Cloning and Expression of LtGH88 in Lasiodiplodia theobromae
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摘要:目的 可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）是樟树溃疡病的主要致病菌。糖苷水解酶是病原菌与寄主植物互作过程中的关键因子。对可可毛色二孢糖苷水解酶基因LtGH88进行克隆与表达分析，为研究LtGH88在樟树溃疡病菌致病机制中的作用奠定基础。方法 采用PCR方法从可可毛色二孢侵染樟树枝干组织中获得LtGH88基因的CDS序列，运用生物信息学方法分析预测编码蛋白的特征和功能，通过qRT-PCR测定LtGH88在可可毛色二孢侵染樟树过程中的表达量；再利用农杆菌介导的烟草瞬时表达技术初步分析LtGH88基因的功能。结果 LtGH88基因编码序列长度为1 152 bp。其编码蛋白相对分子质量约为42.8 kDa，等电点（pI）为4.56，二级结构由49.09%的α螺旋、11.23%的延伸链和34.99%的无规则卷曲组成。蛋白N端包含18个氨基酸组成的信号肽，属于糖苷水解酶88（GH88）家族，能酶解果胶物质。LtGH88基因在樟树溃疡病菌侵染早期显著表达，不引起本氏烟叶片细胞坏死，且可抑制Bax引发的烟草叶片过敏性坏死反应。结论 糖苷水解酶LtGH88可能通过抑制寄主免疫反应促进溃疡病菌可可毛色二孢在樟树枝干中的侵入和定殖。Abstract:Objective The glycoside hydrolase gene LtGH88 of Lasiodiplodia theobromae was cloned to study the mechanism of canker in Cinnamomum camphora, which is the major pathogen that causes the disease.Methods The LtGH88 encoding sequence was cloned by PCR from tissues of C. camphora infected by L. theobromae to determine the characteristics and functions of the protein by bioinformatic methods. Expression of the gene was detected by real-time quantitative PCR, and functions analyzed using the Agrobacterium tumefaciens mediated transient transformation in Nicotianaben thamiana.Results The full open reading frame of LtGH88 was 1 152 bp with a molecular weight of 42.8 kDa and a theoretical isoelectric point of 4.56. The predicted secondary structure of the protein consisted of 49.09% α helix, 11.23% extended chain, and 34.99% random coil. A signal peptide of 1-18 amino acids was located at the N terminus. The protein belonged to the glycoside hydrolase family 88 (GH88) capable of degrading pectin. LtGH88 was significantly expressed in the early stage of the infection. It did not cause cell necrosis in the leaf of N. thamiana but was able to inhibit the hypersensitive response (HR) induced by Bax.Conclusion It was postulated that LtGH88 in L. theobromae inhibited the immune response of C. camphora facilitating the pathogenic invasion and colonization on the host plant.
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Keywords:
- Lasiodiplodia theobromae /
- LtGH88 /
- gene cloning /
- expression analysis /
- hypersensitive response
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0. 引言
【研究意义】樟树是我国亚热带地区的珍贵用材树种，在精油提取、园林绿化和生态文明建设等方面有重要的应用价值[1]。樟树溃疡病是樟树上危害最严重的枝干性病害，主要侵染幼嫩枝干未形成粗皮的苗木和新造幼龄林樟树，也可为害大树，造成溃疡、黑杆、枝枯和花斑等症状[2-3]。目前福建省内共发现4种可引起樟树溃疡病的真菌，分别为可可毛色二孢（Lasiodiplodia theobromae）、小新壳梭孢（Neofusicoccum parvum）、假可可毛色二孢（Lasiodiplodia pseudotheobromae）和L. iranensis，其中可可毛色二孢是樟树溃疡病主要致病菌 [4]。当前樟树溃疡病已对樟树产业发展产生了严重危害[5-7]。因此，研究樟树溃疡病菌可可毛色二孢的致病机理对樟树产业可持续发展具有重要意义。【前人研究进展】细胞壁是病原物侵入寄主植物的主要物理障碍之一，由多糖、蛋白质以及芳香族聚合物等物质组成。病原菌侵染寄主时可分泌多种细胞壁降解酶水解植物的细胞壁组分 [8-10]。其中参与多糖降解的酶主要是糖苷水解酶（Glycoside hydrolases，GHs），包括几丁质酶、纤维素酶、半纤维素酶等。植物病原菌分泌型GHs的种类与数量与其营养方式密切相关[11]。与半活体和死体营养型病原菌相比，活体营养型病原菌分泌较少数量的GHs[12]。植物病原菌GHs的多样性还与寄主植物细胞壁组成有关，双子叶植物的细胞壁比单子叶植物含有更多果胶物质，故其特异病原菌具有更多果胶酶，如GH28、GH88和GH105[13]。研究表明，GHs与植物病原菌致病力的关系极其复杂，是植物病原菌与寄主互作过程中的关键因子 [14-15]。【本研究切入点】糖苷水解酶88家族（Glycoside hydrolases 88 family，GH88）是以果胶为底物的不饱和葡萄糖酸水解酶。前期从樟树溃疡病菌可可毛色二孢侵染樟树枝干的早期转录组数据（另文发表）发现一个显著上调表达的糖苷水解酶基因LtGH88，其在可可毛色二孢致病过程中的作用有待深入探讨。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆LtGH88编码序列，分析其在溃疡病菌侵染樟树枝干时的表达情况，进一步构建农杆菌介导的烟草瞬时表达载体，初步分析其生物学功能，为探究樟树溃疡病菌糖苷水解酶LtGH88的致病作用奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
供试菌株、载体及植物：可可毛色二孢菌株JY-6（L. theobromae）由本实验室从具有典型溃疡病症状的樟树枝干上分离纯化；大肠杆菌感受态细胞（Escherichia coli，DH5α）、根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens GV3101 JA-Rep）购自TOLOBIO公司。供试的本氏烟草( Nicotiana benthamiana )由本实验室保存，在温室中培养，光周期16L∶8D，温度为25 ℃，出芽28 d时叶片用于瞬时表达。香樟（Cinnamomum camphora (Linn) Presl），种植于福建农林大学森林保护研究所苗圃中。
供试药剂：总RNA提取试剂盒、质粒小提试剂盒购自天根生化科技有限公司；反转录PCR试剂盒、一步克隆试剂盒ClonExpress ІІ One Step Cloning Kit、FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit胶回收试剂盒购自南京诺唯赞生物技术有限公司；内切酶Not I购自TAKARA生物技术公司；qRT-PCR试剂盒2×Q3 SYBR qRT-PCR Master Mix购自TOLOBIO公司；2-吗啉乙磺酸、乙酰丁香酮购于麦克林生化科技股份有限公司；MgCL2购于国药集团化学试剂有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 病原菌接种
将菌株从4 ℃冰箱取出，接种在PDA平板，于28 ℃培养3 d，待用。选取健康且长势基本一致的二年生樟树幼苗，采用针刺法在枝干上刺4个伤口，用直径6 mm 的打孔器在PDA平板上打出菌饼，将菌饼带菌丝接种在伤口处，用湿润的脱脂棉包扎，28 ℃、光周期12L∶12D保湿培养。分别在接种病菌后12、24、36 h，切取樟树枝干发病部位的韧皮部组织，−80 ℃液氮速冻。采用植物RNA 快速提取试剂盒提取总RNA，然后反转录为cDNA。获得的cDNA用于后续的基因克隆及表达量分析。
1.2.2 LtGH88的克隆与表达分析
根据可可毛色二孢LtGH88的cDNA 序列，采用Primer premier 6.0设计克隆及qRT-PCR引物（表1）。以上述cDNA 为模板扩增获得LtGH88，反应体系（25 μL）：cDNA 1 μL、上下游引物各1 μL、2× Rapid Taq Master Mix 12.5 μL、ddH2O 9.5 μL。反应程序：98 ℃预变性2 min；98 ℃变性10 s，65 ℃退火15 s，10个循环，每个循环降温1 ℃；72 ℃延伸10 s；再次98 ℃变性10 s；58 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，30个循环；2 ℃彻底延伸2 min，4 ℃保持。产物经1.0%琼脂凝胶电泳检测，回收纯化后与载体连接，转化大肠杆菌感受态DH5α，挑取阳性克隆进行测序验证。
表 1 本试验所用引物Table 1. Primers applied引物名称
Name引物序列
Primer（5′-3′）目的
PurposeLtGH88-F gatcctctagagattgcggccgcATGAAGT
TCTCTTCCGTTGCCG基因全长克隆 LtGH88-R acatcgtatgggtacgcggccgcAGCAGTGT
AGGCCTCGTACTCCLtGH88-qPCR-F CTACGGCAACAAGACCTAC 实时荧光定量 LtGH88-qPCR-R GAGGATGTCGTCCAGAGA Actin-F TGGTCGTACCACCGGTATTGTGTT 内参基因 Actin-R TCACTTGCCCATCAGGAAGCTCAT 实时荧光定量反应以侵染0 h（PDA平板上培养3 d的菌丝）为对照，以侵染12、24、36 h为试验组，并使用Actin基因作为内参基因。PCR反应体系（20 µL）：cDNA 2 µL，上下游引物各4 µL， 2×Q3 SYBR qRT-PCR Master Mix 10 µL。反应程序：95 ℃预变性30 s； 95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环；熔解曲线，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s，以2−△△Ct方法分析相对表达量。
1.2.3 生物信息学分析
采用EXPASY软件分析LtGH88蛋白质理化性质，利用SignalP 6.0 server（https://services.healthtec-h.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）预测蛋白信号肽，通过SOPMA（https://npsa-prab-i.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_aut-omat.pl?page=%20npsa_sopma.html）分析蛋白的二级结构，使用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）分析保守结构域。
1.2.4 烟草瞬时表达分析
利用限制性内切酶Not I将表达载体pGR-107线性化。采用一步克隆法将上述PCR 扩增产物连接在pGR-107载体上，连接产物转化至农杆菌GV3101，将阳性菌株于LB培养基中培养至OD600 nm为0.6左右，离心后收集菌体，以MMA缓冲液（10 mmol·L−12-吗啉乙磺酸、20 mmol·L−1乙酰丁香酮、10 mmol·L−1 MgCL2）重悬菌体至OD600 nm为0.6左右，28 ℃避光孵育2~3 h，用1 mL注射器将重悬液注入烟草下表皮，分别以空载和凋亡相关蛋白BCL-2关联X蛋白（BCL2-associated X protein，Bax）为阴性和阳性对照，3~4 d观察表型并拍照。同时将烟草叶片剪下放入锥形瓶中，用台酚蓝染色剂进行染色并拍照。
2. 结果与分析
2.1 LtGH88的克隆及生物信息学分析
以cDNA为模板，扩增获得长度为1 000 bp左右的片段（图1）。由生物信息学分析可知，LtGH88的编码框长1 152 bp，推定蛋白由383个氨基酸残基组成，相对分子质量约为42.8 kD，等电点（pI）为4.56，脂肪系数为79.30，不稳定系数为28.29，是一类稳定蛋白。蛋白二级结构和三结构分析结果显示，LtGH88蛋白是由49.87%的α螺旋、11.23%的延伸链和34.42%的无规则卷曲组成（图2）。此外，该蛋白含有一个保守结构域Glyco_ hydro_ 88，N端具有一段由18个氨基酸残基组成的假定信号肽（图3）。
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图 1 LtGH88基因的PCR 扩增结果M：DM 2000；1–3：LtGH88基因；4：阴性对照。Figure 1. PCR amplified product of LtGH88M: DM 2000; 1-3: LtGH88; 4: negative control.![]()
图 2 LtGH88蛋白的结构预测A：二级结构预测；B：三级结构预测。Figure 2. Prediction of LtGH88 structureA: Predicted secondary structure; B: tertiary structure.2.2 LtGH88 基因的表达分析
通过实时荧光定量PCR检测LtGH88 基因在溃疡病菌侵染樟树枝干后12、24、36 h 的表达情况。结果显示，LtGH88基因在病原菌侵染早期显著表达（图4）。推测LtGH88 基因在溃疡病菌早期侵染过程中发挥着重要的作用。
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图 4 LtGH88基因在病原菌侵染阶段的相对表达量Figure 4. Relative expressions of LtGH88 in L. theobromaeinfection2.3 农杆菌介导的瞬时表达
采用一步克隆法将LtGH88 基因连接到pGR-107载体上，并将其转化农杆菌GV3101，注射到烟草叶片。烟草瞬时表达结果显示（图5），LtGH88及阴性对照（GFP）烟草叶片注射区域未出现坏死，LtGH88注射24 h再注射Bax也未出现坏死斑点，而阳性对照Bax注射3~4 d后可见清晰坏死迹象，Bax注射24 h再注射LtGH88区域也出现坏死迹象，说明LtGH88不引起细胞坏死，且可抑制Bax引起的烟草烟叶片细胞死亡。
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图 5 LtGH88蛋白可抑制Bax在烟草中诱导的超敏反应A：烟草注射表型；B：台酚蓝染色结果。Figure 5. Bax-induced HR in N. benthamiana suppressed by LtGH88A: Phenotype of N. benthamiana after injection; B: after being dyed with trypan blue.3. 讨论与结论
糖苷水解酶GHs广泛存在于生物体中，通过内切或外切水解多糖底物的糖苷键生成单糖或寡糖。近年来，人们对植物病原菌GHs的功能做了一些研究，发现GHs在病原菌侵染过程中的作用机制不尽相同[15-16]。某些GHs 可作为病原菌的毒力因子，分解细胞壁，促进病原菌的侵入定殖。有些GHs则直接充当病原体相关分子模式（Pathogen-associated molecular patterns，PAMPs）或水解细胞壁释放损伤相关分子模式（damage associated molecular patterns，DAMPs）激活植物的一系列抗病反应。另一些病原菌则产生水解酶特异性结合或分解PAMPs，进而抑制植物的免疫反应。如可可毛色二孢（L. theobromae）糖苷水解酶基因LtGH61A 的下调表达可导致病原菌菌丝生长速率减小，对葡萄枝干的致病力也明显减弱[17]。苹果腐烂病菌（Valsa mali）中GH10 家族蛋白内切β-1,4-木聚糖酶基因VmXyl1的缺失，并不影响菌丝生长，但显著减少病原菌分生孢子器的形成，降低了对苹果叶片和嫩枝的毒力[18]。稻瘟菌分泌的葡聚糖内切酶MoCel12A 和MoCel12B 通过降解水稻细胞壁的半纤维素，释放可作为特异DAMPs的寡糖分子，从而激活水稻细胞免疫反应[19]。可可丛枝病菌（Moniliophthora perniciosa）和可可灰色果腐病菌（Moniliophthora roreri）分别进化出几丁质酶MpChi 和MrChi，它们能够结合底物几丁质，却丧失了降解酶的活性，即通过竞争性结合几丁质片段，阻断其触发的植物免疫反应[20]。本研究发现糖基水解酶LtGH88基因在樟树溃疡病菌可可毛色二孢侵染早期高表达，进一步研究显示LtGH88不能引起本氏烟叶片细胞坏死，且可抑制Bax引起的细胞死亡，由此推测LtGH88可能通过抑制寄主免疫坏死反应促进病原菌的定殖，但其具体功能仍需进一步探究。
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图 1 LtGH88基因的PCR 扩增结果
M：DM 2000；1–3：LtGH88基因；4：阴性对照。
Figure 1. PCR amplified product of LtGH88
M: DM 2000; 1-3: LtGH88; 4: negative control.
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图 2 LtGH88蛋白的结构预测
A：二级结构预测；B：三级结构预测。
Figure 2. Prediction of LtGH88 structure
A: Predicted secondary structure; B: tertiary structure.
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图 4 LtGH88基因在病原菌侵染阶段的相对表达量
Figure 4. Relative expressions of LtGH88 in L. theobromaeinfection
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图 5 LtGH88蛋白可抑制Bax在烟草中诱导的超敏反应
A：烟草注射表型；B：台酚蓝染色结果。
Figure 5. Bax-induced HR in N. benthamiana suppressed by LtGH88
A: Phenotype of N. benthamiana after injection; B: after being dyed with trypan blue.
表 1 本试验所用引物
Table 1 Primers applied
引物名称
Name引物序列
Primer（5′-3′）目的
PurposeLtGH88-F gatcctctagagattgcggccgcATGAAGT
TCTCTTCCGTTGCCG基因全长克隆 LtGH88-R acatcgtatgggtacgcggccgcAGCAGTGT
AGGCCTCGTACTCCLtGH88-qPCR-F CTACGGCAACAAGACCTAC 实时荧光定量 LtGH88-qPCR-R GAGGATGTCGTCCAGAGA Actin-F TGGTCGTACCACCGGTATTGTGTT 内参基因 Actin-R TCACTTGCCCATCAGGAAGCTCAT 
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