Utilization of ITS Gene Barcodes for Identifying Plant-derived Functional Ingredients in Health Food Products
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摘要:目的 研究并建立运用ITS基因条码技术针对保健食品常见植物原料源性成分的分子生物学鉴定技术。方法 通过采用回顾性调查方法，选取西洋参（Panax quinquefolius）、铁皮石斛（Dendrobium candidum）以及红景天（Rhodiola nobilis）、枸杞子（Lycium barbarum L.）与人参Ginseng（Radix Ginseng）作为研究对象。探索其作为生产原料的常见保健食品剂型中，目标 DNA 的最佳提取方法。运用ITS2内转录间隔区保守特性设计引物序列，并通过调整优化体系中各物质的组分，由此构建稳定高效准确的PCR反应体系。结果 采用改良CTAB法可实现对所研究的保健食品中常见剂型目标DNA的提取，纯度及质量达到反应要求。所建立的PCR法扩增效果良好，对西洋参、铁皮石斛以及红景天的方法灵敏度均为1 ng·μL−1，枸杞子与人参的方法灵敏度为0.1 ng·μL−1。结论 运用建立的方法可实现对保健食品中常见植物性原料西洋参、人参、铁皮石斛、枸杞子、红景天成分的鉴定，适用于丸剂、片剂、口服液等不同剂型的保健食品中原料鉴别，可运用于对保健食品中植物源性的检测。Abstract:Objective A molecular biology identification method to detect common plant-derived functional ingredients in health food products using genetic barcodes was developed.Method By means of retrospective investigation, 5 common health food raw materials in China, i.e., American ginseng (Panax quinquefolius), Dendrobium candidum, rhodiola (Rhodiola nobilis), wolfberries (Lycium barbarum L.), and ginseng (Radix Ginseng), were firstly tested for functional ingredients using the best extraction method on the target DNA. A stable, efficient, and accurate PCR reaction system was constructed with primer sequence designed based on the conservative characteristics of ITS2 internal transcribed spacer and components of each substance adjusted and optimized. Molecular identification on health food products of various forms was tested using the developed method.Result The innovative application of a modified CTAB method afforded successful extraction of the target DNA in health food materials as well as products at commonly formulated dosages. The PCR amplified with the detection sensitivity on nucleic acids of American ginseng, D. candidum, and rhodiola reached 1 ng·μL−1, and of wolfberries and ginseng 0.1 ng·μL−1.Conclusion By using the ITS gene barcodes obtained through the DNA extraction and PCR amplification, the key functional ingredients from plant materials such as American ginseng, ginseng, D. candidum, wolfberries, and rhodiola rosea could be identified for authentication of health food products in the forms of pills, tablets, and concoctions.
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Keywords:
- Gene barcode /
- health food /
- plant-derived functional ingredients /
- PCR
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多花黄精Polygonatum cyrtonema Hua是百合科黄精属植物，为中药黄精的原植物来源之一，具有补气养阴、健脾等功效，在临床上常用于治疗体倦乏力、脾胃气虚、精血不足、胃阴不足、须发早白、口干食少等，也可用于治疗肺结核、糖尿病、慢性肝炎等病，同时又是多种滋补性中成药或复方的重要组分[1-2]，其药用价值可见一斑。福建省多花黄精野生资源尤为丰富，而长梗黄精Polygonatum filipes Merr.在原植物形态、生药性状与多花黄精极为相似[3]，闽民间常把长梗黄精混作为黄精入药[4]，给用药安全带来很大的隐患，目前两者之间的种质鉴别方法一般采用形态鉴别，由于气候、地理、土壤等自然因素的影响，形态鉴别往往缺乏准确性，因此，对多花黄精进行快速准确的鉴定显得尤为重要和迫切。简单重复序列间扩增多态性(inter-simple sequence repeat，ISSR)分子标记方法，可以灵敏、快速、高效地检测出基因组DNA的多态性，具有DNA用量少，耗时少，操作简单、成本较低，可重复性好等优点，适合大样本的检测[5]，近年来在品种鉴定、种群遗传学、种质资源、分类学、种系发生学等方面研究中得到了广泛的应用，并成为构建种质遗传图谱的重要工具[6-10]。张红梅等建立了多花黄精ISSR反应体系[11]，周晔等利用ISSR分子标记准确鉴别了黄精和卷叶黄精[5]，但利用分子标记全面系统对多花黄精种质资源及其掺伪品鉴定、分类、构建分子遗传图谱和基因定位等方面的研究尚未见报道。本研究采用原植物鉴定、性状鉴定及ISSR等方法鉴别闽产多花黄精与长梗黄精，并分析其种质资源遗传多样性。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
2014年5月至2015年9月，收集福建福州、南平、三明、宁德等黄精属主分布区种质资源19份，19份样品均为野生种质资源，集中种植于福建中医药大学药用植物园，样品信息见表 1。
表 1 19份供试材料Table 1. Basic information on 19 germplasm samples样品 原产地 叶下面短毛 总花梗长
/cmS1 福建泰宁 无 3~4 S2 福建梅列 有 5~8 S3 福建沙县 有 6~8 S4 福建光泽1 有 6~8 S5 福建光泽2 有 5~8 S6 福建霞浦 无 3~4 S7 福建建瓯 无 2~4 S8 福建建阳 无 3~4 S9 福建尤溪 无 2~4 S10 福建柘荣 无 3~4 S11 福建永泰 无 3~4 S12 福建泉港 无 2~4 S13 福建松溪 无 3~4 S14 福建闽侯 有 6~8 S15 福建新罗 无 3~4 S16 福建上杭 无 3~4 S17 福建武夷山1 有 6~8 S18 福建武夷山2 无 2~4 S19 福建武夷山3 无 3~4 试验仪器包括PCR仪(BIO-RAD公司)，凝胶成像分析系统(BIO-RAD公司)，电泳仪(Thermo公司)，低温冷冻离心机(Eppendorf公司)，微量移液器(Eppendorf公司)。琼脂糖(Promega公司)，EB(Fluka公司)，DNA聚合酶(北京全式金公司)，UBC801~UBC900(上海生工生物技术有限公司)，异丙醇、氯仿、乙醇均为分析纯。
1.2 试验方法
1.2.1 性状及原植物鉴别
原植物鉴定本次收集的黄精属植物分布检索表如下[12]。
1.叶互生
2.根状茎圆柱状(即“节”不粗大, “节间”延伸较长)；花丝近平滑至乳头状突起1.玉竹P. odoratum
2.根状茎姜状、连珠状或多少呈连珠状(即“节”粗大, “节间”较短缩)；花丝全部两侧压扁, 具乳头状突起至具短绵毛
3.叶下面有短毛；总花梗细长, 长3~8 cm……………………………………………2.长梗黄精P. filipes
3.叶下面无毛；总花梗较粗短, 长1~4 cm…………………………………3.多花黄精P. cyrtonema
性状鉴别(1) 长梗黄精：根基圆柱形，节处有突出分支，直径0.6~4.0 cm。茎痕圆盘状，直径0.3~0.6 cm，环节明显，表面棕黄色、黄色或黄棕色，有细皱纹。气弱，味甜；(2) 多花黄精：根茎连珠状或块状，圆柱形，直径2.0~3.0 cm。茎痕明显，圆盘状，直径约1.0 cm。外环节明显，有众多须根。表面黄棕色，有细皱纹。质坚实，稍带柔韧，折断面颗粒状，有众多黄棕色维管束小点散列。气弱，味微甜[13-15]。
1.2.2 ISSR鉴定
(1) 样品基因组总DNA的提取和纯化：2016年6月，采集受试19份种质的嫩叶，每份样品随机选取10片，洗净，以本课题组建立的改良CTAB法分别提取新鲜或阴干样品总DNA，经琼脂糖凝胶电泳检测，并用纯化DNA样品。
(2) 引物筛选及样品ISSR分析：以19个样品总DNA为模板，用UBC801~UBC900等100条ISSR引物进行多态性筛选。ISSR-PCR反应体系：总体积20 μL，包括50 ng模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶，0.2 mmol·L-1 dNTPs，0.4 μmol·L-1引物，2.5 mmol·L-1 Mg2+。ISSR-PCR反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，31~50℃退火1.5 min，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸10 min；10℃保温。退火温度因扩增条带的效果而进行相应的调整。PCR扩增产物在加有EB的琼脂糖凝胶中电泳分离，电泳结果在成像系统拍照储存。
1.3 数据统计及分析
根据扩增产物条带的有无进行统计，有带记为1，无带记为0，建立所有位点的二元数据。应用Popgen 32软件进行遗传参数分析，计算样品之间的遗传距离和相似系数，利用NTSYSpc 2.1软件根据遗传距离用UPGMA法(Unweighted pair group mean average)聚类分析，构建系统树。
2. 结果与分析
2.1 性状及原植物鉴别
根据性状及原植物进行样品鉴别，种质1、6、7、8、9、10、11、12、13、15、16、18、19为多花黄精，种质2、3、4、5、14、17为长梗黄精。
2.2 DNA提取方法
在样品前处理上，考查了叶子不同处理方法(新鲜、阴干)、水浴时间、不同的震荡方法(机械、手动)、提取及纯化次数对DNA提取的影响。结果表明叶子阴干后提取效果较佳，故样品制备最终采用叶子阴干后提取，水浴1 h，手动振摇，纯化2次(如图 1)的方法。
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图 1 样品基因组DNA电泳图谱注：A1、B1、C1、D1、E1为新鲜样品；A2、B2、C2、D2、E2为阴干样品。Figure 1. Genomic DNAs extracted from Polygonatum electrophoresed on 0.8% agarose TBE gel2.3 扩增产物的多态性分析
以S1~S19共19份黄精属样品的总DNA为模板，建立ISSR-PCR反应体系，对UBC801~UBC900共100个随机引物进行多态性筛选，扩增产物经1.8%的琼脂糖凝胶电泳分离后，共选出11个多态性较理想的ISSR引物(表 2)，每个引物扩增条带数在11~19条，条带大小在250~2 000 bp(图 2)。每条随机引物设置3次重复，11条引物扩增效果重复性好，共扩增出170条谱带，其中多态性谱带170条，多态性条带比率为100%，这表明受试黄精属样品在DNA水平上存在显著差异。
表 2 11条ISSR引物扩增条带数与多态性比率Table 2. Number and ratio of polymorphic bands amplified by 11 ISSR primers引物 引物序列 退火温
度/℃扩增
条带数多态性
条带数多态性
比率/%UBC807 AGA GAG AGA GAG AGA GT 52 13 13 100 UBC811 GAG AGA GAG AGA GAG AC 54 17 17 100 UBC818 CACACACACACACACAG 54 18 18 100 UBC820 GTG TGT GTG TGT GTG TC 54 14 14 100 UBC826 ACA CAC ACA CAC ACA CC 54 18 18 100 UBC827 ACA CAC ACA CAC ACA CG 54 11 11 100 UBC842 GAG AGA GAG AGA GAG AYG 51 15 15 100 UBC849 GTG TGT GTG TGT GTG TYA 53 19 19 100 UBC854 TCT CTC TCT CTC TCT CRG 51 12 12 100 UBC855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 53 14 14 100 UBC889 DBD ACA CAC ACA CAC AC 52 19 19 100 统计 170
(合计)170
(合计)100
(均值)注:R为碱基A或G；B为碱基C、G或T；D为碱基A、G或T；V为碱基A、C或G；H为碱基A、C或T。 ![]()
图 2 19个样品UBC826引物扩增结果注：M为DNA Marker，S1~S19为样品。Figure 2. Amplified primer UBC826 in 19 Polygonatum germplasms2.4 相似系数和遗传距离分析
用Popgen 32软件分析得到受试19份样品的遗传相似度与遗传距离(表 3)。结果表明：供试黄精属种质资源相似系数值在0.604 9~0.824 4，平均遗传相似系数为0.702 0；遗传距离分布在0.193 1~0.502 7，平均遗传距离为0.355 7。在19个样品中，最大相似系数为0.824 4，是S6采自霞浦种质的多花黄精与S7采自建瓯种质的多花黄精，它们之间的遗传距离仅为0.193 1；而采自柘荣种质的多花黄精与武夷山1种质的长梗黄精之间的遗传相似系数仅为0.604 9，遗传距离为0.502 7。
表 3 Nei's遗传相似性(对角线上方)和遗传距离(对角线下方)Table 3. Nei's genetic identity (above diagonal line) and distance (below diagonal line)项目 S1 S2 S3 S4 S5 S 6 S7 S8 S9 S10 S11 S12 S13 S14 S15 S16 S17 S18 S19 S1 0.7317 0.6976 0.6683 0.6829 0.7073 0.6683 0.6829 0.6878 0.6927 0.6780 0.6634 0.6634 0.6683 0.7073 0.7024 0.6780 0.6829 0.7366 S2 0.3124 0.7415 0.7415 0.7463 0.6829 0.6732 0.6780 0.7122 0.6683 0.6537 0.6780 0.6585 0.7024 0.6829 0.6976 0.6732 0.6390 0.6732 S3 0.3602 0.2991 0.7171 0.6634 0.6878 0.7073 0.6829 0.7073 0.7122 0.6585 0.6829 0.6634 0.6976 0.6780 0.6732 0.6390 0.6244 0.6683 S4 0.4030 0.2991 0.3326 0.8195 0.6780 0.6976 0.6732 0.6878 0.6927 0.6683 0.6927 0.6732 0.7171 0.6683 0.6732 0.6878 0.6439 0.6683 S5 0.3814 0.2926 0.4104 0.1990 0.7512 0.7024 0.6878 0.6927 0.6488 0.6634 0.6878 0.6488 0.7610 0.6732 0.6878 0.7122 0.6878 0.6829 S6 0.3643 0.3814 0.3743 0.3885 0.2861 0.8244 0.8000 0.7659 0.7512 0.7268 0.7512 0.7220 0.6976 0.7268 0.7024 0.6683 0.7122 0.6976 S7 0.4030 0.3958 0.3463 0.3602 0.3532 0.1931 0.8195 0.7951 0.7610 0.6878 0.7610 0.7610 0.6878 0.7561 0.7610 0.6293 0.6927 0.6683 S8 0.3814 0.3885 0.3814 0.3958 0.3743 0.2231 0.1990 0.8000 0.7756 0.7805 0.7268 0.7659 0.6927 0.7610 0.7463 0.6537 0.6878 0.7024 S9 0.3743 0.3394 0.3463 0.3743 0.3672 0.2668 0.2293 0.2231 0.8098 0.7073 0.6927 0.8000 0.6488 0.7756 0.6927 0.6390 0.6634 0.6683 S10 0.3672 0.4030 0.3394 0.3672 0.4327 0.2861 0.2732 0.2541 0.2110 0.7415 0.7366 0.7659 0.6244 0.7317 0.7268 0.6049 0.6293 0.6634 S11 0.3885 0.4252 0.4 177 0.4030 0.4104 0.3191 0.3743 0.2478 0.3463 0.2991 0.7902 0.7317 0.6683 0.6780 0.7122 0.7073 0.6439 0.6878 S12 0.4104 0.3885 0.3814 0.3672 0.3743 0.2861 0.2732 0.3191 0.3672 0.3057 0.2354 0.7463 0.7220 0.6829 0.7463 0.7024 0.6878 0.6829 S13 0.4104 0.4177 0.4104 0.3958 0.4327 0.3258 0.2732 0.2668 0.2231 0.2668 0.3124 0.2926 0.6927 0.7317 0.7171 0.6537 0.6878 0.7024 S14 0.4030 0.3532 0.3602 0.3326 0.2732 0.3602 0.3743 0.3672 0.4327 0.4710 0.4030 0.3258 0.3672 0.6585 0.6634 0.7366 0.6829 0.7171 S15 0.3463 0.3814 0.3885 0.4030 0.3958 0.3191 0.2796 0.2732 0.2541 0.3124 0.3885 0.3814 0.3124 0.4177 0.7707 0.6683 0.7024 0.6780 S16 0.3532 0.3602 0.3958 0.3958 0.3743 0.3532 0.2732 0.2926 0.3672 0.3191 0.3394 0.2926 0.3326 0.4104 0.2604 0.7415 0.6976 0.7122 S17 0.3885 0.3958 0.4478 0.3743 0.3394 0.4030 0.4632 0.4252 0.4478 0.5027 0.3463 0.3532 0.4252 0.3057 0.4030 0.2991 0.7024 0.6878 S18 0.3814 0.4478 0.4710 0.4402 0.3743 0.3394 0.3672 0.3743 0.4104 0.4632 0.4402 0.3743 0.3743 0.3814 0.3532 0.3602 0.3532 0.7122 S19 0.3057 0.3958 0.4030 0.4030 0.3814 0.3602 0.4030 0.3532 0.4030 0.4104 0.3743 0.3814 0.3532 0.3326 0.3885 0.3394 0.3743 0.3394 2.5 聚类分析
利用NTSYSpc 2.1软件进行UPGMA聚类，得到树状聚类图(图 3)，供试材料以相似系数0.68为分类界限，将19份样品分成2大类，4个亚类：Ⅰ1类有3个种质，分别为S1、S18和S19；Ⅰ2类有10个种质，分别为S6、S7、S8、S9、S10、S11、S12、S13、S15和S16；Ⅱ1类有5个种质，分别为S2、S4、S5、S14和S17；Ⅱ2类只有种质S3。
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图 3 基于ISSR的19个受试黄精属样品Nei′s遗传相似度UPGMA聚类Figure 3. UPGMA dendrogram of Sarcandra glabra based on Nei's genetic distance2.6 遗传多样性及分化分析
用Popgen 32软件对4个亚类的居群多样性进行分析，结果见表 4。从居群的有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(H)、Shannon信息指数(Ⅰ)可以看出，Ⅰ2亚类多样性最高；在假设遗传遵循哈德温伯格平衡的条件下，黄精属4个亚类种水平的基因多样性Ht=0.4132，表明受试样品具有一定的遗传多样性和分化。
表 4 基于ISSR的黄精属遗传多样性Table 4. Genetic diversity of Polygonatum based on ISSR markers亚类 有效等位基
因数(Ne)期望杂合度
(H)Shannon信息
指数(Ⅰ)Ⅰ1 1.3473 0.1930 0.2763 Ⅰ2 1.3799 0.2257 0.3391 Ⅱ1 1.3741 0.2162 0.3180 Ⅱ2 1.0 0 0 种级All 1.4845 0.2823 0.4239 3. 讨论与结论
本研究釆用了11条引物对样品进行PCR扩增，共扩增出170条DNA条带，多态性条带百分率高达100%，表明样品种质之间存在高度的遗传多样性，这可能是种间或居群间变异大所致。从相似系数或遗传距离看种质亲缘关系，在19个样品中，亲缘关系最近的为霞浦种质与建瓯种质，它们都是多花黄精，说明它们之间的遗传差异很小；而采自柘荣种质的多花黄精与武夷山1种质的长梗黄精之间的亲缘关系最远，多花黄精和长梗黄精为黄精属不同植物品种，这可能是它们遗传差异较大的主要原因。从地理位置与相似系数看，霞浦种质与建瓯种质之间的遗传距离小于光泽1种质与光泽2种质，这表明黄精属种质资源间亲缘关系的远近不全由地理距离决定，其种质资源之间的基因交流可能还与地形地貌、生态气候、海拔经纬度、生物群落分布等自然因素及人类活动等社会因素密切相关，从而影响种质之间的亲缘关系[16-17]。
本研究的聚类结果可以把19个样品分成2大类，根据原植物的叶、根茎及总花梗等性状，把这2大类分别鉴定为多花黄精和长梗黄精，说明ISSR标记能有效揭示福建多花黄精和长梗黄精之间亲缘关系的精确性，能很好地将材料区分开来，与植物形态学分类相一致，这为黄精及其掺伪品精确鉴别提供参考依据。
19个受试样品的有效等位基因数(Ne)、期望杂合度(H)、Shannon信息指数(Ⅰ)分别为1.484 5、0.292 3、0.423 9，4个亚类种水平的基因多样性Ht=0.4132，说明黄精属植物居群内变异较大；在第Ⅰ类多花黄精的13个种质中，S1、S18和S19这3个种质聚集在一起，在遗传相似系数0.684处，分支于其余10个种质，而在Ⅱ类6个种质中，S3种质在遗传相似系数0.690处分支于其余5个种质，说明闽产多花黄精和长梗黄精遗传多样性处于较高水平，其种质资源基因库较为丰富，种质间有明显分化，有待于结合生物学特性、农艺性状、化学成分及其他分子标记技术进一步探讨研究[17]。
本试验建立了ISSR多花黄精和长梗黄精种质鉴定及遗传多样性分析的分子标记方法，该方法可重复性好，简便准确，成本较低，可以为黄精属种质鉴别提供新的方法与参考依据。
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图 1 ITS2基因特异片段PCR产物电泳图
M: DNA Marker;CK:空白；N:阴性对照；A图1—10：西洋参药材；B图1-10：人参药材；C图1—10：枸杞药材；D图1-10：红景天药材；E图1-10：铁皮石斛。
Figure 1. Electrophoresis on PCR products of ITS2 specific fragment
M: DNA marker; CK: blank; N: negative control; Fig. A 1 — 10: American ginseng; Fig. B 1 — 10: ginseng; Fig. C 1 — 10: Chinese wolfberry; Fig. D 1 — 10: rhodiola; Fig. E 1 — 10: D. candidum.
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图 2 灵敏度试验结果
M: DNA Marker；泳道1 — 8为西洋参DNA质量浓度，依次为：0.01、0.1、1 ng·μL−1；泳道9 — 16为铁皮石斛DNA质量浓度，依次为：0.01、0.1、1 ng·μL−1；泳道17 — 24为红景天DNA质量浓度，依次为：0.01、0.1、1 ng·μL−1; 泳道25 — 30为枸杞子DNA质量浓度，依次为：0.01、0.1、1 ng·μL−1；泳道31 — 36为人参DNA质量浓度，依次为：0.01、0.1、1 ng·μL−1。
Figure 2. Sensitivity of assay
M: DNA marker; Swimlane No. 1-8: American ginseng DNA mass concentrations at 0.01, 0.1, and 1 ng·μL−1; Swimlane No. 9-16: D. candidum DNA mass concentrations at 0.01, 0.1, and 1 ng·μL−1; Swimlane No. 17-24: rhodiola DNA mass concentrations at 0.01, 0.1, and 1 ng·μL−1; Swimlane No. 25-30: Chinese wolfberry DNA mass concentrations at 0.01, 0.1, and 1 ng·μL−1; Swimlane No. 9-16: ginseng DNA mass concentrations at 0.01, 0.1, and 1 ng·μL−1.
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图 3 序列BLAST比对图
A，人参；B，西洋参；C，枸杞子；D，铁皮石斛；E，红景天。
Figure 3. BLAST comparison on sequences
A: ginseng; B: American ginseng; C: Chinese wolfberry; D: D. candidum; E: rhodiola.
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图 4 ITS 2 DNA条形码植物鉴别NJ系统发育树
Figure 4. Neighbor joining tree of health plant materials constructed using ITS 2 DNA barcodes
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图 5 部分供试保健食品样品ITS2基因PCR产物电泳图
M: DNA Marker; CK：空白对照；N：阴性对照；P：阳性对照；A1 — 12：西洋参供试样品；B1 — 8：人参供试样品；C1 — 10：铁皮石斛供试样品；D1 — 10：红景天供试样品。
Figure 5. Electrophoresis on PCR products of ITS2 genes in some health food products
M: DNA marker; CK: blank; N: negative control; A1-12：American ginseng samples; B1-8: ginseng samples; C1-10: D. candidum samples; D1-10: rhodiola samples.
表 1 供试药材信息
Table 1 Information on test materials
序号
Serial No物种名称及编号
Species name and number产品状态
Product State产地
Place of Origin1 西洋参1 American ginseng 1 粉末Powder 云南昆明 Kunming, Yunnan 2 西洋参2 American ginseng 2 药材 Medicinal materials 黑龙江饶河 Raohe, Heilongjiang 3 西洋参3 American ginseng 3 药材 Medicinal materials 加拿大 Canada 4 西洋参4 American ginseng 4 饮片 Decoction pieces 吉林清河 Qinghe,Jilin 5 西洋参5 American ginseng 5 饮片 Decoction pieces 美国 U.S.A 6 人参1 Ginseng1 鲜品 Fresh products 吉林通化 Tonghua ,Jilin 7 人参2 Ginseng2 鲜品 Fresh products 吉林延吉 Yanji ,Jilin 8 人参3 Ginseng3 鲜品 Fresh products 吉林长白山 Changbai Mountain, Jilin 9 人参4 Ginseng4 鲜品 Fresh products 黑龙江饶河 Raohe, Heilongjiang 10 人参5 Ginseng5 饮片 Decoction pieces 新西兰 New Zealand 11 枸杞子1 Chinese wolfberry1 药材 Medicinal materials 内蒙古 Inner Mongolia 12 枸杞子2 Chinese wolfberry2 药材 Medicinal materials 宁夏 Ningxia 13 枸杞子3 Chinese wolfberry3 药材 Medicinal materials 甘肃陇南 Longnan, Gansu 14 枸杞子4 Chinese wolfberry4 药材 Medicinal materials 山东日照 Rizhao, Shandong 15 枸杞子5 Chinese wolfberry5 药材 Medicinal materials 河北邢台 Xingtai, Hebei 16 铁皮石斛1 Dendrobium candidum1 粉末 Powder 湖南邵阳 Shaoyang, Hunan 17 铁皮石斛2 Dendrobium candidum2 药材 Medicinal materials 浙江天台 Tiantai, Zhejiang 18 铁皮石斛3 Dendrobium candidum3 药材 Medicinal materials 福建宁化 Ninghua, Fujian 19 铁皮石斛4 Dendrobium candidum4 饮片 Decoction pieces 广西天峨 Tian'e, Guangxi 20 铁皮石斛5 Dendrobium candidum5 饮片 Decoction pieces 云南文山 Wenshan, Yunnan 21 红景天1 Rhodiola1 饮片 Decoction pieces 内蒙古兴安 Xing'an, Inner Mongolia 22 红景天2 Rhodiola2 药材 Medicinal materials 吉林延吉 Yanji ,Jilin 23 红景天3 Rhodiola3 药材 Medicinal materials 西藏拉萨 Tibet Lhasa 24 红景天4 Rhodiola4 饮片 Decoction pieces 黑龙江饶河 Raohe, Heilongjiang 25 红景天5 Rhodiola5 饮片 Decoction pieces 甘肃兰州 Lanzhou, Gansu 
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表 2 供试保健食品信息
Table 2 Information on health food products
序号
Serial No保健食品名称
Name of health food剂型
Dosage form配料表宣称所含目标植物
Target plants claimed in the ingredient list1 西洋参含片 American ginseng buccal tablet 片剂 Tablet 西洋参 American ginseng 2 美国洋参含片 American ginseng buccal tablet 片剂 Tablet 西洋参 American ginseng 3 西洋参三七胶囊 Panax quinquefolium and panax notoginseng capsules 胶囊 Capsule 西洋参 American ginseng 4 西洋参淫羊藿枸杞子软胶囊
Panax quinquefolium epimedium and wolfberry fruit soft capsules胶囊 Capsule 西洋参 American ginseng 5 西洋参三七口服液 American ginseng and panax notoginseng oral liquid 口服液 oral liquid 西洋参 American ginseng 6 灵芝西洋参口服液 Ganoderma lucidum and American ginseng oral liquid 口服液 oral liquid 西洋参 American ginseng 7 人参提取口服液 Ginseng Extract Oral Liquid 口服液 oral liquid 人参 Ginseng 8 人参氨基酸口服液 Ginseng Amino Acid Oral Liquid 口服液 oral liquid 人参 Ginseng 9 人参三七含片 Ginseng and Sanqi Buccal Tablets 片剂 Tablet 人参 Ginseng 10 人参滴丸 Ginseng dropping pill 丸剂 Pills 人参 Ginseng 11 杞苓枣氨基酸口服液 Jujube Amino Acid Oral Liquid 口服液 oral liquid 枸杞子 Chinese wolfberry 12 玛咖枸杞胶囊 Maca medlar capsule 胶囊 Capsule 枸杞子 Chinese wolfberry 13 氨基酸枸杞片 Amino acid medlar tablet 片剂 Tablet 枸杞子 Chinese wolfberry 14 阿胶枸杞颗粒冲剂 Donkey hide gelatin and wolfberry granules 颗粒剂 Granule 枸杞子 Chinese wolfberry 15 森山铁皮枫斗颗粒 Senshan Iron Sheet Granules 冲剂 Granules 铁皮石斛 Dendrobium candidum 16 九仙尊米斛枫斗浆 Nine Immortals Zun Rice Dendrobium Maple Juice 片剂 Tablet 铁皮石斛 Dendrobium candidum 17 铁皮枫斗口服液 Dendrobium candidum oral liquid 口服液 oral liquid 铁皮石斛 Dendrobium candidum 18 津玉石斛口服液 Jinyu Dendrobium Oral Liquid 口服液 oral liquid 铁皮石斛 Dendrobium candidum 19 铁皮石斛西洋参黄芪胶囊
Dendrobium candidum, American ginseng and astragalus capsule胶囊 Capsule 铁皮石斛 Dendrobium candidum 20 红景天软胶囊 Rhodiola Soft Capsule 胶囊 Capsule 红景天 Rhodiola 21 红景天西洋参口服液 Rhodiola and American Ginseng Oral Liquid 口服液 oral liquid 红景天 Rhodiola 22 红景天提取物口服液 Rhodiola extract oral liquid 口服液 oral liquid 红景天 Rhodiola 23 红景天胶囊 Rhodiola Capsule 胶囊 Capsule 红景天 Rhodiola 24 圣莲红景天丸 Shenglian Rhodiola Capsule 丸剂 Pills 红景天 Rhodiola
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表 3 引物序列
Table 3 Primer sequences
片段
Fragment引物名称
Primer name引物序列（5'-3'）
Primer sequence （5'-3'）ITS2 ITS2-F ATGCGATACTTGGTGTGAAT ITS2-R GACGCTTCTCCAGACTACAAT 18S 18S-F CCTGAGAAACGGCTACCAT 18S-R CGTGTCAGGATTGGGTAAT
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表 4 不同方法DNA提取效果比较
Table 4 DNA extraction by different methods
物种
Species传统碱裂解SDS法
Traditional alkali cracking method改良CTAB法
Modified CTAB method试剂盒法
Kit method纯度
Purity A260/A280得率
Yield/（ng·μL-1）纯度
Purity A260/A280得率
Yield /（ng·μL−1）纯度
Purity A260/A280得率
Yield/（ng·μL−1）西洋参1 American ginseng1 1.35±0.04 c 363±8.19c 1.85±0.04a 814±4.16 a 1.50±0.06b 494±1.53 b 西洋参2 American ginseng 2 1.31±0.03 b 494±6.11 b 1.84±0.03 a 831±10.15 a 1.54±0.04 b 481±5.57 b 西洋参3 American ginseng 3 1.22±0.04 c 424±2.52 c 1.86±0.04 a 865±9.54 a 1.72±0.03b 454±6.56 b 西洋参4 American ginseng 4 1.33±0.04 c 322±5.57 c 2.06±0.10 a 868±3.51 a 1.59±0.03 b 478±6.03 b 西洋参5 American ginseng 5 1.43±0.05 c 422±4.16c 1.94±0.04 a 787±2.65a 1.58±0.23 b 489±8.39 b 人参1 Ginseng1 1.37±0.03 c 315±3.06 c 1.85±0.05a 896±1.00 a 1.45±0.05 b 500±5.86 b 人参2 Ginseng2 1.34±0.04 c 321±9.24 c 1.86±0.04 a 807±2.08 a 1.52±0.02 b 504±1.53 b 人参3 Ginseng3 1.21±0.02 c 322±4.36 c 2.05±0.04 a 853±7.77 a 1.45±0.05 b 481±7.02 b 人参4 Ginseng4 1.32±0.03 c 378±3.79 c 1.84±0.04 a 803±3.51 a 1.46±0.05 b 484±2.52 b 人参5 Ginseng5 1.35±0.04 c 348±5.57 c 1.91±0.06 a 807±5.13 a 1.58±0.06 b 489±2.52 b 枸杞子1 Chinese wolfberry1 1.63±0.03 c 573±4.04 c 2.04±0.05 a 806±2.00 a 1.41±0.04 b 621±9.62 b 枸杞子2 Chinese wolfberry2 1.74±0.02 b 540±6.35 c 1.88±0.03 a 759±4.73 a 1.67±0.05 b 601±1.73 b 枸杞子3 Chinese wolfberry3 1.59±0.06 b 565±0.58 c 1.85±0.03 a 780±5.86 a 1.43±0.05 b 594±1.53 b 枸杞子4 Chinese wolfberry4 1.64±0.03 c 589±3.46 c 1.84±0.04 a 794±3.06 a 1.47±0.06 b 613±9.45 b 枸杞子5 Chinese wolfberry1 1.73±0.03 c 582±4.16 c 1.95±0.04 a 774±2.08 a 1.54±0.04 b 606±5.51 b 铁皮石斛1 Dendrobium candidum1 1.55±0.03 c 362±10.44 c 1.99±0.04 a 827±2.31 a 1.68±0.05 b 499±9.02 b 铁皮石斛2 Dendrobium candidum2 1.52±0.02 c 486±2.08 c 1.86±0.05 a 815±5.51 a 1.66±0.05 b 481±3.46 b 铁皮石斛3 Dendrobium candidum3 1.33±0.03 c 424±5.13 c 1.95±0.04 a 870±3.79 a 1.71±0.07 b 457±5.03 b 铁皮石斛4 Dendrobium candidum4 1.34±0.03 c 320±6.66 c 1.94±0.04 a 858±7.81 a 1.71±0.06 b 479±10.01 b 铁皮石斛5 Dendrobium candidum5 1.47±0.05 c 429±6.51 c 1.90±0.05 a 793±4.73 a 1.64±0.04 b 504±3.51 b 红景天1 Rhodiola1 1.40±0.06 b 382±9.87 c 1.88±0.04 a 886±2.89 a 1.46±0.02 b 512±1.73 b 红景天2 Rhodiola2 1.28±0.07 c 329±5.57 c 1.90±0.06 a 807±5.03 a 1.50±0.07 b 509±4.51 b 红景天3 Rhodiola3 1.25±0.04 c 330±2.52 c 1.98±0.03 a 846±6.08 a 1.62±0.05 b 486±4.04 b 红景天4 Rhodiola4 1.35±0.04 c 383±3.51 c 1.86±0.03 a 800±8.33 a 1.58±0.08 b 490±4.16 b 红景天5 Rhodiola5 1.34±0.04 c 348±8.50 c 1.94±0.04 a 810±5.77 a 1.63±0.06 b 488±8.39 b 同指标数据后小写字母不同表示 0.05 水平上差异显著。
Those with different lowercase letters on same indicator indicate significant difference at 0.05 level.
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表 5 供试保健食品基因组DNA的纯度与得率
Table 5 Purity and yield of genomic DNA of health food materials
保健食品编号
Health food No保健食品名称
Name of health food配料表宣称所含目标植物
Target plants claimed in the
ingredient list纯度
Purity
A260/A280DNA质量浓度
DNA concentration/
（ng·μL−1）西洋参供试样1
American ginseng samples 1西洋参含片
American ginseng buccal tablet西洋参
American ginseng1.82 561 西洋参供试样2
American ginseng samples 2美国洋参含片
American ginseng buccal tablet西洋参
American ginseng1.92 497 西洋参供试样3
American ginseng samples 3西洋参三七胶囊
Panax quinquefolium and panax notoginseng capsules西洋参
American ginseng1.54 269 西洋参供试样4
American ginseng samples 4西洋参淫羊藿枸杞子软胶囊
Panax quinquefolium epimedium and wolfberry fruit soft capsules西洋参
American ginseng1.55 341 西洋参供试样5
American ginseng samples 5西洋参三七口服液
American ginseng and panax notoginseng oral liquid西洋参
American ginseng1.37 206 西洋参供试样6
American ginseng samples 1灵芝西洋参口服液
Ganoderma lucidum and American ginseng oral liquid西洋参
American ginseng1.33 219 人参供试样1
Ginseng sample 1人参提取口服液
Ginseng Extract Oral Liquid人参
Ginseng1.37 252 人参供试样2
Ginseng sample 2人参氨基酸口服液
Ginseng Amino Acid Oral Liquid人参
Ginseng1.39 200 人参供试样3
Ginseng sample 3人参三七含片
Ginseng and Sanqi Buccal Tablets人参
Ginseng1.76 578 人参供试样4
Ginseng sample4人参滴丸
Ginseng dropping pill人参
Ginseng1.80 622 枸杞子供试样1
Chinese wolfberry sample 1杞苓枣氨基酸口服液
Jujube Amino Acid Oral Liquid枸杞子
Chinese wolfberry1.52 213 枸杞子供试样2
Chinese wolfberry sample 2玛咖枸杞胶囊
Maca medlar capsule枸杞子
Chinese wolfberry1.56 456 枸杞子供试样3
Chinese wolfberry sample 3氨基酸枸杞片
Amino acid medlar tablet枸杞子
Chinese wolfberry1.90 389 枸杞子供试样4
Chinese wolfberry sample 4阿胶枸杞颗粒冲剂
Donkey hide gelatin and wolfberry granules枸杞子
Chinese wolfberry1.79 420 铁皮石斛供试样1
Dendrobium candidum sample1森山铁皮枫斗颗粒
Senshan Iron Sheet Granules铁皮石斛
Dendrobium candidum1.84 565 铁皮石斛供试样2
Dendrobium candidum sample2九仙尊米斛枫斗浆
Nine Immortals Zun Rice Dendrobium Maple Juice铁皮石斛
Dendrobium candidum1.97 500 铁皮石斛供试样3
Dendrobium candidum sample3铁皮枫斗口服液
Dendrobium candidum oral liquid铁皮石斛
Dendrobium candidum1.66 270 铁皮石斛供试样4
Dendrobium candidum sample4津玉石斛口服液
Jinyu Dendrobium Oral Liquid铁皮石斛
Dendrobium candidum1.54 339 铁皮石斛供试样5
Dendrobium candidum sample5铁皮石斛西洋参黄芪胶囊
Dendrobium candidum, American ginseng and astragalus capsule铁皮石斛
Dendrobium candidum1.36 205 红景天供试样1
Rhodiola sample1红景天软胶囊
Rhodiola Soft Capsule红景天
Rhodiola1.38 220 红景天供试样2
Rhodiola sample2红景天西洋参口服液
Rhodiola and American Ginseng Oral Liquid红景天
Rhodiola1.40 252 红景天供试样3
Rhodiola sample3红景天提取物口服液
Rhodiola extract oral liquid红景天
Rhodiola1.53 403 红景天供试样4
Rhodiola sample4红景天胶囊
Rhodiola Capsule红景天
Rhodiola1.77 580 红景天供试样5
Rhodiola sample5圣莲红景天丸
Shenglian Rhodiola Capsule红景天
Rhodiola1.85 625
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表 6 部分供试保健食品源性检测对照表
Table 6 Origins of some health food products
保健食品编号
Health food No保健食品名称
Name of health foodPCR产物电泳图及泳道编号
Electrophoresis diagram and Swimlane No of
PCR products西洋参供试样3
American ginseng samples 3西洋参三七胶囊
Panax quinquefolium and panax notoginseng capsules图5A，泳道编号5、6
Fig.5A，Swimlane No 5、6西洋参供试样5
American ginseng samples 5西洋参三七口服液
American ginseng and panax notoginseng oral liquid图5A，泳道编号9、10
Fig.5A，Swimlane No 9、10人参供试样1
Ginseng sample 1人参提取口服液
Ginseng Extract Oral Liquid图5B，泳道编号1、2
Fig.5B，Swimlane No 1、2铁皮石斛供试样2
Dendrobium candidum sample2九仙尊米斛枫斗浆
Nine Immortals Zun Rice Dendrobium Maple Juice图5C，泳道编号3、4
Fig.5C，Swimlane No 3、4铁皮石斛供试样3
Dendrobium candidum sample3铁皮枫斗口服液
Dendrobium candidum oral liquid图5C，泳道编号5、6
Fig.5C，Swimlane No 5、6红景天供试样1
Rhodiola sample1红景天软胶囊
Rhodiola Soft Capsule图5D，泳道编号1、2
Fig.5D，Swimlane No 1、2红景天供试样3
Rhodiola sample3红景天提取物口服液
Rhodiola extract oral liquid图5D，泳道编号5、6
Fig.5D，Swimlane No 5、6
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表 7 供试保健食品基因组测序比对结果
Table 7 Genome sequences of health food products
保健食品名称
Name of health food配料表宣称
所含目标植物
Target plants claimed in the
ingredient listGenBank数据库
GenBank Database中药材
DNA条形码数据库
DNA Barcode Database of
Chinese Medicinal MaterialsBLAST鉴定结果
BLAST identification
results相似度
Similarity/%GenBank登录号
GenBank Login
Number最佳匹配
Best Fit序列相似度
Sequence
similarity/%Score值
Score
value西洋参含片
American ginseng buccal tablet西洋参
American ginseng西洋参
American ginseng99 HQ112440.1 西洋参
American ginseng100.0 470.0 美国洋参含片
American ginseng buccal tablet西洋参
American ginseng西洋参
American ginseng97 MG217889.1 西洋参
American ginseng98.5 410.0 西洋参三七胶囊
Panax quinquefolium and
panax notoginseng capsules西洋参
American ginseng党参
Codonopsis pilosula98 EF190460 党参
Codonopsis pilosula98 403.0 西洋参淫羊藿枸杞子软胶囊
Panax quinquefolium epimedium and
wolfberry fruit soft capsules西洋参
American ginseng西洋参
American ginseng97 KM036297.1 西洋参
American ginseng99.1 460.0 西洋参三七口服液
American ginseng and
panax notoginseng oral liquid西洋参
American ginseng生晒参
Raw sun dried ginseng99 HQ112363.1 生晒参
Raw sun dried ginseng97.6 425.0 灵芝西洋参口服液
Ganoderma lucidum and
American ginseng oral liquid西洋参
American ginseng西洋参
American ginseng99 MG217889.1 西洋参
American ginseng100.0 440.0 人参提取口服液
Ginseng Extract Oral Liquid人参
Ginseng竹节参
Panax japonicus98 KX674924.1 竹节参
Panax japonicus99.7 435.0 人参氨基酸口服液
Ginseng Amino Acid Oral Liquid人参
Ginseng人参
Ginseng99 EU592017.1 人参
Ginseng97.4 447.0 人参三七含片
Ginseng and Sanqi Buccal Tablets人参
Ginseng人参
Ginseng100 MG218783.1 人参
Ginseng100.0 445.0 人参滴丸
Ginseng dropping pill人参
Ginseng人参
Ginseng100 MG283292.11 人参
Ginseng100.0 448.0 杞苓枣氨基酸口服液
Jujube Amino Acid Oral Liquid枸杞子
Chinese wolfberry枸杞子
Chinese98 JQ320160 枸杞子
Chinese wolfberry99.8 412.0 玛咖枸杞胶囊
Maca medlar capsule枸杞子
Chinese wolfberry枸杞子
Chinese99 JQ320155 枸杞子
Chinese wolfberry99.4 410.0 氨基酸枸杞片
Amino acid medlar tablet枸杞子
Chinese wolfberry枸杞子
Chinese99 JQ320172 枸杞子
Chinese wolfberry100.0 415.0 阿胶枸杞颗粒冲剂
Donkey hide gelatin and wolfberry granules枸杞子
Chinese wolfberry枸杞子
Chinese98 JQ320160 枸杞子
Chinese wolfberry98.9 416.0 森山铁皮枫斗颗粒
Senshan Iron Sheet Granules铁皮石斛
Dendrobium candidum铁皮石斛
Dendrobium candidum97 YQ76839 铁皮石斛
Dendrobium candidum98.7 457.0 九仙尊米斛枫斗浆
Nine Immortals Zun Rice
Dendrobium Maple Juice铁皮石斛
Dendrobium candidum金钗石斛
Dendrobium nobile98 UJ89765 金钗石斛
Dendrobium nobile99.8 461.0 铁皮枫斗口服液
Dendrobium candidum oral liquid铁皮石斛
Dendrobium candidum铁皮石斛
Dendrobium candidum99 YQ82313 铁皮石斛
Dendrobium candidum100.0 452.0 津玉石斛口服液
Jinyu Dendrobium Oral Liquid铁皮石斛
Dendrobium candidum铁皮石斛
Dendrobium candidum97 YQ78411 铁皮石斛
Dendrobium candidum100.0 459.0 铁皮石斛西洋参黄芪胶囊
Dendrobium candidum, American ginseng and
astragalus capsule铁皮石斛
Dendrobium candidum矩唇石斛
Dendrobium linawianum99 QD53678 矩唇石斛
Dendrobium linawianum98.2 423.0 红景天软胶囊
Rhodiola Soft Capsule红景天
Rhodiola红景天
Rhodiola99 AY545716 红景天
Rhodiola98.6 480.0 红景天西洋参口服液
Rhodiola and American Ginseng Oral Liquid红景天
Rhodiola轮叶景天
Sedum chauveaudii100 EU592006 轮叶景天
Sedum chauveaudii99.4 458.0 红景天提取物口服液
Rhodiola extract oral liquid红景天
Rhodiola红景天
Rhodiola98 AB088628 红景天
Rhodiola99.6 477.0 西洋参含片
American ginseng buccal tablet红景天
Rhodiola珠芽景天
Sedum bulbiferum97 AY352897 珠芽景天
Sedum bulbiferum98.7 481.0 美国洋参含片
American ginseng buccal tablet红景天
Rhodiola红景天
Rhodiola98 AY545712 红景天
Rhodiola99.0 469.0 Score: 离散匹配数值。
Score: Discrete matching value.
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