Study on process optimization and antibacterial activity of Litsea cubeba essential oil
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摘要:目的 优化山苍子精油提取工艺，探究精油抑菌活性，为山苍子精油的加工及应用提供参考数据。方法 通过响应面法优化山苍子精油提取过程中NaCl体积分数、液料比、蒸馏时间的工艺条件。采用生长速率法探究山苍子精油对瓜果腐霉菌的抑制作用，通过测定精油对菌丝干重、丙二醛含量、还原糖含量、过氧化氢酶、过氧化物酶和超氧化物歧化酶等保护酶活性的影响，探讨了其抑制植物病原真菌的生理生化作用。结果 确定了最佳工艺条件：NaCl体积分数为2.39%，液料比[V（mL）∶m（g）]为4.8∶1，蒸馏时间4.94 h。在该条件下，精油得率可达4.43%。山苍子精油对瓜果腐霉具有较好抑制效果，EC50值为224.4 μg· mL−1。瓜果腐霉菌经山苍子精油处理后，菌丝干重减少，细胞膜通透性增加，菌体内还原糖含量减少，保护酶含量增多。结论 经响应面优化后的工艺稳定可行，与其他的各类提取方法相比成本低消耗低与得率高。山苍子精油可以通过抑制菌丝生长、破坏细胞膜结构以及降低菌丝体保护酶活性等发挥抑菌活性。Abstract:Objective This study aimed to optimize the extraction process of Litsea cubeba essential oil and investigate its antibacterial activity and mechanism of action against plant pathogenic fungi.Methods Response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of Litsea cubeba essential oil, including NaCl volume fraction, liquid-solid ratio, and distillation time. The inhibitory effect of Litsea cubeba essential oil on Pythium aphanidermatum was evaluated by the growth rate method, while its physiological and biochemical effects were assessed by measuring fungal mycelium dry weight, MDA content, reducing sugar content, and protective enzyme activities such as catalase, peroxidase, and superoxide dismutase.Results The optimal extraction conditions for Litsea cubeba essential oil were determined as NaCl volume fraction of 2.39%, liquid-solid ratio of 4.8:1 (mL·g−1), and distillation time of 4.94 hours, resulting in an extraction yield of 4.43%. Litsea cubeba essential oil exhibited a potent inhibitory effect on Pythium aphanidermatum, with an EC50 value of 224.4 μg·mL−1. Treatment with Litsea cubeba essential oil reduced fungal mycelium dry weight, increased cell membrane permeability, decreased reducing sugar content in the fungal body, and increased protective enzyme activities.Conclusion The optimized extraction process was stable, feasible, and cost-effective compared to other methods. Litsea cubeba essential oil exerted antibacterial activity by inhibiting mycelial growth, disrupting cell membrane structure, and decreasing protective enzyme activities in the mycelia.
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0. 引言
【研究意义】山苍子[Litsea cubeba (Lour) Pers]为樟科（Lauraceae）木姜子属（Litsea）植物，又称山鸡椒、木姜子、山胡椒、香桂等，是工业制备柠檬醛的主要原料。优化山苍子精油提取工艺，深入研究其抑制植物病原真菌活性，可为山苍子精油生产和利用提供依据。【前人研究进展】已有学者报道采用超声波、微波、生物酶等辅助水蒸气蒸馏提取以及超临界流体萃取法等提取山苍子精油，且以超声波辅助水蒸气蒸馏法最为适用 [1] 。文献研究也发现，无机盐可显著提高果皮内外的渗透压差使精油更容易渗出而被蒸出[2]；课题组前期首次发现山苍子精油对瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）、苹果黑腐皮壳病菌（ Valsa mali ）等植物病原菌有显著抑制作用。【本研究切入点】现有水蒸气蒸馏工艺得率较低、不稳定，其提取工艺还有待优化；山苍子精油具有显著抑菌活性，但对植物病原真菌活性研究较少，对其生理生化影响鲜有报道。【拟解决的关键问题】采用响应面法优化山苍子精油提取工艺，通过“超声波+无机盐”协同水蒸气蒸馏提取山苍子精油，提升精油得率。同时开展精油抑制植物病原真菌活性研究，以瓜果腐霉菌为代表，探索山苍子精油对病原真菌生理生化的影响，以期为植物源抑菌剂的开发和山苍子精油利用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料及试剂
1.1.1 试验材料
山苍子来源于福建澄新生物科技有限公司，经福建农林大学林学院邹小兴副教授鉴定为樟科木姜子属植物山苍子。瓜果腐霉菌、苹果黑腐皮壳病菌、番茄灰霉病菌（Botrytis cinerea）、禾谷镰刀病菌（Fusarium graminearum）、燕麦镰孢菌（FusaHum graminearum ）和西瓜尖孢镰孢菌（Fusarium oxysporumf）等6种植物病原菌菌种由福建农林大学生物农药与化学生物学重点实验室提供。
1.1.2 主要试剂及设备
工业酒精（福州艾市佳科技有限公司）；氯化钠（国药集团化学试剂有限公司）；甲醇、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯（国药集团化学试剂有限公司）；马铃薯品种为克新1号；葡萄糖、琼脂粉（上海神尚科技公司）；纯水、超纯水由实验室自制。
SW-CJ-2FD超净工作台（苏州净化设备有限公司）；PRX-250B智能人工气候箱（宁波赛福实验仪器有限公司）；DGL-50B立式高压灭菌锅（江苏登冠医疗器械有限公司）；HH-2数显恒温水浴锅（常州越新仪器制造有限公司）；IKA-RV8V旋转蒸发仪（德国IKA集团）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市庆泰科技有限公司）；FA-1004电子天平（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）。
1.2 试验方法
1.2.1 精油得率测定
称取50 g的山苍子果实，加入500 mL蒸馏烧瓶中，连接挥发油测定器及球形冷凝管，按照所设定的超声时间、NaCl体积分数、蒸馏时间、液料比等4个因素进行超声强化提取，提取完毕后将提取出的精油转移至西林瓶中称重，计算得率，山苍子精油得率计算公式如下。
Y/% =(m/M)×100 式中：Y为山苍子精油得率；m为精油质量（g）；M为果实质量（g）。
1.2.2 单因素试验
（1）超声时间对精油得率的影响。称取50 g的山苍子，固定NaCl体积分数为2%、蒸馏时间为4 h、液料比[V（mL）∶m（g）]为4∶1，分别采用超声时间10、20、30、40、50 min进行超声强化提取，按照1.2.1的方法测定山苍子精油的得率。
（2） NaCl体积分数对精油得率的影响。称取50 g的山苍子，固定超声时间为20 min、蒸馏时间为4 h、液料比[V（mL）∶m（g）]为4∶1，分别采用NaCl体积分数0、1%、2%、3%、4%进行超声强化提取，按照1.2.1的方法测定山苍子精油的得率。
（3）蒸馏时间对精油得率的影响。称取50 g的山苍子，固定超声时间为20 min、NaCl体积分数为3%、液料比[V（mL）∶m（g）]为4∶1，分别采用蒸馏时间1、2、3、4、5 h进行超声强化提取，按照1.2.1的方法测定山苍子精油的得率。
（4）液料比对精油得率的影响。称取50 g的山苍子，固定超声时间为20 min、NaCl体积分数为3%、蒸馏时间为4 h，分别采用液料比[V（mL）∶m（g）]2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1进行超声强化提取，按照1.2.1的方法测定山苍子精油的得率。
1.2.3 响应面优化
超声时间作为单独辅助因素，设定3个单因素试验，自变量分别为NaCl体积分数、液料比、蒸馏时间。根据试验结果得到最佳提取工艺条件为NaCl体积分数3%、液料比[V（mL）∶m（g）]4∶1、蒸馏时间4 h。依据Box-Benhnken原理设计试验因素与水平，采用Design Expert 8.0.6软件进行分析，选择NaCl体积分数、液料比、蒸馏时间3个影响因素进行考察，通过响应面法进一步优化精油提取工艺。
1.2.4 抑菌活性研究
（1） PDA培养基制作。马铃薯去皮，切成小块，取200 g，加水煮沸30 min 过滤，再加20 g 琼脂和20 g 葡萄糖，溶化后补充水至1 000 mL[3]，121 ℃高压灭菌30 min。本次试验山苍子精油质量浓度为1 μL·mL−1（山苍子精油密度为0.883 g·mL−1，即质量浓度883 mg·mL−1）。
（2）精油母液的制备。在 50 mL 的无菌容量瓶中加2.5 mL精油，11 mL Tween 80和5 mL 95%乙醇，用无菌水定容至50 mL并摇匀，备用[4]。
（3）抑菌率测定。采用菌丝生长速率法测定抑菌活性。山苍子精油含量为1 μL·mL−1，配置含药PDA培养基，以同样溶解条件的溶液作为空白对照。用打孔器（孔径0.5 cm）打取菌丝外圈生长合适的菌饼，每个菌可以做3个加样抑菌板，设计3个空白对照。接菌后置于培养箱培养，隔3 d可以观察1次，等到无变化时，即可进行测量 [5-7] 。菌丝生长抑制率按如下公式计算。
抑菌率/%=[(D0−D1)/(D0−0.5)]×100
式中，D0为对照组菌落直径，D1为处理组菌落直径。
（4） 植物病原真菌毒力测定。将山苍子精油配制成终质量浓度为0.05、0.1、0.2、0.4、0.8 μL·mL−1的含药PDA培养基。另外，将市售药甲基硫菌灵WP（70%）作为阳性对照，设置成相同质量浓度的对照组，按照1.2.4中的第（3）点方法评价测定抑制真菌活性，并计算毒力回归方程、有效中浓度（EC50）值和相关系数（R2）。
（5） 菌丝形态的观察。在无菌条件下，用接菌针分别取处理组和对照组培养皿边缘菌丝，置于载玻片中央，加入适量乳酸酚棉蓝染色液进行染色，盖上盖玻片，在生物显微镜物镜下观察菌丝形态。
（6） 精油对菌丝干重的影响。将山苍子精油分别配制成终质量浓度为25、50、100、200、400 μg·mL−1的PD培养基，取5个生长状态合适的瓜果腐霉菌菌饼接入培养基中，设置不加药的PD培养基作为空白对照。将培养基置于振荡培养箱中（28 ℃，110 r·min−1）培养6 d，然后把培养后的菌丝干燥、称重。
1.2.5 菌丝生理生化指标的测定
（1） 菌丝体提取物的制备。用打孔器（孔径0.5 cm）打取5个生长状态合适的瓜果腐霉菌菌饼，配制精油终质量浓度为100 μg·mL−1，取药液25 mL，分别加入5瓶PD培养液中，设置不加药的蒸馏水作为空白对照。28 ℃条件下，分别收集1、6、12、18、24 h的菌丝。取各个时间段收集得到的0.4 g菌丝，用灭菌超纯水冲洗两遍，并抽滤干燥。加入2 mL Tris-HCl缓冲液研磨，1 000 r·min−1离心10 min，取菌丝提取液的上清液备用。
（2）瓜果腐霉菌细胞膜丙二醛含量的测定。通过硫代巴比妥酸法[8]测定瓜果腐霉菌的丙二醛含量。取菌丝提取液的上清液加入2 mL 0.5%TBA溶液进行反应，沸水浴加热10 min，取出待溶液冷却后再使用离心机在10 000 r·min−1条件离心10 min。设置0.5%TBA溶液为空白对照，分别测定450、532、600 nm处的吸光度值，计算丙二醛含量。
（3） 瓜果腐霉菌还原糖含量的测定。通过DNS法[9]（3,5-二硝基水杨酸法）测定还原糖的含量，取0.1 mL不同时间处理精油处理的菌丝提取液的上清液加入2 mL 3,5-二硝基水杨酸，充分混合后，沸水浴加热5 min，取出待溶液冷却后加入1 mL Tris-HCl缓冲液，设置不加药的蒸馏水作为空白对照。分别测定波长540 nm下吸光度值，计算出葡萄糖浓度。
（4）瓜果腐霉菌保护酶活性的测定。通过紫外分光光度法[10]测定过氧化氢酶（Catalase，CAT）的活性。取1 mL不同时间处理精油处理的菌丝提取液，加入5%硫酸钛和浓氨水充分反应，3 000 r·min−1离心10 min，最后加入5%硫酸5 mL至沉淀完全溶解。设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在240 nm处的吸光度值。
通过愈创木酚比色法[10]测定过氧化物酶（Peroxidase，POD）的活性。取100 μL不同时间处理精油处理的菌丝提取液，分别加入3 mL 0.05 mol·L−1的磷酸缓冲液（pH5.5）、1 mL的H2O2（1%）和1 mL 0.05 mol·L−1的愈创木酚溶液，37 ℃下水浴加热充分混合反应．设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在470 nm处的吸光度值。
通过氮蓝四唑（NBT）法[11]测定超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）的活性。取1 mL不同时间处精油处理的菌丝提取液，反应总体积为3 mL，依次加入50 mmol·L−1缓冲液、13 mmol·L−1甲硫氨酸（pH 7.8）、100 nmol·L−1 EDTA溶液、75 μmol·L−1 NBT溶液和2 μmol·L－1核黄素溶液充分混匀，设置蒸馏水为空白对照，分别测定各处理在560 nm处的吸光度值。
（5）瓜果腐霉菌电导率的测定。根据上述培养液取样方法，用电导仪测定各取样时间点样品的相对电导率：将样品置于20 mL超纯水里，真空泵抽气 15 min 后，测定初始电导率，之后将样品煮沸10 min，冷却至室温后测定终电导率[12]。相对电导率为初始电导率与终电导率之比。
1.3 数据处理和分析
试验数据采用SPSS 26.0及Origin 9.1等软件进行分析处理，采用方差分析（AVOVA）分析个体处理之间的差异，不同小写字母表示在0.05 水平差异显著。所有值均表示为3个重复的平均值+标准差（SD）[13]。
2. 结果与分析
2.1 单因素试验
2.1.1 超声时间对精油得率的影响
结果如图1A所示，随着超声强化时间的延长，精油得率先增大随后逐渐减小，超声时间为20 min时，精油得率达最大值4.05%，然后降低。分析原因是，在长期连续超声作用下，水溶性杂质溶入水中，提取物的质量浓度上升，混合的蒸汽压力随之降低，精油在蒸汽中的分率下降导致得率下降[14]，故确定最佳超声时间为20 min。
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图 1 不同条件对山苍子精油得率的影响Figure 1. Effect of different conditions on extraction yield of Litsea cubeba essential oil2.1.2 NaCl体积分数对精油得率的影响
如图1B所示，NaCl当体积分数为3%时，精油得率达到峰值4.20%。体积分数小于3%时，增大NaCl体积分数，精油得率增加，体积分数大于3%时，增大NaCl体积分数，精油得率逐渐降低。因为NaCl体积分数的升高增强溶剂的渗透性，增加精油的溶出量，提高了精油的得率；但随着提取物中NaCl体积分数不断增加，降低混合溶液的蒸汽压力，进而降低精油在蒸汽中的分量，降低了精油得率[15]，因此确定NaCl最佳体积分数为3%。
2.1.3 蒸馏时间对精油得率的影响的影响
由图1C可知，增大蒸馏时间，精油得率不断增大，当蒸馏时间为3 h时，精油得率4.34%，当蒸馏时间为4 h时，精油得率达4.40%，但当蒸馏时间为5 h时，精油得率4.52%，即蒸馏时间4 h后精油得率增长缓慢。分析原因，精油的扩散系数小，传质速率比较慢，需要较长时间才能将精油提取完全。考虑到工业应用时，蒸馏时间不宜过长的原则，因此，最佳蒸馏时间确定为4 h。
2.1.4 液料比的影响
由图1D可知，刚开始精油得率随着液料比的增大而有所增加；液料比[V（mL）∶m（g）]为4∶1时，精油得率达最大值（4.35%）；液料比继续增大，精油得率则显著降低。分析原因，由于蒸馏水用量逐步增加，使得物料和溶剂的接触面积增大，精油的溶出量变大，精油得率提高；但当蒸馏水溶液用量不断增加，造成精油溶解在水里的量增大，最终导致精油得率下降。故确定最佳液料比[V（mL）∶m（g）]为4∶1。
2.2 响应面试验结果
2.2.1 因素间的交互影响
NaCl体积分数与液料比、NaCl体积分数与蒸馏时间、液料比与蒸馏时间之间交互作用的三维空间响应面图和二维等高线图如图2所示。曲线趋势表明对精油得率的影响，即曲线趋势越平滑，表示对精油得率的影响越小；曲线趋势越陡，表示对精油的得率影响越大。由图2可知，NaCl体积分数与液料比的曲线趋势较平缓，且等高线图呈类圆形结构，表明NaCl体积分数与液料比的交互作用不显著，对精油得率的影响较小。在一定的范围内，蒸馏时间越长，精油得率会越高，但考虑到工业应用时，蒸馏时间不宜过长，因此，在单因素试验时把最佳蒸馏时间确定为4 h。因此，由图2可以看出，NaCl体积分数与蒸馏时间、液料比与蒸馏时间的曲线趋势在蒸馏时间4 h前上升较快，在蒸馏时间4 h后上升缓慢。
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图 2 两因素交互作用对山苍子精油得率的影响Figure 2. Effect of interaction of two factors on yield of Litsea cubeba essential oil2.2.2 响应面分析
根据Box-Benhnken中心组合设计的基本原理，以单因素试验结果为根据，选择3个影响因素设计响应面试验，试验设计方案及结果如表1所示，并利用Design Expert 8.0.6软件进行二次多项式回归拟合结果分析，建立精油得率对NaCl体积分数（A）、蒸馏时间（B）和液料比（C）的二次多元回归模型[16]，精油得率Y=4.39−0.0138A−0.0150C+0.1988B+0.0075AC−0.0050AB−0.0025BC−0.0615A2−0.074C2−0.0665B2。
表 1 响应面设计方案与结果Table 1. The program and experimental results of response surface methodology编号
Serial numberA NaCl体积分数
A NaCl volume fraction/ %B蒸馏时间
B Distillation time/hC液料比
C liquid-material ratio /[ V （mL）∶ m （g）]精油得率
Yield of Litsea cubeba essential oil/%1 3.00 4.00 4.00 4.37 2 4.00 5.00 4.00 4.23 3 3.00 3.00 3.00 4.06 4 4.00 4.00 3.00 4.05 5 3.00 4.00 4.00 4.38 6 3.00 4.00 4.00 4.37 7 2.00 4.00 5.00 4.48 8 3.00 5.00 5.00 4.43 9 4.00 3.00 4.00 4.25 10 4.00 4.00 5.00 4.44 11 3.00 5.00 3.00 4.04 12 2.00 5.00 4.00 4.24 13 3.00 3.00 5.00 4.46 14 2.00 4.00 3.00 4.07 15 3.00 4.00 4.00 4.41 16 2.00 3.00 4.00 4.29 17 3.00 4.00 4.00 4.41 对上述模型进行方差分析，结果见表2。由表2可知，模型F回归值=170.18，P＜0.01，说明该回归模型极显著，即各因素NaCl体积分数、液料比、蒸馏时间之间的线性关系极显著，模型是可行的，具有显著性。其中，一次项A显著（ P= 4.37×10−2＜ 0.05 ），B极显著（ P ＜0.01 ），C显著( P= 3.16×10−2＜ 0.05 )，说明影响精油得率的因素依次为蒸馏时间、液料比、NaCl体积分数；二次项A2极显著（P＜0.01），B2极显著（P ＜0.01），C2极显著（P＜0.01）；交互项AB交互作用不显著（P=5.48×10−1＞0.05），AC交互作用不显著（P=3.75×10−1＞0.05），BC交互作用不显著（P=7.61×10−1＞0.05），说明各因素交互作用对精油得率影响的程度依次为NaCl体积分数与液料比＞NaCl体积分数与蒸馏时间＞液料比与蒸馏时间。总而言之，3个影响因子对精油得率的影响较为复杂，不是简单的线性关系，曲面效应显著。模型失拟项不显著（F失拟值=0.060 ，P=9.79×10−1＞0.05）。
表 2 回归方程方差分析表Table 2. Variance analysis of mathematical regression model方差来源
Soruce of variation平方和
Sum of squares自由度
df均方
Mean squareF值
F valueP值
P value显著性
Significance模型 Model 0.38 9 0.043 170.18 ＜0.01 ** A 1.51×10−3 1 1.51×10−3 6.03 4.37×10−2 * B 0.32 1 0.32 12.60.45 ＜0.01 ** C 1.80×10−3 1 1.80×10−3 7.18 3.16×10−2 * AB 1.00×10−2 1 1.00×10−2 0.40 5.48×10−1 AC 2.25×10−4 1 2.25×10−4 0.90 3.75×10−1 BC 2.50×10−5 1 2.50×10−5 0.10 7.61×10−1 A2 1.60×10−2 1 1.60×10−2 63.52 ＜0.01 ** B2 1.90×10−2 1 1.90×10−2 74.27 ＜0.01 ** C2 2.30×10−2 1 2.30×10−2 91.96 ＜0.01 ** 残差 Residual 1.76×10−3 7 2.51×10−4 失拟 Lack of fit 7.50×10−5 3 2.50×10−5 0.060 9.79×10−1 纯误差 Pure error 1.68×10−3 4 4.20×10−4 总计 Aggregate 0.39 16 *：差异显著（P＜0.05）;**：差异极显著（P＜0.01）。
* indicates significance difference（P＜0.05）; ** indicates extremely significance difference（P ＜0.01）.2.2.3 验证试验
根据试验条件，经软件分析得最优工艺条件为：NaCl体积分数2.39%，液料比[V（mL）∶m（g）]4.8∶1，蒸馏时间4.94 h。在该条件下，精油得率可达4.43%。结合实际应用，工艺条件可调整为NaCl体积分数2.00%，液料比[V（mL）∶m（g）]5∶1，蒸馏时间4.0 h，此时精油得率为4.26%，两者的相对标准偏差（RSD）为1.4%，与理论值接近，表明采用响应面法所建立的回归模型与真实试验结果的拟合程度较高，优化的工艺条件准确可靠。
2.3 精油的抑菌活性
精油质量浓度为8.0 μL·mL−1时，对苹果黑腐皮壳病菌、番茄灰霉病菌、瓜果腐霉菌抑菌率较好，分别为86.31%、82.52%、81.60%（表3）。
表 3 山苍子精油对病原菌的抑制率测定Table 3. Determination of inhibition rate of Litsea cubeba essential oil against pathogenic bacteria供试病原菌
Pathogenic bacteria for test抑菌率
Bacteriostasis rate/%瓜果腐霉菌 Pythium aphanidermatum 86.31±0.25 a 苹果黑腐皮壳病菌 Valsa mali Miyabe et Yamada 82.52±0.12 a 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea 81.60±0.48 a 禾谷镰刀病菌 Fusarium graminearum 77.09±0.63 b 燕麦镰孢菌 FusaHum graminearum Sehw 74.66±0.72 b 西瓜尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporumf 57.96±0.61 c 不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05).精油对瓜果腐霉菌的EC50值为0.255 μL·mL−1=224.4 μg·mL−1（根据山苍子精油质量浓度883 μg·mL−1），与阳性对照药70%甲基硫菌灵WP（表4）EC50=466.9 μg·mL−1降低了51.9%。
表 4 山苍子精油与阳性对照对瓜果腐霉菌的毒力测定Table 4. Determination of the virulence of Litsea cubeba essential oil against Pythium aphanidermatum样品
Sample毒力曲线
Virulence
curve相关系数
Correlation
coefficient
(R2)EC50 /
(μg·mL−1）山苍子精油
Litsea cubeba
essential oily=1.896x+0.345 0.989 224.4 70%甲基硫菌灵
WP（对照）
Thiophanate-
Methyl （control）y=0.428x−1.141 0.946 466.9 2.4 山苍子精油对瓜果腐霉菌丝形态的影响
通过显微镜观察瓜果腐霉菌菌丝，对照组菌丝表面光滑，透明饱满，大小均一，无断裂现象。处理组菌丝有明显的空泡化现象，相比于对照组透明度增加，排列杂乱，有内容物溢出现象。表明精油对瓜果腐霉菌菌丝存在明显毒害作用（图3）。
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图 3 山苍子精油对瓜果腐霉菌菌丝形态影响A为生理盐水对照组，B为山苍子精油处理组。Figure 3. Effect of Litsea cubeba essential oil on hyphae morphology of Pythium aphanidermatumA is the control group using physiological saline solution, and B is the group for the processing of Shancangzi essential oil.2.5 精油对瓜果腐霉菌菌丝干重的影响
处理6 d后，加入精油质量浓度为25 μg·mL−1时，菌丝干重的变化较为明显，相比于对照组菌丝干重显著下降；随质量浓度逐渐升高，菌丝干重逐渐降低；当精油质量浓度达到最大值（400 μg·mL−1）时，菌丝干重仅为对照组的1.7%，与对照组的菌丝干重差异显著，抑制率为98.3%（图4）。
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图 4 山苍子精油对瓜果腐霉菌干重的影响不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。Figure 4. The effect of Litsea cubeba essential oil on the dry weight of Pythium aphanidermatumData with different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05).2.6 精油对瓜果腐霉菌细胞膜透性的影响
瓜果腐霉菌细胞膜受损害后引起膜脂过氧化反应，丙二醛（MDA）就是其产物之一，其可以间接反映细胞膜受损程度。在精油质量浓度为100 μg·mL−1的条件下，细胞膜MDA含量随着处理时间的增加而不断升高，在18 h达到峰值（19.35 nmol·g−1），随后含量略有降低（图5 A）。处理组6～24 h细胞膜MDA含量均高于对照组且差异显著。表明精油可破坏菌体细胞膜，引起膜脂过氧化反应。
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图 5 山苍子精油对瓜果腐酶生理生化各项数值影响图A~F分别表示山苍子精油对瓜果腐酶的MDA（A）、还原糖（B）、CAT（C）、POD（D）、SOD（E）、相对电导率（F）的影响，LC为处理组，CK为空白对照组。不同小写字母表示同一时间不同处理之间差异显著（P＜0.05）。Figure 5. Effects of litsea cubeba essential oil on the physiological and biochemical values of Pythium aphanidermatumThe letters a-f in the figure indicate the effects of litsea cubeba essential oil on MDA（A）, reducing Glucose（B） , CAT（V）, POD（D）, SOD （E）and relative electrical conductivity（F）of melon and fruit rot enzymes, respectively,"LC" is the treatment group and "CK" is the blank control group.Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the same time point (P＜0.05).2.7 精油对瓜果腐霉菌还原糖含量的影响
使用精油处理瓜果腐霉菌后体内还原糖含量高于空白对照组，说明处理组菌丝受到外源刺激导致自身代谢糖物质以供生长需求；处理时间6～12 h时，处理组菌体内还原糖含量明显降低并低于对照组；12～24 h时处理组菌体内还原糖含量逐渐降低且趋于平稳，表明精油能够破坏细胞膜，使渗透性发生变化，导致胞内还原糖泄漏，随着处理时间延长，菌丝体胞内还原糖含量逐渐下降 (图5 B）。
2.8 精油对瓜果腐霉菌CAT、POD、SOD活性的影响
图5 C－E显示，CAT活性在处理1～6 h内CAT活性迅速升高并在12 h时达到峰值，约为对照组的1.28倍；12～24 h该酶活性显著下降，并且低于对照组。而对照组CAT活性没有明显变化。POD活性处理1～6 h 活性迅速升高并达峰值，约为对照组的1.27倍；6 h后，POD活性显著下降。处理6 h内SOD活性与对照组相比有所升高；6～12 h SOD明显升高并高于对照组；12～18 h SOD活性急剧下降，至18～24 h SOD活性缓慢降低。表明瓜果腐霉经过精油处理后，菌丝体可以通过调节多种酶活性来减轻化合物对自身的毒害作用。
2.9 精油对瓜果腐霉菌相对电导率的影响
对照组相对电导率为23.56%～25.43%，经精油处理后，相对电导率呈逐渐上升趋势。处理1.0～1.5 h时相对电导率上升幅度为28.2%，表明精油破坏了瓜果腐霉菌的膜结构，使电解质渗透导致胞外电导率升高；对照组的相对电导率显著低于处理组；相对电导率随着时间不断上升并在2 h后趋于平缓。表明，在精油处理2 h时瓜果腐霉菌的细胞膜受损已达到最大值（图5F）。
3. 讨论与结论
文献研究显示，以水蒸气蒸馏法提取山苍子精油，得率范围为3.06%~3.17%[16-17]。本研究首次采用响应面法优化“超声波+无机盐”协同水蒸气蒸馏提取山苍子精油，提取得率为4.26%。与现有技术比较，提升25%~28%，为工业生产山苍子精油以及高精油山苍子种质资源筛选提供借鉴。
山苍子精油对细菌金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）和白色念球菌 （Candida albicans），最小抑菌质量浓度分别为 20、40、5 mg·mL−1[18]。对都柏林假丝酵母菌（Candida dublin）、新生隐球菌（Cryptococcus neoformans）和克柔假丝酵母菌（Candida krusei）3 种真菌的最低抑制质量浓度分别为0.63、1.25、1.25 μL·mL−1[19]。在植物病原菌方面，山苍子精油中的内生真菌中球毛壳菌（Chaetomium globosum，SF22）和微小青霉菌（Penicillium minioluteum，SF14）对植物病原菌有很好的抑制效果[20]。山苍子精油的抑菌机理主要是通过破坏微生物的生物膜，如可以通过破坏辣椒疫霉菌的细胞膜通透性抑制菌丝生长[21]，经山苍子精油处理后的意大利青霉菌孢子的细胞膜完整性受到破坏[22]。此外对于耐药鲍曼不动杆菌其不仅能抑制生物膜的生成，还对成熟生物膜具有显著的清除效果[23]。本研究首次发现山苍子精油对苹果黑腐皮壳病菌、番茄灰霉病菌、瓜果腐霉菌抑菌率高达86.31%、82.52%、81.60%；精油对瓜果腐霉抑制效果最为显著，EC50为224.4 μg·mL−1，作用机制与抑制菌丝体生长、破坏菌丝体膜结构及破坏菌丝体内保护酶有关，这为山苍子精油开发绿色、安全、天然的新型植物源杀菌剂提供理论参考。
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图 1 不同条件对山苍子精油得率的影响
Figure 1. Effect of different conditions on extraction yield of Litsea cubeba essential oil
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图 2 两因素交互作用对山苍子精油得率的影响
Figure 2. Effect of interaction of two factors on yield of Litsea cubeba essential oil
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图 3 山苍子精油对瓜果腐霉菌菌丝形态影响
A为生理盐水对照组，B为山苍子精油处理组。
Figure 3. Effect of Litsea cubeba essential oil on hyphae morphology of Pythium aphanidermatum
A is the control group using physiological saline solution, and B is the group for the processing of Shancangzi essential oil.
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图 4 山苍子精油对瓜果腐霉菌干重的影响
不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Figure 4. The effect of Litsea cubeba essential oil on the dry weight of Pythium aphanidermatum
Data with different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05).
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图 5 山苍子精油对瓜果腐酶生理生化各项数值影响
图A~F分别表示山苍子精油对瓜果腐酶的MDA（A）、还原糖（B）、CAT（C）、POD（D）、SOD（E）、相对电导率（F）的影响，LC为处理组，CK为空白对照组。不同小写字母表示同一时间不同处理之间差异显著（P＜0.05）。
Figure 5. Effects of litsea cubeba essential oil on the physiological and biochemical values of Pythium aphanidermatum
The letters a-f in the figure indicate the effects of litsea cubeba essential oil on MDA（A）, reducing Glucose（B） , CAT（V）, POD（D）, SOD （E）and relative electrical conductivity（F）of melon and fruit rot enzymes, respectively,"LC" is the treatment group and "CK" is the blank control group.Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments at the same time point (P＜0.05).
表 1 响应面设计方案与结果
Table 1 The program and experimental results of response surface methodology
编号
Serial numberA NaCl体积分数
A NaCl volume fraction/ %B蒸馏时间
B Distillation time/hC液料比
C liquid-material ratio /[ V （mL）∶ m （g）]精油得率
Yield of Litsea cubeba essential oil/%1 3.00 4.00 4.00 4.37 2 4.00 5.00 4.00 4.23 3 3.00 3.00 3.00 4.06 4 4.00 4.00 3.00 4.05 5 3.00 4.00 4.00 4.38 6 3.00 4.00 4.00 4.37 7 2.00 4.00 5.00 4.48 8 3.00 5.00 5.00 4.43 9 4.00 3.00 4.00 4.25 10 4.00 4.00 5.00 4.44 11 3.00 5.00 3.00 4.04 12 2.00 5.00 4.00 4.24 13 3.00 3.00 5.00 4.46 14 2.00 4.00 3.00 4.07 15 3.00 4.00 4.00 4.41 16 2.00 3.00 4.00 4.29 17 3.00 4.00 4.00 4.41 
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表 2 回归方程方差分析表
Table 2 Variance analysis of mathematical regression model
方差来源
Soruce of variation平方和
Sum of squares自由度
df均方
Mean squareF值
F valueP值
P value显著性
Significance模型 Model 0.38 9 0.043 170.18 ＜0.01 ** A 1.51×10−3 1 1.51×10−3 6.03 4.37×10−2 * B 0.32 1 0.32 12.60.45 ＜0.01 ** C 1.80×10−3 1 1.80×10−3 7.18 3.16×10−2 * AB 1.00×10−2 1 1.00×10−2 0.40 5.48×10−1 AC 2.25×10−4 1 2.25×10−4 0.90 3.75×10−1 BC 2.50×10−5 1 2.50×10−5 0.10 7.61×10−1 A2 1.60×10−2 1 1.60×10−2 63.52 ＜0.01 ** B2 1.90×10−2 1 1.90×10−2 74.27 ＜0.01 ** C2 2.30×10−2 1 2.30×10−2 91.96 ＜0.01 ** 残差 Residual 1.76×10−3 7 2.51×10−4 失拟 Lack of fit 7.50×10−5 3 2.50×10−5 0.060 9.79×10−1 纯误差 Pure error 1.68×10−3 4 4.20×10−4 总计 Aggregate 0.39 16 *：差异显著（P＜0.05）;**：差异极显著（P＜0.01）。
* indicates significance difference（P＜0.05）; ** indicates extremely significance difference（P ＜0.01）.
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表 3 山苍子精油对病原菌的抑制率测定
Table 3 Determination of inhibition rate of Litsea cubeba essential oil against pathogenic bacteria
供试病原菌
Pathogenic bacteria for test抑菌率
Bacteriostasis rate/%瓜果腐霉菌 Pythium aphanidermatum 86.31±0.25 a 苹果黑腐皮壳病菌 Valsa mali Miyabe et Yamada 82.52±0.12 a 番茄灰霉病菌 Botrytis cinerea 81.60±0.48 a 禾谷镰刀病菌 Fusarium graminearum 77.09±0.63 b 燕麦镰孢菌 FusaHum graminearum Sehw 74.66±0.72 b 西瓜尖孢镰孢菌 Fusarium oxysporumf 57.96±0.61 c 不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters indicate significant differences (P＜0.05).
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表 4 山苍子精油与阳性对照对瓜果腐霉菌的毒力测定
Table 4 Determination of the virulence of Litsea cubeba essential oil against Pythium aphanidermatum
样品
Sample毒力曲线
Virulence
curve相关系数
Correlation
coefficient
(R2)EC50 /
(μg·mL−1）山苍子精油
Litsea cubeba
essential oily=1.896x+0.345 0.989 224.4 70%甲基硫菌灵
WP（对照）
Thiophanate-
Methyl （control）y=0.428x−1.141 0.946 466.9
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