SNPs and Correlation of TYRP1b with Color of Zebrafish
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摘要:目的 探究酪氨酸酶相关蛋白1b（tyrosinase-related protein 1b, TYRP1b）基因变异与斑马鱼体色性状的相关性。方法 以体色表型存在显著差异的红色、黄色和蓝色斑马鱼共计219个样本的肌肉组织DNA为模板，设计3对引物，采用PCR扩增、Sanger测序技术筛查TYRP1b基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs），并将SNPs与斑马鱼体色性状进行关联分析。结果 获得的斑马鱼TYRP1b基因外显子2、部分内含子3、外显子4、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6和外显子7长度分别为134、212、168、135、180、113、150、171 bp。SNPs筛查显示，3种体色斑马鱼群体共筛查到18个SNPs，部分内含子3存在11个SNPs位点：g.2125G＞A、g.2150G＞A、g.2152G＞T、g.2161C＞A、g.2175A＞T、g.2180G＞T、g.2185A＞T、g.2192A＞C、g.2200A＞T、g.2201A＞C和g.2213T＞C；内含子4检测到4个SNPs位点：g.7C＞A、g.65A＞G、g.84T＞A和g.103C＞T；内含子5存在1个SNPs位点：g.61G＞T；外显子4、6分别存在1个SNPs位点：g.125G＞T和g.80T＞A，且均为同义突变；外显子2、5和7均未检测到SNPs。关联分析表明，TYRP1b基因内含子3中g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2180T＞G、g.2192A＞C、g.2200A＞T、g.2201A＞C位点、内含子4中g.65A＞G位点及外显子6中g.80T＞A位点的基因型均与斑马鱼体色性状极显著相关（P＜0.01）。结论 斑马鱼TYRP1b基因内含子3、4及外显子6存在8个与体色表型存在关联的SNPs，可能影响斑马鱼体色性状或与之紧密连锁。
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关键词:
- 斑马鱼 /
- 酪氨酸酶相关蛋白1b基因 /
- 单核苷酸多态性 /
- 体色性状 /
- 关联分析
Abstract:Objective Correlation between the mutation sites of tyrosinase related protein 1b gene, TYRP1b, and body color traits of Danio rerio was investigated.Method DNA of muscles from zebrafish of three significantly different body color phenotypes were used as the templates. Single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the genes were tested by PCR and Sanger direct sequencing to determine the relationship between the mutation sites of TYRP1b and traits of zebrafish body color.Result The exon 2, partial intron 3, exon 4, intron 4, exon 5, intron 5, exon 6, and exon 7 of TYRP1b were 134 bp, 212 bp, 168 bp, 135 bp, 180 bp, 113 bp, 150 bp, and 171bp in length, respectively. Eighteen SNPs were found in 219 zebrafish with body color of red, yellow, and blue. Of them, 11 (i.e., g.2125G＞A, g.2150G＞A, g.2152G＞T, g.2161C＞A, g.2175A＞T, g.2180G＞T, g.2185A＞T, g.2192A＞C, g.2200A＞T, g.2201A＞C, and g.2213T＞C) were located in partial intron 3, 5 (i.e., g.7C＞A, g.65A＞G, g.84T＞A, and g.103C＞T) in intron 4 and g.61G＞T in intron 5, and the synonymous mutation g.125G＞T in exon 4 and g.80T＞A in exon 6. No SNPs were detected in exons 2, 5, and 7. An association analysis showed that the genotypes of g.2152G＞T, g.2175A＞T, g.2180T＞G, g.2192A＞C, g.2200A＞T, and g.2201A＞C in intron 3, g.65A＞G in intron 4, and g.80T＞A in exon 6 of TYRP1b significantly correlated with zebrafish body color (P＜0.01).Conclusion It appeared that 8 SNPs in introns 3, 4, and exon 6 of TYRP1b in D. rerio were associated with body color phenotype of the fish.-
Keywords:
- Danio rerio /
- TYRP1b /
- single nucleotide polymorphism /
- body color trait /
- correlation analysis
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0. 引言
【研究意义】斑马鱼（Danio rerio）又称花条鱼、蓝条鱼，在生物分类学上属辐鳍亚纲（Actinopterygii）、鲤形目（Cypriniformes）、鲤科（Cyprinidae）、短担尼鱼属（Danio）小型淡水鱼类[1−2]。因其全身布满多条深蓝色纵纹与相间排列的银白色或金黄色纵纹，已成为一种解析脊椎动物体色性状形成分子机制与色素沉积机理的良好动物模型[3−4]。鱼类体色表型的多样性主要由其皮肤、鳞片与鳍条中存在的色素细胞的种类及分布特性决定[5]，斑马鱼体表存在3种类型色素细胞：黑色素细胞、黄色素细胞和虹彩细胞[6]，而色素细胞的合成、黑色素的分泌及色素沉积主要通过体内相关色素信号通路和多个基因的功能表达协同进行调控[7−9]。酪氨酸酶基因家族编码的酪氨酸酶（Tyrosinase, TYR）、酪氨酸酶相关蛋白1（Tyrosinase-related protein 1, TYRP1）和多巴色素互变异构酶（Dopachrome tautomerase, DCT）是催化酪氨酸合成黑色素的关键酶，已在黄颡鱼（Tachysurus fulvidraco）[10]、青鳉（Oryzias celebensis）[11]和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）[12]等多种硬骨鱼类成功鉴定和分离出TYR基因家族成员，该家族成员在调控脊椎动物色素沉积方面具有决定作用，特别是TYRP1可以稳定TYR的活性及参与维持黑素小体超微结构及影响黑色素细胞的生长和死亡[13−15]。因此，TYRP1基因已成为解析水产动物体色性状分子基础的关键突破口。【前人研究进展】近年来，关于硬骨鱼类TYRP1基因变异和差异表达与体色表型的关系已逐渐成为研究热点。研究表明，TYRP1基因主要在胭脂鱼（Myxocyprinus asiaticus）皮肤和眼球中高度表达并参与黑色素的形成[16]，同时该基因还参与了豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）幼鱼的体色由红变黑的调控[17]。由于鱼类存在特有的基因组复制（fish specific genomic duplication, FSGD）现象，TYR基因家族在硬骨鱼类中发生了基因扩张，约30%的体色关联基因均存在2个亚型[18−19]。多数硬骨鱼TYRP1基因存在TYRP1a和TYRP1b两个亚型且其表达存在组织与时空特异性，其中正常牙鲆（Paralichthys olivaceus）皮肤TYRP1a基因表达量显著高于白化牙鲆[20]；TYRP1a和TYRP1b基因在红鳍笛鲷（Lutjnaus erythropterus）眼睛部位均存在最高表达，而TYRP1b基因在黑色皮肤也有较高表达[21]；黑色豹纹鲤棘鲈肝脏组织TYRP1b基因的mRNA表达水平显著高于红色个体[22]。Chen等[23]利用CRISPR/Cas 9系统敲除斑马鱼和瓯江彩鲤（Cyprinus carpio var. color）（WB型）TYRP1基因后显示这两种鱼皮肤黑色素严重缺失，推测瓯江彩鲤TYRP1基因（TYRP1c）对其黑斑形成具有显著影响。同时，许细丹[24]研究发现瓯江彩鲤黑色表皮TYRP1基因的表达量显著高于其他类型皮肤（P＜0.01）。Krauss等[25]研究表明，斑马鱼TYRP1a基因外显子2中a.146Arg→Cys显性突变可能会导致黑色素细胞死亡，进而中断体表色素沉积。综上研究均表明，TYRP1基因在调控鱼类深色体色表型方面具有重要作用，该基因是鱼类色素沉积的关键调控基因。【本研究切入点】目前尚未见斑马鱼TYRP1b基因单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms, SNPs）位点的相关报道，特别是该基因编码区或非编码区是否存在与斑马鱼体色表型相关的SNPs位点尚未明确。因此，探究TYRP1b基因变异与斑马鱼体色性状的相关性对于深入揭示斑马鱼体色性状形成的分子遗传机制具有重要的科研与应用价值。【拟解决的关键问题】本研究将TYRP1b基因作为斑马鱼体色性状的关键基因，通过PCR扩增及Sanger直接测序法筛查不同体色表型个体该基因SNPs，并分析SNPs与斑马鱼体色表型的关联性，旨在筛选TYRP1b基因与斑马鱼体色性状相关的分子标记，为观赏斑马鱼新色型品种的分子选育与改良提供借鉴与参考。
1. 材料与方法
1.1 试验动物和样品采集
利用购于上海银河水族的红色、黄色和蓝色斑马鱼作为亲本，在铜仁学院水产养殖工程中心斑马鱼循环养殖系统进行饲养，期间参考Westerfield[26]的方法由本课题组开展同种体色繁殖培育，获得的F1和F2代体色均与亲本一致，同时所有产卵后代在荧光显微镜下并未检测到相关荧光信号，判定为非转荧光蛋白基因斑马鱼。本研究选取F2代3种体色个体为研究对象，包括红色（RZ，70条）、黄色（YZ，64条）和蓝色（BZ，85条），共计219条。各种体色斑马鱼每条取肌肉25 mg左右，用于基因组DNA提取。
1.2 主要试剂
动物组织基因组DNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；DL2000 DNA Marker、2× SanTaq Fast PCR Mix 预混液、核酸染料Green Plus和琼脂糖均购自生工生物工程（上海）股份有限公司。
1.3 DNA提取
斑马鱼肌肉基因组DNA通过试剂盒提取，其浓度及纯度利用紫外分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，稀释至70 ng·μL−1，−20 ℃保存。
1.4 引物设计、PCR扩增及测序
通过NCBI的GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank）检索到斑马鱼TYRP1b基因（登录号：NM_001002749.2），采用Primer Premier 5.0软件设计3对引物（表1），由生工生物工程（成都）股份有限公司合成。PCR扩增反应体系为40 μL，其中DNA模板4 μL，上、下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix 20 μL，灭菌超纯水14 μL。反应循环参数：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，退火（各温度见表1）30 s，72 ℃延伸（时间见表1），40个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，由生工生物工程（成都）股份有限公司测序。
表 1 引物信息Table 1. Information on primer引物
Primers序列（5′-3′）
Sequence（5′-3′）退火温度
Annealing temperature/ ℃延伸时间
Extended time/s产物长度
Product length/bp扩增区域
Amplified regionTb-1 F：CTGTTGTCTGGCCCGAAGAT 60.2 25 134 外显子2
Exon 2R：AGGAATGTGCTGACGCTGAG Tb-2 F：CCCACAGCTCTAATGCAAACT 59.6 59 956 部分内含子3~外显子6
Partial intron 3–exon 6R：GCAATCAGCCGTCACTCACTT Tb-3 F：GTAGCGTCACACCACTGACT 58.4 28 171 外显子7
Exon 7R：ATCACGGTAACGGTGGTAGC 1.5 SNPs筛查及基因型分析
运用BioEdit 7.0软件对测序获得的不同个体TYRP1b基因序列进行比对，结合观察测序峰图筛查SNPs；采用Chromas 5.0软件判定基因型，单峰为纯合基因型，套峰为杂合基因型；利用Popgene 1.31软件分析突变位点基因型频率和等位基因频率。
1.6 SNPs与体色表型关联分析
利用SPSS 20.0软件中的卡方（χ2）独立性检验方法分析已筛查的SNPs位点基因型与体色性状的关联性，P＜0.05表示差异显著，P＜0.01表示差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 TYRP1b基因PCR产物检测
利用引物Tb-1、Tb-2和Tb-3分别对219条不同体色斑马鱼的TYRP1b基因进行PCR扩增，3对引物的PCR产物经1.2%的琼脂糖凝胶电泳检测均获得特异性产物（图1），其中Tb-1和Tb-3引物扩增片段长度分别为134 、171 bp（图1B），Tb-2引物的扩增产物为956 bp（图1A），3对引物扩增产物长度均与预期一致，可用于后续测序检测。
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图 1 斑马鱼TYRP1b基因3对引物PCR产物电泳图谱M：DL2000 DNA Marker；A图中1~6：Tb-2引物PCR产物；B图中1~3：Tb-1引物PCR产物，4~6：Tb-3引物PCR产物。Figure 1. Electrophoresis of products of TYRP1b in zebrafish from 3 pairs of primersM: DL2000 DNA marker; A1-6: PCR product of Tb-2 primer; B1-3: PCR product of Tb-1 primer; B4-6: PCR product of Tb-3 primer.2.2 SNPs位点筛查及基因型判定
参照斑马鱼TYRP1b基因序列（GenBank登录号：NM_001002749.2）结构分析3对引物的测序结果，表明获得的斑马鱼TYRP1b基因外显子2、部分内含子3、外显子4、内含子4、外显子5、内含子5、外显子6和外显子7长度分别为134、212、168、135、180、113、150、171 bp。通过BioEdit 7.0软件对3种体色斑马鱼群体的测序结果进行比对，筛查SNPs位点，结合测序峰图判定每个位点的基因型。SNPs位点的命名原则：每个外显子和内含子的第一个碱基标记为“1”，在3种体色斑马鱼群体共筛查到18个SNPs（图2和图3）。外显子2、5和7未检测到SNPs，部分内含子3存在11个SNPs位点：g.2125G＞A、g.2150G＞A、g.2152G＞T、g.2161C＞A、g.2175A＞T、g.2180G＞T、g.2185A＞T、g.2192A＞C、g.2200A＞T、g.2201A＞C和g.2213T＞C，内含子4检测到4个SNPs位点：g.7C＞A、g.65A＞G、g.84T＞A和g.103C＞T；内含子5存在1个SNPs位点：g.61G/T；外显子4和6均存在1个SNPs位点，分别为g.125G＞T和g.80T＞A。部分内含子3中g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2180G＞T、g.2192A＞C、g.2200A＞T和g.2201A＞C位点在不同体色斑马鱼群体中均存在2~3种基因型，而其他位点均仅存在于1~2种体色群体中。外显子4中g.125G＞T位点仅在黄色斑马鱼群体中存在，形成3种基因型。内含子4中，g.65A＞G位点在不同体色斑马鱼群体中均存在2~3种基因型。外显子6中g.80A＞T位点红色斑马鱼群体形成3种基因型，黄色和蓝色群体均形成2种基因型。
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图 2 斑马鱼TYRP1b基因SNPs位点测序峰图箭头所指表示碱基突变位点。Figure 2. Sequencing profiles of SNPs in zebrafish TYRP1bArrows point at mutated bases.![]()
图 3 斑马鱼TYRP1b基因SNPs分布括号中数字表示SNPs的数量；黑色和白色矩形分别代表外显子和内含子。Figure 3. SNPs distribution of zebrafish TYRP1bNumber in brackets is quantity of SNPs. Black rectangles represent exons, and white introns.2.3 部分内含子3中11个SNPs位点基因型与等位基因频率分布
由表2可知，g.2125G＞A、g.2161C＞A、g.2185A＞T在红色体色斑马鱼群体中优势等位基因分别为G、C和A；蓝色体色斑马鱼群体g.2125G＞A优势等位基因为G；g.2150G＞A、g.2213T＞C在黄色体色斑马鱼群体中优势等位基因分别为G和T，即这5个SNPs并未全部存在于3种体色群体。其余6个SNPs中，红色体色群体g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2180T＞G突变位点存在3种基因型且等位基因频率一致，g.2192A＞C、g.2200A＞T和g.2201A＞C也存在3种基因型且等位基因频率一致。而这6个SNPs在蓝色体色群体中均存在2种基因型且等位基因频率完全一致。黄色体色群体g.2152G＞T、g.2180T＞G、g.2192A＞C和g.2200A＞T存在3种基因型且等位基因频率一致，g.2175A＞T和g.2201A＞C也存在3种基因型且等位基因频率一致。
表 2 不同体色斑马鱼TYRP1b基因内含子3中11个SNPs的基因型与等位基因频率Table 2. Genotypes and allele frequencies of 11 SNPs in intron 3 of TYRP1b of zebrafish with different body colors突变位点
SNPs基因型与等位基因
Genotype and allele基因型与等位基因频率
Genotype and allele frequencies红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ g.2125G＞A GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GA 0（0） 0.3750（24） 0（0） AA 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 A 0 0.2500 0 g.2150G＞A GG 0.2000（14） 1.0000（64） 0.7647（65） GA 0.4000（28） 0（0） 0.2353（20） AA 0.4000（28） 0（0） 0（0） G 0.4000 1.0000 0.8823 A 0.6000 0 0.1177 g.2152G＞T GG 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） GT 0.4000（28） 0.3750（24） 0.5294（45） TT 0.4000（28） 0.3125（20） 0（0） G 0.4000 0.5000 0.7353 T 0.6000 0.5000 0.2647 g.2161C＞A CC 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） CA 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） AA 0（0） 0.3125（20） 0.0000（0） C 1.0000 0.5000 0.8530 A 0 0.5000 0.1470 g.2175A＞T AA 0.4000（28） 0.5000（32） 0.4706（40） AT 0.4000（28） 0.5000（32） 0.5294（45） TT 0.2000（14） 0（0） 0（0） A 0.6000 0.7500 0.7353 T 0.4000 0.2500 0.2647 g.2180T＞G TT 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） TG 0.4000（28） 0.3750（24） 0.5294（45） GG 0.4000（28） 0.3125（20） 0（0） T 0.4000 0.5000 0.7353 G 0.6000 0.5000 0.2647 g.2185A＞T AA 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） AT 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） TT 0（0） 0.3125（20） 0（0） A 1.0000 0.5000 0.8530 T 0 0.5000 0.1470 g.2192A＞C AA 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） AC 0.4571（32） 0.3750（24） 0.5294（45） CC 0.3429（24） 0.3125（20） 0（0） A 0.4286 0.5000 0.7353 C 0.5714 0.5000 0.2647 g.2200A＞T AA 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） AT 0.4571（32） 0.3750（24） 0.5294（45） TT 0.3429（24） 0.3125（20） 0（0） A 0.4286 0.5000 0.7353 T 0.5714 0.5000 0.2647 g.2201A＞C AA 0.2000（14） 0.5000（32） 0.4706（40） AC 0.4571（32） 0.5000（32） 0.5294（45） CC 0.3429（24） 0（0） 0（0） A 0.4286 0.7500 0.7353 C 0.5714 0.2500 0.2647 g.2213T＞C TT 0.2000（14） 1.0000（64） 0.7059（60） TC 0.4571（32） 0（0） 0.2941（25） CC 0.3429（24） 0（0） 0（0） T 0.4286 1.0000 0.8530 C 0.5714 0 0.1470 括号内的数字为SNPs位点基因型数，下表同。
Data in brackets are number of genotypes. Same for below.2.4 内含子4、5及外显子4、6中SNPs位点基因型及等位基因频率分布
由表3可知，内含子4中g.7A＞C、内含子5中g.61G/T和外显子4 中g.125G＞T位点仅存在于黄色体色斑马鱼群体且该位点形成的3种基因型频率一致。红色体色斑马鱼内含子4中g.65A＞G突变位点的优势等位基因为G，而黄色和蓝色个体为A；g.84T＞A在3种体色群体中的优势等位基因均为T，并且这2个SNPs分别形成的2种基因型频率在蓝色体色群体中均一致。内含子4中g.65A＞G和外显子6中g.80T＞A位点在3种体色斑马鱼群体中均存在。外显子4的g.125G＞T位点中，CCG和CCT均编码脯氨酸；外显子6的g.80T＞A位点中，ATT和ATA均编码异亮氨酸，这2个SNPs均为同义突变。
表 3 不同体色斑马鱼TYRP1b基因内含子4、5和外显子4、6中7个SNPs的基因型与等位基因频率Table 3. Genotypes and allele frequencies of 7 SNPs of TYRP1b in introns 4, 5 and exons 4, 6 in zebrafish of different body colors分布区域
Distribution region突变位点
SNPs基因型与等位基因
Genotype and allele基因型与等位基因频率
Genotype and allele frequencies红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ 内含子4
Intron 4g.7C＞A CC 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） CA 0（0） 0.3750（24） 0（0） AA 0（0） 0.0625（4） 0（0） C 1.0000 0.7500 1.0000 A 0 0.2500 0 g.65A＞G AA 0.2000（14） 0.5625（36） 0.7059（60） AG 0.4571（32） 0.3750（24） 0.2941（25） GG 0.3429（24） 0.0625（4） 0（0） A 0.4286 0.7500 0.8530 G 0.5714 0.2500 0.1470 g.84T＞A TT 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） TA 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） AA 0（0） 0.3125（20） 0（0） T 1.0000 0.5000 0.8530 A 0 0.5000 0.1470 g.103C＞T CC 0.2000（14） 0.7500（64） 0.7647（65） CT 0.4571（32） 0.0625（0） 0.2353（20） TT 0.3429（24） 0.1875（0） 0（0） C 0.4286 1.0000 0.8823 T 0.5714 0 0.1177 内含子5
Intron 5g.61G/T GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GT 0（0） 0.3750（24） 0（0） TT 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 T 0 0.2500 0 外显子4
Exon 4g.125G＞T GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GT 0（0） 0.3750（24） 0（0） TT 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 T 0 0.2500 0 外显子6
Exon 6g.80T＞A TT 0.4571（32） 0.5000（32） 0（0） TA 0.3429（24） 0.5000（32） 0.5294（45） AA 0.2000（14） 0（0） 0.4706（40） T 0.6286 0.7500 0.2647 A 0.3714 0.2500 0.7353 2.5 TYRP1b基因SNPs位点与斑马鱼体色性状的关联分析
通过分析3种体色群体中18个SNPs位点形成的不同基因型及其频率发现，g.2125G＞A、g.2150G＞A、g.2161C＞A、g.2185A＞T、g.2213T＞C、g.7C＞A、g.84T＞A、g.103C＞T、g.61G/T和g.125G＞T位点仅存在于1种体色群体中且部分基因型的个体数量较低，不具有统计学意义。另外，SNPs位点g.2180T＞G与g.2152G＞T、g.2200A＞T与g.2192A＞C在不同体色群体中形成的基因型频率分别一致。因此，本研究选取内含子3中g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2192A＞C、g.2201A＞C位点、内含子4中g.65A＞G位点及外显子6中g.80T＞A位点分别进行卡方（χ2）独立性检验（表4），分析各位点形成基因型与体色性状的关联性。结果表明，内含子3中2152 bp、2175 bp、2192 bp和2201 bp处，内含子4中65 bp、外显子6中80 bp处的SNPs各基因型在3种体色中差异极显著（P＜0.01），另外，由于内含子3中g.2180T＞G与g.2152G＞T、g.2200A＞T与g.2192A＞C可能处于紧密连锁状态。因此，推测TYRP1b基因内含子3中g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2180T＞G、g.2192A＞C、g.2200A＞T、g.2201A＞C位点、内含子4中g.65A＞G位点及外显子6中g.80T＞A位点所形成的基因型均可能与斑马鱼体色表型存在一定的相关性。
表 4 TYRP1b基因SNPs位点的各基因型分布及其与体色表型的关联分析Table 4. Distribution and association between TYRP1b SNPs genotypes and body color phenotypes分布区域
Distribution region位点
SNPs基因型
Genotype不同体色数量
Number of different body color总计
Totalχ2 P值
P value红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ 内含子3
Intron 3g.2152G＞T GG 14 20 40 74 42.4995 ＜0.0001 GT 28 24 45 97 TT 28 20 0 48 g.2175A＞T AA 28 32 40 100 32.0120 ＜0.0001 AT 28 32 45 105 TT 14 0 0 14 g.2192A＞C AA 14 20 40 74 38.4456 ＜0.0001 AC 32 24 45 101 CC 24 20 0 44 g.2201A＞C AA 14 32 40 86 61.2982 ＜0.0001 AC 32 32 45 109 CC 24 0 0 24 内含子4
Intron 4g.65A＞G AA 14 36 60 110 61.2907 ＜0.0001 AG 32 24 25 81 GG 24 4 0 28 外显子6
Exon 6g.80T＞A TT 32 32 0 64 77.6947 ＜0.0001 TA 24 32 45 101 AA 14 0 40 54 3. 讨论
鱼类的体色性状从遗传学角度分析主要由基因控制，调控体色基因的差异表达决定了不同品种鱼呈现不同的体色，甚至同一品种的鱼类体色也存在较大差异[27−28]，斑马鱼作为一种鲤形目小型观赏鱼种，体色较为丰富，探究体色调控的分子基础可为利用生物技术改变其体色表型、进一步增加观赏斑马鱼新色型品种提供有效策略，具有较大的科研与实践应用价值。因此，本研究将TYRP1b基因作为斑马鱼体色性状的候选基因，采用PCR产物Sanger测序技术，对3种不同体色斑马鱼群体TYRP1b基因进行了SNPs筛查，共发现18个SNPs，这与Espinasa等[29]通过序列比对探究穴栖视星鲇（Astroblepus pholeter）和墨西哥脂鲤（Astyanax mexicanus）色素沉积相关黑素皮质激素受体（melanocortin-1, MC1R）基因SNPs位点采用的分析方法一致。本研究斑马鱼TYRP1b基因外显子2、5和7中均未检测到SNPs位点，大部分SNPs均存在于内含子中。前人研究表明，生物体基因组中SNPs多数存在于非编码区，因受到选择压力较小而易于积累变异，而编码区SNPs为非编码区的20%左右[30−31]，尽管基因编码区SNPs变异可从分子遗传机制角度指导鱼类育种[32−33]，但非编码区的SNPs变异对基因的功能效应同样具有关键调控功能[34−35]。本研究在斑马鱼TYRP1b基因外显子2、5和7均未检测到SNPs，推测可能由于该基因外显子在所研究的219条斑马鱼群体中较为保守，尚需进一步扩大样本量和增加斑马鱼体色类型，以筛查该基因外显子2、5和7是否存在与斑马鱼体色表型相关的SNPs位点。同时，本研究检测的SNPs不包括TYRP1b基因外显子1和外显子3，前期已设计多对针对扩增所有外显子的特异性引物，然而外显子1和3的PCR效果均不理想，导致本研究SNPs分析中缺少外显子1和外显子3，后续本课题组将尝试以TYRP1b基因mRNA序列为模板设计引物，对缺少的外显子1和3进行PCR产物测序，以覆盖全外显子SNPs分析的范围。
本研究内含子3存在的11个SNPs中，g.2152G＞T、g.2175A＞T、g.2192A＞C和g.2201A＞C位点形成的所有杂合子基因型在蓝色体色斑马鱼群体中频率最高，且经卡方独立性检验表明，这4个SNPs位点形成的基因型与体色性状极显著相关（P＜0.0001），所以这4个SNPs位点的杂合基因型与斑马鱼蓝色体色性状存在关联，可能是控制斑马鱼蓝色体色的主控位点，或者是与控制斑马鱼蓝色体色表型的位点存在连锁关系，需要进一步试验验证。内含子4中g.65A＞G位点形成的AG基因型在斑马鱼红色体色群体频率最高，AA基因型在蓝色体色群体频率最高，推测AG和AA基因型分别与红色和蓝色体色表型存在关联。尽管筛查获得的这5个SNPs均存在于斑马鱼TYRP1b基因的内含子区域，但前人通过解析哺乳动物色素沉积性状形成机制证实，山羊（Capra hircus）TYRP1基因内含子存在大量与毛色表型相关的SNPs位点，且内含子SNPs位点杂合度高于外显子而有利于形成深颜色的毛色[36]，水貂TYRP1基因内含子2起始部8.0 kb插入片段与棕褐色表型的形成存在关联[37]。内含子作为基因中无编码功能的插入序列，在转录后编码蛋白质前要去除，作为长度数倍于外显子的内含子，越来越多的研究报道内含子序列对基因表达量和组织特异性表达起重要的调控作用。Sawayama等[38]通过AFLP标记方法在真鲷神经EGFL样2a（neural EGFL like 2a, Nell2a）基因内含子12中发现一个新的SNP（A/G）与幼年真鲷透明体色显著相关，表达产物可延迟色素细胞发育。类似的结果在湖栖鳍虾虎鱼（Gobiopterus lacustris）[39]也有报道，酪氨酸代谢通路中TYRP1基因表达量显著下降可能是导致其皮肤呈透明状的原因。赫曼斯基普德拉克综合征蛋白4（Hermansky–Pudlak syndrome 4, HPS4）基因内含子2和外显子3交界处99 bp片段缺失可能会导致斑点叉尾鮰白化表型[40]。因此，推测本研究筛查获得的斑马鱼TYRP1b基因内含子SNPs可能通过酪氨酸代谢通路影响黑色素小体中TYR的活性，间接控制黑色素的生成、影响黑色素细胞正常的增殖与凋亡、形态和功能，从而形成浅色体色表型，这与李岩等[41]分析乌鳢（Channa argus）白化差异表达基因主要富集在酪氨酸通路的结论基本一致。外显子6中g.80T＞A位点导致CCT突变为CCA，均编码脯氨酸，为同义突变，然而该SNPs形成的TA基因型在蓝色体色斑马鱼群体频率最高，可能与控制斑马鱼蓝色体色表型的位点连锁。因此，本课题组下一步将继续以TYRP1b基因作为影响斑马鱼体色性状的重要候选基因进行深入研究，重点分析本研究筛查获得的8个SNPs与基因表达及色素沉积的关系，拟尝试利用CRISPR/Cas 9系统编辑斑马鱼胚胎，解析其色素合成通路中TYRP1b基因的功能，探究不同体色皮肤组织中该基因基因mRNA与蛋白的差异表达，进而完善TYRP1b基因调控斑马鱼体色性状的分子遗传学机制。
综上，本研究在3种体色斑马鱼TYRP1b基因部分序列共筛查到18个SNPs，关联分析表明，内含子3、4及外显子6存在8个与体色表型存在关联的SNPs，可能影响斑马鱼体色性状或与之紧密连锁。
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图 1 斑马鱼TYRP1b基因3对引物PCR产物电泳图谱
M：DL2000 DNA Marker；A图中1~6：Tb-2引物PCR产物；B图中1~3：Tb-1引物PCR产物，4~6：Tb-3引物PCR产物。
Figure 1. Electrophoresis of products of TYRP1b in zebrafish from 3 pairs of primers
M: DL2000 DNA marker; A1-6: PCR product of Tb-2 primer; B1-3: PCR product of Tb-1 primer; B4-6: PCR product of Tb-3 primer.
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图 2 斑马鱼TYRP1b基因SNPs位点测序峰图
箭头所指表示碱基突变位点。
Figure 2. Sequencing profiles of SNPs in zebrafish TYRP1b
Arrows point at mutated bases.
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图 3 斑马鱼TYRP1b基因SNPs分布
括号中数字表示SNPs的数量；黑色和白色矩形分别代表外显子和内含子。
Figure 3. SNPs distribution of zebrafish TYRP1b
Number in brackets is quantity of SNPs. Black rectangles represent exons, and white introns.
表 1 引物信息
Table 1 Information on primer
引物
Primers序列（5′-3′）
Sequence（5′-3′）退火温度
Annealing temperature/ ℃延伸时间
Extended time/s产物长度
Product length/bp扩增区域
Amplified regionTb-1 F：CTGTTGTCTGGCCCGAAGAT 60.2 25 134 外显子2
Exon 2R：AGGAATGTGCTGACGCTGAG Tb-2 F：CCCACAGCTCTAATGCAAACT 59.6 59 956 部分内含子3~外显子6
Partial intron 3–exon 6R：GCAATCAGCCGTCACTCACTT Tb-3 F：GTAGCGTCACACCACTGACT 58.4 28 171 外显子7
Exon 7R：ATCACGGTAACGGTGGTAGC 
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表 2 不同体色斑马鱼TYRP1b基因内含子3中11个SNPs的基因型与等位基因频率
Table 2 Genotypes and allele frequencies of 11 SNPs in intron 3 of TYRP1b of zebrafish with different body colors
突变位点
SNPs基因型与等位基因
Genotype and allele基因型与等位基因频率
Genotype and allele frequencies红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ g.2125G＞A GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GA 0（0） 0.3750（24） 0（0） AA 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 A 0 0.2500 0 g.2150G＞A GG 0.2000（14） 1.0000（64） 0.7647（65） GA 0.4000（28） 0（0） 0.2353（20） AA 0.4000（28） 0（0） 0（0） G 0.4000 1.0000 0.8823 A 0.6000 0 0.1177 g.2152G＞T GG 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） GT 0.4000（28） 0.3750（24） 0.5294（45） TT 0.4000（28） 0.3125（20） 0（0） G 0.4000 0.5000 0.7353 T 0.6000 0.5000 0.2647 g.2161C＞A CC 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） CA 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） AA 0（0） 0.3125（20） 0.0000（0） C 1.0000 0.5000 0.8530 A 0 0.5000 0.1470 g.2175A＞T AA 0.4000（28） 0.5000（32） 0.4706（40） AT 0.4000（28） 0.5000（32） 0.5294（45） TT 0.2000（14） 0（0） 0（0） A 0.6000 0.7500 0.7353 T 0.4000 0.2500 0.2647 g.2180T＞G TT 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） TG 0.4000（28） 0.3750（24） 0.5294（45） GG 0.4000（28） 0.3125（20） 0（0） T 0.4000 0.5000 0.7353 G 0.6000 0.5000 0.2647 g.2185A＞T AA 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） AT 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） TT 0（0） 0.3125（20） 0（0） A 1.0000 0.5000 0.8530 T 0 0.5000 0.1470 g.2192A＞C AA 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） AC 0.4571（32） 0.3750（24） 0.5294（45） CC 0.3429（24） 0.3125（20） 0（0） A 0.4286 0.5000 0.7353 C 0.5714 0.5000 0.2647 g.2200A＞T AA 0.2000（14） 0.3125（20） 0.4706（40） AT 0.4571（32） 0.3750（24） 0.5294（45） TT 0.3429（24） 0.3125（20） 0（0） A 0.4286 0.5000 0.7353 T 0.5714 0.5000 0.2647 g.2201A＞C AA 0.2000（14） 0.5000（32） 0.4706（40） AC 0.4571（32） 0.5000（32） 0.5294（45） CC 0.3429（24） 0（0） 0（0） A 0.4286 0.7500 0.7353 C 0.5714 0.2500 0.2647 g.2213T＞C TT 0.2000（14） 1.0000（64） 0.7059（60） TC 0.4571（32） 0（0） 0.2941（25） CC 0.3429（24） 0（0） 0（0） T 0.4286 1.0000 0.8530 C 0.5714 0 0.1470 括号内的数字为SNPs位点基因型数，下表同。
Data in brackets are number of genotypes. Same for below.
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表 3 不同体色斑马鱼TYRP1b基因内含子4、5和外显子4、6中7个SNPs的基因型与等位基因频率
Table 3 Genotypes and allele frequencies of 7 SNPs of TYRP1b in introns 4, 5 and exons 4, 6 in zebrafish of different body colors
分布区域
Distribution region突变位点
SNPs基因型与等位基因
Genotype and allele基因型与等位基因频率
Genotype and allele frequencies红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ 内含子4
Intron 4g.7C＞A CC 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） CA 0（0） 0.3750（24） 0（0） AA 0（0） 0.0625（4） 0（0） C 1.0000 0.7500 1.0000 A 0 0.2500 0 g.65A＞G AA 0.2000（14） 0.5625（36） 0.7059（60） AG 0.4571（32） 0.3750（24） 0.2941（25） GG 0.3429（24） 0.0625（4） 0（0） A 0.4286 0.7500 0.8530 G 0.5714 0.2500 0.1470 g.84T＞A TT 1.0000（70） 0.3125（20） 0.7059（60） TA 0（0） 0.3750（24） 0.2941（25） AA 0（0） 0.3125（20） 0（0） T 1.0000 0.5000 0.8530 A 0 0.5000 0.1470 g.103C＞T CC 0.2000（14） 0.7500（64） 0.7647（65） CT 0.4571（32） 0.0625（0） 0.2353（20） TT 0.3429（24） 0.1875（0） 0（0） C 0.4286 1.0000 0.8823 T 0.5714 0 0.1177 内含子5
Intron 5g.61G/T GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GT 0（0） 0.3750（24） 0（0） TT 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 T 0 0.2500 0 外显子4
Exon 4g.125G＞T GG 1.0000（70） 0.5625（36） 1.0000（85） GT 0（0） 0.3750（24） 0（0） TT 0（0） 0.0625（4） 0（0） G 1.0000 0.7500 1.0000 T 0 0.2500 0 外显子6
Exon 6g.80T＞A TT 0.4571（32） 0.5000（32） 0（0） TA 0.3429（24） 0.5000（32） 0.5294（45） AA 0.2000（14） 0（0） 0.4706（40） T 0.6286 0.7500 0.2647 A 0.3714 0.2500 0.7353
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表 4 TYRP1b基因SNPs位点的各基因型分布及其与体色表型的关联分析
Table 4 Distribution and association between TYRP1b SNPs genotypes and body color phenotypes
分布区域
Distribution region位点
SNPs基因型
Genotype不同体色数量
Number of different body color总计
Totalχ2 P值
P value红色 RZ 黄色 YZ 蓝色 BZ 内含子3
Intron 3g.2152G＞T GG 14 20 40 74 42.4995 ＜0.0001 GT 28 24 45 97 TT 28 20 0 48 g.2175A＞T AA 28 32 40 100 32.0120 ＜0.0001 AT 28 32 45 105 TT 14 0 0 14 g.2192A＞C AA 14 20 40 74 38.4456 ＜0.0001 AC 32 24 45 101 CC 24 20 0 44 g.2201A＞C AA 14 32 40 86 61.2982 ＜0.0001 AC 32 32 45 109 CC 24 0 0 24 内含子4
Intron 4g.65A＞G AA 14 36 60 110 61.2907 ＜0.0001 AG 32 24 25 81 GG 24 4 0 28 外显子6
Exon 6g.80T＞A TT 32 32 0 64 77.6947 ＜0.0001 TA 24 32 45 101 AA 14 0 40 54
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