0.   引言

【研究意义】干旱和盐害等非生物胁迫通常导致植物失水，从而对植物的生长发育产生不利影响^[1]。随着经济的发展，严重的工业污染和不合理的农业生产活动增加了土壤盐分^[2]。土壤盐分会增加土壤的渗透压，引起植物的生理干旱，抑制其正常生长。过量的盐离子会渗入植物体内并积累，还会发生离子拮抗作用，阻碍和破坏正常的生理代谢，导致植物缺陷或死亡^[3]。因此，深入研究植物的抗盐机理对于提高植物在盐碱环境中的存活率和生产性能具有重要意义。【前人研究进展】水通道蛋白（Plasma membrane intrinsic proteins，PIPs）是主要内在蛋白家族 （Major intrinsic proteins, MIPs）亚家族的一员，能够调节植物细胞间的水分平衡，参与渗透胁迫反应，调节气孔运动，在植物胁迫响应中发挥重要作用^[4]。盐胁迫会导致气孔导度和叶肉导度迅速下降，影响CO₂和H₂O在叶肉细胞内的扩散，降低植物光合呼吸速率，水通道蛋白介导的细胞渗透压变化有助于调节气孔运动，调节植物蒸腾作用，最终促进植物和农作物的生长^[5-6]。一些水通道蛋白可参与O₂运输，缺氧后O₂转运水通道蛋白PIP转录水平的增加有助于改善根通气，促进植物的生长^[7]。可见，胁迫下PIP可通过表达量的高低影响植物的生理指标，以此来调节生长发育过程，如气孔运动、光合作用、蒸腾作用等，同时可通过水分的吸收和外排平衡植物细胞间的水分，从而在植物抗逆境胁迫中发挥重要的作用。中国沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）为胡颓子科（Elaeagnaceae）沙棘属（Hippophae L.）的落叶灌木或乔木，具有抗风沙、抗旱、耐盐碱等特性，因此，在我国西北地区种植较多，常被选为沙漠绿化树种以保持和恢复水土。有研究表明盐胁迫下沙棘的脯氨酸含量增加、渗透势降低、渗透适应性增加^[8]，可见沙棘有一定的耐盐性。【本研究切入点】目前有关中国沙棘在盐胁迫下的生理生化指标的变化以及中国沙棘HrPIP基因在盐胁迫下的表达模式有待进一步研究探讨。【拟解决的关键问题】本研究以两年生中国沙棘扦插苗为试验材料，对正常条件及不同程度盐胁迫下的中国沙棘叶片生理指标和不同组织中HrPIP基因的表达模式进行测定和分析，探讨HrPIP基因在盐胁迫下的潜在作用，以期为沙棘耐盐机制及HrPIP的功能研究奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

本试验所用材料两年生中国沙棘扦插苗种植于青海省西宁市大通县城关苗圃（37°14′45″N，101°30′15″E，海拔2920 m）。EASYspin Plus 植物 RNA 快速提取试剂盒购自艾德莱生物科技（北京）有限公司；TaKaRa PrimeScript^®Ⅱlst Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司；PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser （Perfect Real Time）试剂盒购自宝日医生物技术（北京）有限公司。

1.2   试验方法

1.2.1   胁迫处理及样本采集

中国沙棘扦插苗于2021年4月移栽定植于青海省玛可河育苗基地温室内，盆土由原土和育苗基质配制而成，移栽前在盆底加适量有机肥，定植完成后浇灌定根水，抚育期间每4 d浇一次水，15 d浇灌一次Hoagland营养液（青岛青药生物工程有限公司）。2021年7月中旬开始盐胁迫处理，选取54株生长健壮、长势一致的沙棘幼苗，分为对照组（CK）和胁迫组（SS1～SS5），分别浇灌浓度为0、200、400、600、800、1000 mmol·L⁻¹的NaCl溶液500 mL进行盐胁迫处理。第一次盐溶液浇灌后于第3天进行第二次盐溶液浇灌。胁迫期间每天称量测定每盆失水量，加清水补充，盆底放托盘，以便将渗出的溶液倒回花盆中，以防水分和盐分的流失，保持土壤相对含水量为田间持水量（36%）的60%～80%。两天后选择一致的苗木分为两组，一组采集各胁迫下植株中上部完整、无残缺的叶片置于冰盒带回实验室用于生理指标的测定；另外一组采集不同胁迫处理的植株的根、茎、叶，用超纯水清洗干净后用滤纸吸干水分，迅速投入液氮中速冻后于−80 ℃保存，用于基因表达模式研究，每个处理3次重复。

1.2.2   生物信息学分析

HrPIP蛋白的基本理化性质和亲疏水性采用ExPASy数据库的ProtParam和ProtScale工具进行分析，包括分子质量、等电点、脂肪系数等。使用 SignalP 5.0、TMHMM2.0和Cell-PLoc分别对蛋白质进行信号肽分析、跨膜结构域分析和亚细胞定位。使用SPOMA预测蛋白质的二级结构。使用NetPhos3.1寻找蛋白质磷酸化位点。

1.2.3   生理指标测定

烘干称重法测定叶片相对含水量^[9]，电导率法测定叶片质膜透性^[9]，丙二醛含量采用硫代巴比妥酸法（TBA）测定^[9]，叶绿素含量采用分光光度法测定^[9]。

1.2.4   基因表达模式

用EASYspin Plus植物RNA快速提取试剂盒进行总RNA的提取。电泳和微量核酸蛋白仪检测RNA质量和浓度，将提取的RNA稀释至150 ng·μL⁻¹，用PrimeScript^® II 1st Strand cDNA Synthesis Kit反转录，根据中国沙棘HrPIP基因序列设计荧光定量PCR引物（F：5′-CCAATAAAAGGTCCAACCCAGA-3′，R：5′-GTGTTCATGGTTCATTTGGCTAC-3′），以不同盐浓度处理的中国沙棘根茎叶为材料进行HrPIP基因的表达分析，2^−ΔΔCT法^[10]计算基因的表达量。

1.3   数据分析

数据采用Excel、SPSS软件进行统计分析。

2.   结果与分析

2.1   HrPIP编码蛋白基本理化性质

HrPIP基因编码110个氨基酸， 其中丝氨酸（Ser）数量最多（13.6%），苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）数量最少（0.9%）；其中带负电荷氨基酸残基（天冬氨酸Asp +谷氨酸Glu）共3个，带正电荷氨基酸残基（精氨酸Arg+赖氨酸Lys）11个；蛋白质脂肪系数为100.18，编码蛋白分子量为11607.69 Da，理论等电点（pI）为9.81，蛋白总平均亲水性（GRAVY）为0.220，为疏水性蛋白（图1），其中第64位氨基酸疏水性最强（2.500），而第35位氨基酸亲水性最强（−2.200）。

图  1  HrPIP蛋白亲疏水性分析

Figure  1.  Hydrophobicity of HrPIP

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   HrPIP蛋白的信号肽和跨膜结构域预测及亚细胞定位

根据SignalP5.0对HrPIP蛋白信号肽的预测结果，表明该蛋白信号肽存在的可能性为0.24%，说明中国沙棘HrPIP蛋白不存在信号肽，属于非分泌蛋白。利用 TMHMM 进行中国沙棘HrPIP蛋白跨膜区的预测，结果表明其无跨膜结构（图2）。使用Cell-PLoc预测中国沙棘HrPIP蛋白亚细胞定位在细胞膜上，符合HrPIP作为水通道蛋白的功能特征。

图  2  HrPIP蛋白跨膜结构域预测

Figure  2.  Predicted transmembrane region of HrPIP

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   HrPIP蛋白的二级结构

使用SPOMA软件对HrPIP蛋白二级结构进行预测分析发现，该基因编码蛋白中的α-螺旋占31.82%，无规则卷曲占54.55%，延伸链占13.64%（图3），说明α-螺旋和无规则卷曲是HrPIP 蛋白二级结构主要构象单元。

图  3  HrPIP蛋白二级结构预测

蓝色区域：α-螺旋；红色区域：延伸链；紫色区域：无规则卷曲。

Figure  3.  Predicted secondary structure of HrPIP protein

Blue regions: α-helix; red regions: extended strand; purple regions: random coil.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   HrPIP蛋白的磷酸化位点

使用NetPhos3.1预测HrPIP蛋白的磷酸化位点，当阈值为0.5时，预测该蛋白共有20个磷酸化位（图4），包括8个苏氨酸（Threonine）、11个丝氨酸（Serine）和1个酪氨酸（Tyrosine）。

图  4  HrPIP蛋白磷酸化位点预测

红色为丝氨酸磷酸化位点；绿色为苏氨酸磷酸化位点；紫色为酪氨酸磷酸化位点；粉色线为阈值。

Figure  4.  Predicted phosphorylation site in HrPIP protein

Red indicates serine phosphorylation site; green, tyrosine phosphorylation site; purple, threonine phosphorylation site; pink line, threshold value.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   盐胁迫下中国沙棘生理指标变化

盐胁迫对中国沙棘生理指标的影响见图5。

图  5  盐胁迫下中国沙棘生理指标的变化

不同大写字母表示不同处理在0.01水平差异极显著。

Figure  5.  Changes on physiological indexes of H. rhamnoides under salt stress

Different uppercase letters indicate significant difference at 0.01 level.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

不同程度盐胁迫下中国沙棘叶片的相对含水量（Relative water content，RWC）变化曲线见图5-a。由图可知随着盐胁迫程度的加深，RWC呈现出逐渐下降的趋势，在1000 mmol·L⁻¹时达最低值10.41%。统计分析显示盐胁迫对中国沙棘叶片相对含水量影响差异极显著（P＜0.01）。

盐胁迫下中国沙棘叶绿素含量变化曲线见图5-b，由图可见，随着盐胁迫浓度的升高，中国沙棘叶绿素（Chlorophyll content, Chl）含量总体呈先下降后升高的趋势，在800 mmol·L⁻¹时达最低值1.22 mg·g⁻¹，在800～1000 mmol·L⁻¹的范围内，Chl含量呈现较大幅度的增长，但仍然低于对照（CK）植株叶片中的Chl含量，显示盐胁迫对中国沙棘叶绿素含量影响差异极显著（P＜0.01）。

不同盐胁迫下中国沙棘质膜透性见图5-c，由图可知在0～600 mmol·L⁻¹的范围内膜透性变化不大，呈现先略升高后又略下降的趋势，其中在600 mmol·L⁻¹的盐胁迫处理下的质膜透性达最小值10.67%；在600～1000 mmol·L⁻¹的范围内，质膜透性呈现直线式陡增的发展趋势，在1000 mmol·L⁻¹处理下达到最大值52%。统计分析显示盐胁迫对中国沙棘叶片膜透性影响差异极显著（P＜0.01）。

盐胁迫下中国沙棘丙二醛含量见图5-d。由图可知随着盐浓度的升高，MDA含量总体呈先下降后升高再下降的趋势，其中400 mmol·L⁻¹浓度下达最小值5.72 μmol·L⁻¹，在400～800 mmol·L⁻¹急剧升高，并在800 mmol·L⁻¹时达最高值8.45 μmol·L⁻¹，盐浓度继续升高时MDA含量又呈下降趋势，但仍显著高于CK。统计分析显示盐胁迫对中国沙棘丙二醛含量影响差异极显著（P＜0.01）。

2.6   中国沙棘HrPIP基因表达模式

不同浓度盐胁迫下中国沙棘HrPIP基因表达情况见图6。由图可见，在盐胁迫下，根中HrPIP基因表达随盐浓度提高持续上升，至600 mmol·L⁻¹时达最大值，而后在800 mmol·L⁻¹时略有下降，在1000 mmol·L⁻¹时又略有升高；在叶中，低浓度胁迫下其表达呈下降的趋势，在400 mmol·L⁻¹时表达量最低，而后开始快速上升，在800 mmol·L⁻¹浓度时达最大值，随后又急速下降；在茎中，HrPIP基因表达呈M型，分别在200 mmol·L⁻¹和800 mmol·L⁻¹时达到两个峰值。方差分析结果表明HrPIP基因不同浓度盐胁迫下的表达差异极显著（P＜0.01），在不同组织中的表达差异显著（P＜0.05）。

图  6  HrPIP基因在中国沙棘根茎叶中的表达模式

不同大写字母表示不同胁迫处理下差异极显著（P＜0.01），不同小写字母表示不同组织之间差异显著（P＜0.05）。

Figure  6.  Expressions of HrPIP in roots and leaves of H. rhamnoides

Data with different capital letters indicate extremely significant difference under treatments (P＜0.01); those with different lowercase letters, significant difference between tissues (P＜0.05).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

中国沙棘作为我国西北地区重要的生态修复树种，具有很强的抗旱耐盐性，研究其抗逆基因在盐胁迫下的表达模式，可为研究中国沙棘耐盐机制奠定基础，对扩大其应用范围具有重要意义。

水通道蛋白在植物的生长、发育和胁迫响应中起重要作用，其中质膜内在蛋白（PIPs）主要负责水分的吸收和外排^[11]。相对于野生型番茄株系，转SlPIP2;1，SlPIP2;7，Slpip2; 5基因番茄在正常和胁迫条件下的导水率和存活率都较高，抗盐性较高^[12]；转LcPIP基因的露地菊植株的叶片和根中的PIP基因表达量均较野生型高，且植株保护酶活性提高更为明显，MDA的含量增幅较野生型低，表现出较强的抗性^[13]；盐胁迫下转海篷子SbPIP1基因小麦株系脯氨酸含量的合成增加，MDA含量整体呈现下降趋势，降低了膜酯的过氧化^[14]。由上述研究结果可见，在盐胁迫下，PIP基因可通过对植株的种子萌发、存活率、导水率、组织结构、保护酶活性等指标的调节来提高植株耐受盐胁迫的能力。

本研究对两年生的中国沙棘扦插苗进行不同程度的盐胁迫处理，测定生理指标并通过qRT-PCR对HrPIP基因表达模式进行研究。生理指标结果表明，盐胁迫下中国沙棘叶片相对含水量随着盐胁迫的加深逐渐下降，但在200～600 mmol·L⁻¹盐浓度下，相对含水量变化不大，说明中国沙棘具有一定的耐盐性；600～1000 mmol·L⁻¹时相对含水量快速下降至最低值，植株体内过度失水。盐胁迫还会影响叶绿素的合成和加速叶绿素的降解速度，造成叶绿素含量下降^[15]。中国沙棘叶绿素含量在0～200 mmol·L⁻¹时略有增加，表明中国沙棘具有一定的耐盐性，对低浓度的盐胁迫有一定的抵御能力；200～800 mmol·L⁻¹时逐渐降低，表明在中、高浓度盐胁迫作用下会发生结构和功能断裂导致叶绿素合成降低。盐胁迫下膜脂过氧化会破坏细胞膜，而质膜透性以及MDA的含量都能反映出植物在逆境中受到伤害的程度^[16]，二者值越高说明植物受逆境伤害越大。200～600 mmol·L⁻¹盐浓度下质膜透性和MDA变化幅度不大，说明中国沙棘受逆境伤害不大，耐盐性较强；盐浓度大于600 mmol·L⁻¹时，质膜透性急剧升高，MDA增加，说明高浓度盐对植株造成伤害。

HrPIP基因在不同盐浓度处理的中国沙棘根、茎、叶中的表达除在800 mmol·L⁻¹时叶中的表达量显著大于根外，总体而言根的基因表达量大于叶和茎，这与冉昆等^[17]对于杜梨质膜水孔蛋白基因的研究相似。对胡杨幼株根、茎、叶的水通道蛋白的响应研究也证明根系对盐胁迫的敏感性高于茎和叶^[18]，同样的研究结果在茶树中也得到证实^[19]。根系是植物吸收转运水分和矿质元素的重要部位，水通道蛋白基因在根中的高表达反映了植物根系在盐胁迫下较强的吸收水分的能力^[19]。沙棘的根系发达且深入地下，能耐旱、耐盐碱、耐贫瘠，本试验中根的基因表达量最大，说明盐胁迫下中国沙棘的根吸收水分和营养物质的能力较强，表现出较强的耐盐性。此外，在中国沙棘根和叶中，基因的表达量先增加后降低，这与颜培玲等^[20]对野生毛葡萄在干旱胁迫下PIP基因的表达模式研究趋势相似。盐胁迫初期，中国沙棘在诱导与抗逆信号转导相关的其他基因的表达的同时，可能通过提高HrPIP的表达量，增加膜的透性，提高细胞对水分的吸收；随着盐浓度的增加，HrPIP表达量降低，细胞内的水分排出减少，使植物体内的水分维持在最小限度的平衡状态，使植株的抗胁迫能力增加。由此可见，HrPIP基因在中国沙棘的抗盐过程中起着重要的作用。

盐胁迫下沙棘茎中HrPIP基因的表达量低于根和叶，其原因可能是因为在盐胁迫导致的植物脱水的情况下，植物体在不同的植物组织尤其是根部和叶片中，主要通过地下部分的吸水能力和地面上部的保水能力来维持体内的水分平衡，从而演化出一系列应对胁迫的生理和遗传策略^[21]。根是最先感知缺水的器官，对水和养分的吸收有相应的调节作用^[22-23]；且植物根系具有可塑性，植物为了适应环境的变化，通过一定的方式对根系形态进行调控，使之在不同程度上发生变化^[24]。如根系可在水分有限的情况下进行表型及结构修饰，增加根系与水分接触的表面积，增强水分的获取，使水分利用保持正常^[22-23]。叶是光合和蒸腾作用的主要器官，在胁迫下叶片可通过萎蔫、气孔关闭、角质层蜡沉积和减少光合作用来减少水分流失^[22-23]。而茎中分布着大量导管和筛管以输送水分和营养物质，并在根和叶之间起着传导和支持作用。由此推测，在沙棘遭受盐胁迫时，根、叶最先遭受胁迫反应，其中，根先感知到水分胁迫，通过HrPIP基因的表达加速对水分的吸收，茎则通过基因表达加速水分的运输，而叶中基因表达提高促进气孔闭合，降低了蒸腾效应，增加膜透性，提高水分吸收。有关HrPIP基因功能分析还需进一步通过转基因手段深入研究以阐明中国沙棘耐盐机制。