 84.80
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表 7 金鱼草种质数量性状成分矩阵
Table 7 Component matrix of quantitative DUS traits of A. majus L. germplasms
性状代码
Trait number成分 Component 1 2 3 4 T6 0.92 0.14 −0.15 −0.07 T10 0.86 −0.17 0.23 −0.15 T7 0.84 0.15 −0.26 0.06 T4 0.83 0.17 −0.32 −0.04 T13 0.79 −0.51 0.03 −0.13 T12 0.73 −0.61 −0.06 0.09 T9 0.67 −0.66 0.05 0.10 T1 0.38 0.87 −0.04 −0.02 T3 0.39 0.86 −0.11 −0.06 T2 0.27 0.71 0.09 −0.45 T8 0.11 0.65 0.46 0.23 T11 0.56 −0.10 0.71 −0.06 T5 0.44 0.37 0.00 0.71
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期刊类型引用(1)
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