Control on Maize Stalk Rot and Effects on Soil Microbes of Paenibacillus polymyxa
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摘要:目的 探明多粘类芽孢杆菌NPDY05-8灌施土壤后对玉米茎基腐病的防治效果，及该菌在土壤中定植情况和对土壤的细菌和真菌等微生物群落的影响。方法 利用Illumina MiSeq 高通量测序技术，以未灌施菌株NPDY05-8和种植花生轮作的土壤为对照，对灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8试验地土壤的细菌及真菌群落组成结构进行研究分析。结果 该菌株对玉米茎基腐病的田间防治效果在2021年达90.92%，2022年达95.68%，显著优于化学药剂的防效。土壤菌群分析结果显示菌株NPDY05-8能够在土壤中定植，且长期存在于土壤当中。施用菌株NPDY05-8一年Y1和30日Y2的土壤细菌多样性OTUS分别为1 096个和1 149个，均高于未施用菌株的土壤Y3的973个及轮作土壤的941个；赤霉菌属的丰度Y1为4.15%、Y2为8.76%，均低于未施用菌株的土壤Y3的17.18%；镰刀菌属的丰度Y1为0.80%、Y2为1.12%，均低于未施用菌株的土壤Y3的2.17%；施用菌株一年的土壤与施用菌株30日的土壤在细菌和真菌水平的相关性指数高，距离最近。结论 灌施菌株NPDY05-8能改变土壤的真菌及细菌的种群结构，控制有害真菌，达到持久改良土壤和防治土传性真菌病害的目的。Abstract:Objective Control on maize stalk rot and effects on soil microbial communities by the addition ofPaenibacillus polymyxa in soil were studied.Method On a peanut rotational cultivation field, composition and structure of the microbial communities in the soil were determined using the illumina MiSeq high-throughput sequencing technique to compare with those on the land incorporated with P. polymyxa NPDY05-8.Result The disease control on the maize stalk rot by addition of NPDY05-8 in soil reached 90.92% in 2021 and 96.58% in 2022 as shown by the experiment. Those were significantly more effective than what was achieved by using chemical treatments. NPDY05-8 continued to present in soil after the colonization in a year (Y1) with an OTU of 1 096 and in 30-d (Y2) of 1 149, which were significantly higher than control (Y3) of 941. Meanwhile, the population of Gibberella at 4.15% in Y1 and 8.76% in Y2 were significantly lower than that in Y3 at 17.18%; and that of Fusarium at 0.80% in Y1 and 1.12% in Y2, significantly lower than that in Y3 at 2.17%.Conclusion Addition of NPDY05-8 in maize field altered the microbial community in the soil that significantly provided a lasting control effect on the pathogenic fungi for maize farming.
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0. 引言
【研究意义】中国每年的玉米产量超过2.6亿t，占全国粮食产量近40%，是我国第一大粮食作物[1]。玉米茎基腐病又称玉米青枯病，是由多种病原菌复合侵染引起的典型土传病害，一直对玉米产业构成严重威胁，是危害世界玉米生产的主要病害[2]。目前，玉米茎基腐病在玉米生产上已成为继玉米大、小斑病和丝黑穗病后又一重要病害，各玉米产区茎基腐病仍呈逐年加重的发生趋势[3]。不同生态地区的玉米茎基腐病病原菌有所差异，禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）和腐皮镰刀菌（Fusarium solani）是主要的致病菌。目前，玉米茎基腐病的防治主要依靠化学防治[4]和抗病品种[5]，但由于玉米品种的多样性及差异性，导致针对性的品种抗病很难实现；而化学防治长期施用易导致病原菌抗药性的产生，以及农药残留、环境污染和土壤微生物种群减少等一系列问题[6]。微生物菌可通过产生的抗菌物质和位点竞争的作用方式杀死和控制病原菌，且具有活性高、环境污染小以及不易产生抗药性等特点，是防治玉米茎基腐病的发展方向。【前人研究进展】土壤中存活着多种病原菌，病原菌的数量与活性影响土壤微生物群落结构的稳定，进而影响农作物土传病害的发生[7-8]。近年来，微生物菌剂被广泛用于土壤微生物环境，用于促进作物生长和防治土传病害[9]。多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）属芽孢杆菌科（Bacillaceae）类芽孢杆菌属（Paenibacillus），是一类重要的根际有益菌[10-12]，对人和动植物没有致病性[13]，美国环保署将其列为可商业应用的微生物之一，我国农业农村部也将其列为免做安全鉴定的一级菌种[14]。多数研究者认为多粘类芽孢杆菌为土壤中的活跃菌，容易在土壤中定殖和繁殖，在土壤的物质和能量循环中发挥重要作用，其代谢产物不仅能够有效抑制病害而且能促进植物的生长发育；且它具有溶磷和固氮作用，能够增加土壤肥力和调节土壤微生态，促进植物生长，进而增强植物抵抗力[15-16]。【本研究切入点】本项目组从福建省南平市建阳区南平市农业科学研究所试验基地赤霉病抗性鉴定圃的土壤分离出1株广谱拮抗真菌的多粘类芽孢杆菌，命名为NPDY05-8，该菌对多种病原真菌具有强抑制效果，同时对引起玉米茎基腐病的禾谷镰刀菌和腐皮镰刀菌都有很强抑制率，然而关于该菌对玉米茎基腐病的田间防治效果及该菌在土壤中定殖情况和对土壤的细菌及真菌等微生物群落的影响还有待深入研究。【拟解决的关键问题】探讨多粘类芽孢杆菌NPDY05-8灌施土壤后在土壤中的定殖情况，并研究其对土壤微生物中的细菌及真菌群落组成结构和分布规律的影响，以期为该菌株对土壤菌群的改造和防治土传型真菌病害提供有效的理论依据，为多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的利用提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 菌株来源
菌株NPDY05-8是由福建省南平市建阳区童游街道南平市农业科学研究所植保研究室分离并保藏，菌种保藏号（CCTCC NO：M2023740）。
1.1.2 试验地点
试验地点位于福建省南平市建阳区南平市农业科学研究所溪口山玉米试验地（27°20′N， 118°07′E），该基地为长年种植玉米地的田块，连续6年发生玉米茎基腐病，严重年份感病玉米品种倒伏率高达60%以上。
1.1.3 培养基
稻秸秆培养液：3 cm稻草干秸秆20 g，定容至1 000 mL，121 °C高压灭菌20 min。
1.2 试验方法
1.2.1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防效
试验于2021—2022年在福建省南平市农业科学研究所溪口山玉米试验地进行，供试玉米为高感茎基腐病品种金玉1233，两年均于春季4月上旬播种，在玉米小喇叭口期对不同处理进行灌根施药，7 d后重复施药1次，共设4个处理，每个处理3个重复，每个重复面积13 m2。处理1：菌株NPDY05-8的稻秸秆培养液灌根（土壤浇施有效成分含量3×1013 cfu·hm−2）；处理2：l5%乙蒜素可湿性粉剂2000倍液灌根；处理3：15%多菌灵可湿性粉剂5000倍液灌根；处理4（对照CK）：清水灌根。在大喇叭口期对防治效果进行调查。采用5点取样法，每小区定点调查50株，调查记录总株数、发病株数、病茎级数，计算病情指数和防治效果。采用IBM SPSS Statistics 19系统进行单因素方差分析，分析不同处理对玉米茎基腐病防治效果差异，根据病级计算病情指数：
病情指数/%=[Σ（各级病株数×各级级数）/（调查总株数×9）]×100；
防治效果/%＝[（对照组平均病情指数-处理组病情指数）/对照组平均病情指数]×100[16]。
1.2.2 土壤样本采样及高通量测序
土壤样品采集于2022年5月30日，4个处理用铁铲挖至地下深度 10、20 cm 的种植土层，分别编号为Y1（2021年施用多粘类芽孢菌株NPDY05-8，已施用1年，2021~2022年均种植玉米）、Y2（2022年施用多粘类芽孢菌株NPDY05-8，已施用30 d，2021-2022年均种植玉米）、Y3（未施用多粘类芽孢菌株NPDY05-8，2021~2022年均种植玉米）、Y4（未施用多粘类芽孢菌株NPDY05-8，2021年种植玉米，2022年种植花生进行轮作），每块试验地采取5点采样法取土壤封于无菌袋中，每个处理3个重复，土壤样本冰袋保存带回实验室，−20 ℃冰箱保存，采样后的土壤寄送生工生物工程（上海）股份有限公司，通过 Illumina MiSeq 测序平台进行高通量测序。
2. 结果与分析
2.1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防效
多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防效见表1，菌株NPDY05-8灌根处理后对玉米茎基腐病的防治效果在2021年达90.92%，2022年达95.68%，显著高于15%乙蒜素可湿性粉剂的55.71%和51.63%的防效，同时也高于15%多菌灵可湿性粉剂的54.90%和49.49%的防效。对照处理、15%乙蒜素可湿性粉剂和15%多菌灵可湿性粉剂处理均有发现玉米倒伏，但菌株NPDY05-8灌根处理的小区两年均未出现玉米倒伏的情况，仅在近地的茎部发现少量云纹状病斑，防治效果显著优于2种化学药剂。
表 1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防效Table 1. Field efficacy of NPDY05-8 against maize stalk rot年份 Year 药剂 Pesticide 病情指数 Disease indexes/% 防治效果 Prevention effect/% 2021 菌株NPDY05-8 Strain NPDY05-8 3.23 ± 0.34 a 90.92 ± 0.65 a l5%乙蒜素可湿性粉剂 15% Ethylicin wettable powder 16.09 ± 0.45 b 55.71 ± 1.14 b 15%多菌灵可湿性粉剂 15% Carbendazim wettable powder 16.39 ± 1.53 b 54.90 ± 8.51 b 清水Clean water(CK) 36.68 ± 0.68 c 2022 菌株NPDY05-8 Strain NPDY05-8 1.04 ± 0.17 a 95.68 ± 0.71 a l5%乙蒜素可湿性粉剂 15% Ethylicin wettable powder 11.69 ± 2.05 b 51.63 ± 8.50 b 15%多菌灵可湿性粉剂 15% Carbendazim wettable powder 12.21 ± 2.83 b 49.49 ± 11.71 b 清水 Clean water(CK) 24.17 ± 0.93 c 同列数据后不同小写字母表示同一年份同一指标不同处理间差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences between treatments on same indicator in same year (P＜0.05).2.2 不同处理土壤的细菌和真菌的OTUS
不同处理土壤细菌和真菌的Alpha指数稀释性曲线图见图1，各样品的稀释曲线已经趋于平缓，即样本的OTUS的覆盖度已基本饱和，测序深度已包含所有物种，测序数据量达到反映样品中物种多样性要求。
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图 1 不同处理土壤细菌（A）和真菌（B）的Alpha指数稀释性曲线图Figure 1. Dilution plot of alpha index for bacteria (A) and fungi (B) in soil by treatments4个不同处理的根系土壤样本细菌的有效序列数分别为41 185、51 027、41 732、46 769，其中Y1为1 096个OTUS，Y2为1 149个OTUS，Y3为973个OTUS，Y4为941个OTUS，多样性分析结果（图1-A）显示，Y2的细菌多样性指数最高，Y1的细菌多样性仍能维持较高的指数，Y4的细菌多样性指数最低。
4个不同处理的根系土壤样本真菌的有效序列数分别为99 315、85 008、77 553、76 046，其中Y1为262个OTUS，Y2为299个OTUS，Y3为266个OTUS，Y4为190个OTUS，多样性分析结果（图1-B）显示，Y2的真菌多样性指数最高，Y3的真菌多样性指数次之，Y4的真菌多样性指数最低。
2.3 不同处理土壤的细菌和真菌的物种组成
4个处理土壤细菌物种分布韦恩图（图2-A）表明，4 个样品之间共同拥有622 个 OTUS，其中Y4的特有OTUS数目最多，为79个，即轮作的方式会提高土壤菌群的特异性；Y3的特有OTUS数目最少，为8个；Y1和Y2的共有OTUS数目最多，为988个，占Y1总OTUS数目的90.15%，占Y2总OTUS数目的85.99%，即用菌株NPDY05-8灌施玉米田块1年后在长时间内仍能保持菌群的结构。
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图 2 不同处理土壤样本细菌（A）和真菌（B）物种分布韦恩图Figure 2. Venn diagram on species distributions of bacteria (A) and fungi (B) in soil under treatments4个处理土壤真菌物种分布韦恩图（图2-B）表明，4 个样品之间共同拥有57个 OTUS， 其中Y2的特有OTUS数目最多，为95个；Y3的特有OTUS数目次之，为90个；Y1和Y2的共有OTUS数目最多，为154个，占Y1总OTUS数目的58.78%，占Y2总OTUS数目的51.51%。
2.4 不同处理土壤样本细菌和真菌样本相关性热度
不同处理土壤细菌样本相关性热度见图3-A，颜色块代表相关性指数值，颜色越灰表示样本间相关性指数越低，颜色越黄则相关性指数越高。Y1和Y2的细菌种类和结构（图3-A）的相关指数最高达0.81，聚类树的距离最近；Y4在聚类树上与其他3个处理的距离最远。
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图 3 不同处理土壤样本细菌（A）和真菌（B）样本相关性热图Figure 3. Heat map on correlation between bacteria (A) and fungi (B) in soil不同处理土壤真菌样本相关性热度见图3-B，Y1和Y2的真菌种类和结构（图3-B）的相关指数为0.33，聚类树的距离较近；Y3和Y4在聚类树的距离较近，相关指数为0.11。
2.5 不同处理土壤样本细菌和真菌各样本物种丰度
不同处理土壤样本细菌共检测到21个门，丰度水平较高的有16个，见表2。丰度最高的4个细菌门为变形菌门Proteobacteria、酸杆菌门Acidobacteria、放线菌门Actinobacteria和芽单胞菌门Gemmatimonadetes。其中，变形菌门在所有门中的丰度最高，不同处理Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为41.18%、31.52%、42.31%、30.57%，4个处理无显著差异；灌施多粘类芽孢菌株NPDY05-8的田块与未灌施的田块在门丰度上差异显著的主要为拟杆菌门Bacteroidetes、厚壁菌门Firmicutes和蓝藻门Cyanobacteria，其中拟杆菌门的相对丰度在4个处理的样品中分别为3.53%、3.45%、2.18%、3.95%，拟杆菌门在Y1，Y2，Y4间的差异较小，但与Y3间的差异显著；后壁菌门的相对丰度在4个处理的样品中分别为1.85%、2.95%、0.42%、2.14%、后壁菌门在Y2中的丰度最高，Y4和Y1次之，Y3最小；蓝藻门的相对丰度在4个处理的样品中分别为0.19%、1.11%、0.002%、0.09%，蓝藻门在Y2中的丰度最高，Y1次之，Y3最少。
表 2 不同处理土壤样本主要细菌在门水平上不同种群的相对丰度Table 2. Relative abundances of microbes at phylum level in soil项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 变形菌门 Proteobacteria 41.18 ± 1.43 a 31.52 ± 0.58 a 42.31 ± 2.33 a 30.57 ± 1.03 a 酸杆菌门 Acidobacteria 21.34 ± 1.05 ab 15.90 ± 1.41 b 17.34 ± 2.12 ab 28.05 ±1.23 a 放线细菌 Actinobacteria 8.25 ± 1.33 b 12.27 ± 2.56 ab 13.75 ±0.88 a 7.07 ±0.76 b 未分类的细菌 unclassified_Bacteria 11.08 ± 0.89 a 15.67 ± 1.36 a 12.22 ±1.18 a 8.87 ± 0.79 b 芽单胞菌门 Gemmatimonadetes 5.18 ± 0.66 b 3.10 ± 0.53 bc 2.92 ± 0.36 c 10.38 ± 1.22 a 拟杆菌门 Bacteroidetes 3.53 ± 0.53 a 3.45 ± 0.80 a 2.18 ± 0.69 b 3.95 ± 1.03 a 无中文名 Candidatus_Saccharibacteria 2.47 ± 0.26 a 1.99 ± 0.15 a 2.69 ± 1.01 a 0.84 ± 0.25 b 厚壁菌门 Firmicutes 1.85 ± 0.38 b 2.95 ± 0.09 a 0.42 ± 0.08 c 2.14 ± 0.08 b 绿弯菌门 Chloroflexi 1.80 ± 0.40 c 5.75 ± 0.70 a 3.77 ± 0.66 ab 1.57 ± 0.58 c 疣微菌门 Verrucomicrobia 1.24 ± 0.36 b 2.40 ± 0.55 ab 0.57 ± 0.06 c 3.52 ± 0.58 a 浮霉菌门 Planctomycetes 0.77 ± 0.19 b 2.43 ± 0.29 a 0.92 ± 0.08 b 1.15 ± 0.04 b 装甲菌门 Armatimonadetes 0.59 ± 0.05 a 0.34 ± 0.02 a 0.15 ± 0.01 a 0.47 ± 0.19 a 硝化螺旋菌门 Nitrospirae 0.35 ± 0.02 b 0.51 ± 0.04 b 0.35 ± 0.07 b 1.08 ± 0.08 a 蓝藻门 Cyanobacteria 0.19 ± 0.01 b 1.11 ± 0.18 a 0.002 ± 0.01 c 0.09 ± 0.02 b 同行数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。表3、4同。
Data with different lowercase letters on same row indicate significant differences between treatments (P＜0.05). The same as table3-4.不同处理土壤样本真菌共检测到5个门（表3），丰度水平较高的有3个，分别为子囊菌门Ascomycota，担子菌门Basidiomycota和被孢菌门Mortierellomycota。其中，子囊菌门在所有门中的丰度最高，不同处理Y1、Y2、Y3、Y4子囊菌门的相对丰度分别为33.53%、52.99%、67.93%、62.26%，4个处理间差异均达显著水平；灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的田块Y1、Y2在子囊菌门的丰度上均低于未灌施菌液的田块Y3与Y4，子囊菌门中半数种类为有害真菌，多粘类芽孢杆菌NPDY05-8灌施后有效减少了子囊菌门的丰度，对土壤中的有害致病真菌有潜在的防治潜力。担子菌门在门丰度水平中仅次于子囊菌门，不同处理Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为56.28%、32.00%、14.44%、30.54%，4个处理均表现显著差异，其中灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8一年的田块Y1的担子菌门丰度显著高于未灌施的田块Y3、Y4。
表 3 不同处理土壤样本主要真菌在门水平上不同种群的相对丰度Table 3. Relative abundance of major fungi at phylum level in soil under treatments项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 子囊菌门 Ascomycota 33.53 ± 1.57 d 52.99 ± 2.11 c 67.93 ± 1.93 a 62.26 ± 1.93 b 担子菌门 Basidiomycota 56.28 ± 2.67 a 32.00 ± 2.22 b 14.44 ± 2.50 c 30.54 ±2.27 b 被孢菌门 Mortierellomycota 8.33 ± 3.84 b 10.06 ± 1.66 a 11.24 ± 1.49 a 3.98 ± 0.85 b 壶菌门 Chytridiomycota 0.15 ± 0.06 c 1.94 ± 0.09 a 1.55 ± 0.19 b 0.36 ± 0.06 c 毛霉门 Mucoromycota 0.05 ± 0.03 c 0.26 ± 0.10 b 1.02 ± 0.15 a 0.09 ± 0.02 c 2.6 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8在土壤中的定殖情况
多粘类芽孢杆菌属于厚壁菌门Firmicutes芽孢杆菌纲Bacilli芽孢杆菌目 Bacillales芽孢杆菌科Bacillaceae类芽孢杆菌属Paenibacillus，观测不同处理样本在不同分类水平上的群落结构，以期判定多粘类芽孢杆菌NPDY05-8在土壤中的定殖情况。表4的结果显示灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的土壤样本Y1、Y2在门、纲、目、科、属的每个分类水平上的丰度值均显著高于未灌施菌液的土壤样本Y3，尤其在科级别的分类水平上，Y1、Y2、Y3、Y4的丰度值分别为0.40%、0.43%、0.02%和0.02%，Y1、Y2的丰度值为Y3、Y4的20倍；在属级别的分类水平上，Y1、Y2、Y3、Y4的丰度值分别为0.12%、0.26%、0.02%和0.02%，Y1、Y2的丰度值仍显著高于Y3、Y4。因此多粘类芽孢杆菌NPDY05-8灌施后能在土壤中定殖的可能性极大，且在长达一年的时间上仍能保持一定的丰度水平，即多粘类芽孢杆菌NPDY05-8能长期在土壤中定殖。
表 4 不同处理样本的类芽孢杆菌在不同分类水平上的丰度Table 4. Abundance of bacteria at different classification levels in soil under treatments项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 厚壁菌门 Firmicutes 1.85 ± 0.38 b 2.95 ± 0.09 a 0.42 ± 0.08 c 2.14 ± 0.08 b 芽孢杆菌纲 Bacilli 1.58 ± 0.26 a 1.91 ± 0.33 a 0.41 ± 0.12 b 1.28 ± 0.45 a 芽孢杆菌目 Bacillales 1.58 ± 0.26 a 1.91 ± 0.33 a 0.41 ± 0.12 b 1.28 ± 0.45 a 芽孢杆菌科 Bacillaceae 0.40 ± 0.09 a 0.43 ± 0.09 a 0.02 ± 0 b 0.02 ± 0 b 类芽孢杆菌属 Paenibacillus 0.12 ± 0.01 b 0.26 ± 0.01 a 0.02 ± 0 c 0.02 ± 0 c 2.7 镰刀菌属的相对丰度
镰刀菌属和赤霉菌属中包含土传型病害的致病力病原菌，也是玉米茎基腐病的主要致病菌，探究镰刀菌属和赤霉菌属的相对丰度的变化情况可以评估多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对土壤中有害菌的控制效果。赤霉菌属Gibberella和镰刀菌属Fusarium属于子囊菌门Ascomycota壳菌纲Sordarion1ycetes肉座菌目Hypocreales赤壳科Nectriaceae。4个处理样本的赤霉菌属和镰刀菌属所在的目、科、属水平相对丰度如图6所示。与未灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的处理样本相比，肉座菌目的4个处理样本Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为5.31%、11.03%、22.06%、6.35%，赤壳科4个处理样本Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为4.97%、10.33%、30.13%、5.82%，赤霉菌属4个处理样本Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为4.15%、8.76%、17.18%、3.84%，镰刀菌属4个处理样本Y1、Y2、Y3、Y4的相对丰度分别为0.80%、1.12%、2.17%、1.78%。其中，灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的Y1、Y2，及轮作花生处理的Y4，在4个分类上的相对丰度均显著低于未灌施菌液且仍持续种植玉米的处理Y3，从数据上看灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8一年的土壤样本的赤霉菌属和镰刀菌属的丰度最低，说明多粘类芽孢杆菌NPDY05-8在施用后能够长期控制土壤中的有害菌。轮作花生的田块赤霉菌和镰刀菌的丰度分别为3.84%和1.78%，轮作田块有害真菌数量少的原因为该田块种植花生，没有种植赤霉菌和镰刀菌的寄主营养植物，一旦恢复种植玉米有可能有害真菌的数量再度提高。综上，多粘类芽孢菌株NPDY05-8对于控制土传型病害的真菌有显著的效果，且改良的土壤能在长时间内持续控制有害真菌，时间越长，有害真菌控制的效果越佳，多粘类芽孢菌株NPDY05-8控制土传型病害的生防潜力巨大。
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图 6 不同处理样品赤霉菌属和镰刀菌属的相对丰度Figure 6. Relative abundance of Gibberella and Fusarium in soil under treatments3. 讨论
多粘类芽孢杆菌是一种重要的有益根际菌，它的代谢产物中含有多种可利用的生物活性物质，如多糖、多肽、蛋白质、糖蛋白、核苷类似物、吡嗪类、醇醛酸等，在农业、食品和环境等方面具有潜在应用价值。多粘类芽孢杆菌可通过产生的抗菌物质和位点竞争的作用方式杀死和控制病原菌[17-21]，且该菌是非致病性细菌，被广泛应用于微生物制剂的研制。此外，该菌具有活性高、环境污染小以及不易产生抗药性等特点，具有巨大的生物防治价值[22]。
引起玉米茎基腐病的病原菌复杂，主要为禾谷镰刀菌（F.graminearum）和腐皮镰刀菌（F. solani），并伴随多种真菌和细菌复合侵染造成病害，复杂的致病原因要求生防菌能够具有广谱拮抗有害菌的作用。本研究筛选的多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防治效果在2021年达90.92%，2022年达96.58%，显著优于化学药剂的防效。NPDY05-8对玉米茎基腐病的防治效果优不仅因为该菌对多种病原真菌具有强拮抗作用，还与之能否在土壤中定殖和对土壤的细菌及真菌等微生物群落的影响关系甚大。张亮等[23]研究结果显示接种多粘类芽孢杆菌LRS1不仅可以在青枯菌胁迫下的根际土壤中良好定殖，还能明显降低青枯病原菌丰度，并利于根际细菌群落多样性的维持稳定。本研究筛选的多粘类芽孢杆菌NPDY05-8能够降解土壤中的秸秆，并利用秸秆进行繁殖，研究显示灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8的土壤样本的Y1、Y2在科、属的分类水平上的丰度值均显著高于未灌施菌液的土壤样本Y3，因此多粘类芽孢杆菌NPDY05-8灌施后能在土壤中定殖的可能性极大，且在长达一年的时间上仍能保持一定的丰度水平。
陈雪丽等[24]研究表明，接种多粘类芽孢杆菌BRF-1和BRF-2对土壤细菌菌落结构影响不大，但对土壤真菌群落结构产生一定影响。韩永琴等[25]研究表明施用多粘类芽胞杆菌不仅可以有效防治辣椒疫病，还可以改变辣椒根际土壤微生物区系，提高土壤中细菌种群的多样性。本研究的结果显示灌施多粘类芽孢杆菌NPDY05-8后，细菌多样性指数提高，真菌多样性指数并未发生明显变化。土壤样本细菌和真菌样本属水平聚类树均表现出灌施该菌株的Y1和Y2土壤样本种类和结构的距离更近，相关性强。说明菌株NPDY05-8对土壤真菌及细菌的菌群均影响较大，且灌施菌株NPDY05-8一年后仍在属水平上保持住土壤的真菌及细菌的种群结构，达到持久改良土壤的目的。另菌株NPDY05-8能有效降低土壤中赤霉菌属和镰刀菌属等有害病原菌的相对丰度。综上多粘类芽孢菌株NPDY05-8对于控制土传型病害的真菌有显著的效果，且改良的土壤能在长时间内持续控制有害真菌，时间越长，有害真菌控制的效果越佳，多粘类芽孢菌株NPDY05-8控制土传型病害的生防潜力巨大。
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图 1 不同处理土壤细菌（A）和真菌（B）的Alpha指数稀释性曲线图
Figure 1. Dilution plot of alpha index for bacteria (A) and fungi (B) in soil by treatments
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图 2 不同处理土壤样本细菌（A）和真菌（B）物种分布韦恩图
Figure 2. Venn diagram on species distributions of bacteria (A) and fungi (B) in soil under treatments
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图 3 不同处理土壤样本细菌（A）和真菌（B）样本相关性热图
Figure 3. Heat map on correlation between bacteria (A) and fungi (B) in soil
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图 6 不同处理样品赤霉菌属和镰刀菌属的相对丰度
Figure 6. Relative abundance of Gibberella and Fusarium in soil under treatments
表 1 多粘类芽孢杆菌NPDY05-8对玉米茎基腐病的田间防效
Table 1 Field efficacy of NPDY05-8 against maize stalk rot
年份 Year 药剂 Pesticide 病情指数 Disease indexes/% 防治效果 Prevention effect/% 2021 菌株NPDY05-8 Strain NPDY05-8 3.23 ± 0.34 a 90.92 ± 0.65 a l5%乙蒜素可湿性粉剂 15% Ethylicin wettable powder 16.09 ± 0.45 b 55.71 ± 1.14 b 15%多菌灵可湿性粉剂 15% Carbendazim wettable powder 16.39 ± 1.53 b 54.90 ± 8.51 b 清水Clean water(CK) 36.68 ± 0.68 c 2022 菌株NPDY05-8 Strain NPDY05-8 1.04 ± 0.17 a 95.68 ± 0.71 a l5%乙蒜素可湿性粉剂 15% Ethylicin wettable powder 11.69 ± 2.05 b 51.63 ± 8.50 b 15%多菌灵可湿性粉剂 15% Carbendazim wettable powder 12.21 ± 2.83 b 49.49 ± 11.71 b 清水 Clean water(CK) 24.17 ± 0.93 c 同列数据后不同小写字母表示同一年份同一指标不同处理间差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences between treatments on same indicator in same year (P＜0.05).
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表 2 不同处理土壤样本主要细菌在门水平上不同种群的相对丰度
Table 2 Relative abundances of microbes at phylum level in soil
项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 变形菌门 Proteobacteria 41.18 ± 1.43 a 31.52 ± 0.58 a 42.31 ± 2.33 a 30.57 ± 1.03 a 酸杆菌门 Acidobacteria 21.34 ± 1.05 ab 15.90 ± 1.41 b 17.34 ± 2.12 ab 28.05 ±1.23 a 放线细菌 Actinobacteria 8.25 ± 1.33 b 12.27 ± 2.56 ab 13.75 ±0.88 a 7.07 ±0.76 b 未分类的细菌 unclassified_Bacteria 11.08 ± 0.89 a 15.67 ± 1.36 a 12.22 ±1.18 a 8.87 ± 0.79 b 芽单胞菌门 Gemmatimonadetes 5.18 ± 0.66 b 3.10 ± 0.53 bc 2.92 ± 0.36 c 10.38 ± 1.22 a 拟杆菌门 Bacteroidetes 3.53 ± 0.53 a 3.45 ± 0.80 a 2.18 ± 0.69 b 3.95 ± 1.03 a 无中文名 Candidatus_Saccharibacteria 2.47 ± 0.26 a 1.99 ± 0.15 a 2.69 ± 1.01 a 0.84 ± 0.25 b 厚壁菌门 Firmicutes 1.85 ± 0.38 b 2.95 ± 0.09 a 0.42 ± 0.08 c 2.14 ± 0.08 b 绿弯菌门 Chloroflexi 1.80 ± 0.40 c 5.75 ± 0.70 a 3.77 ± 0.66 ab 1.57 ± 0.58 c 疣微菌门 Verrucomicrobia 1.24 ± 0.36 b 2.40 ± 0.55 ab 0.57 ± 0.06 c 3.52 ± 0.58 a 浮霉菌门 Planctomycetes 0.77 ± 0.19 b 2.43 ± 0.29 a 0.92 ± 0.08 b 1.15 ± 0.04 b 装甲菌门 Armatimonadetes 0.59 ± 0.05 a 0.34 ± 0.02 a 0.15 ± 0.01 a 0.47 ± 0.19 a 硝化螺旋菌门 Nitrospirae 0.35 ± 0.02 b 0.51 ± 0.04 b 0.35 ± 0.07 b 1.08 ± 0.08 a 蓝藻门 Cyanobacteria 0.19 ± 0.01 b 1.11 ± 0.18 a 0.002 ± 0.01 c 0.09 ± 0.02 b 同行数据后不同小写字母表示不同处理间差异显著（P＜0.05）。表3、4同。
Data with different lowercase letters on same row indicate significant differences between treatments (P＜0.05). The same as table3-4.
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表 3 不同处理土壤样本主要真菌在门水平上不同种群的相对丰度
Table 3 Relative abundance of major fungi at phylum level in soil under treatments
项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 子囊菌门 Ascomycota 33.53 ± 1.57 d 52.99 ± 2.11 c 67.93 ± 1.93 a 62.26 ± 1.93 b 担子菌门 Basidiomycota 56.28 ± 2.67 a 32.00 ± 2.22 b 14.44 ± 2.50 c 30.54 ±2.27 b 被孢菌门 Mortierellomycota 8.33 ± 3.84 b 10.06 ± 1.66 a 11.24 ± 1.49 a 3.98 ± 0.85 b 壶菌门 Chytridiomycota 0.15 ± 0.06 c 1.94 ± 0.09 a 1.55 ± 0.19 b 0.36 ± 0.06 c 毛霉门 Mucoromycota 0.05 ± 0.03 c 0.26 ± 0.10 b 1.02 ± 0.15 a 0.09 ± 0.02 c
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表 4 不同处理样本的类芽孢杆菌在不同分类水平上的丰度
Table 4 Abundance of bacteria at different classification levels in soil under treatments
项目 Item Y1/% Y2/% Y3/% Y4/% 厚壁菌门 Firmicutes 1.85 ± 0.38 b 2.95 ± 0.09 a 0.42 ± 0.08 c 2.14 ± 0.08 b 芽孢杆菌纲 Bacilli 1.58 ± 0.26 a 1.91 ± 0.33 a 0.41 ± 0.12 b 1.28 ± 0.45 a 芽孢杆菌目 Bacillales 1.58 ± 0.26 a 1.91 ± 0.33 a 0.41 ± 0.12 b 1.28 ± 0.45 a 芽孢杆菌科 Bacillaceae 0.40 ± 0.09 a 0.43 ± 0.09 a 0.02 ± 0 b 0.02 ± 0 b 类芽孢杆菌属 Paenibacillus 0.12 ± 0.01 b 0.26 ± 0.01 a 0.02 ± 0 c 0.02 ± 0 c
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