Silage Carbon Sources Preferred by Epiphytic Lactic Acid Bacteria
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摘要:目的 探究饲草源乳酸菌对碳源的选择性，为不同草种筛选适宜的青贮菌种。方法 选取饲草中分离获得的16株代表性乳酸菌作为研究对象，在MRS液体培养基中以葡萄糖、蔗糖、果糖、木糖、棉籽糖以及5种糖混合为碳源，进行不同菌株发酵培养。每株乳酸菌设3个重复，每个糖处理设空白对照（不接菌）。采用高效液相色谱仪测定各处理发酵24 h后液体培养基中剩余碳源含量和乳酸产量。结果 （1）蔗糖是大部分菌株发酵首选碳源，在棉籽糖、葡萄糖、果糖和木糖的选择上不同菌株差异较大，发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum, LbF-WM）首选棉籽糖和木糖，假肠膜明串珠菌（Leuconostioc pseudomesenteroides, LeP-IR）首选木糖。（2）罗伊氏乳杆菌（Lactobacillus reuteri, LbR-EG）和柠檬明串珠菌（Leuconostoc citreum, LeC-IR）对蔗糖，LbF-WM和LbR-EG对果糖， LbF-WM 、LbR-EG和LeP-IR对棉籽糖的利用率均达100%，屎肠球菌（Enterococcus faecium, EF-KG）、短乳杆菌（Lactobacillus brevis, LbB-KG）、戊糖乳杆菌（Lactobacillus pentosus, LbPe-EG）、乳酸乳球菌（Lactococcus lactis, LcL-SC）对葡萄糖的利用率高于其他碳源。（3）灰黄色肠球菌（Enterococcus durans, EG-IR）利用葡萄糖和混合糖，LbPe-EG利用果糖，肠膜明串珠菌（Leuconostoc mesenteroides, LeM-IR）利用棉籽糖和混合糖，LbPe-EG利用蔗糖，LbF-WM利用木糖，格氏乳球菌（Lactococcus garvieae, LcG-IR）利用混合糖发酵乳酸产量最高。（4）耐久肠球菌（Enterococcus durans, ED-IR）利用葡萄糖，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum, LbPl-IR）、LbPe-EG利用果糖， LbPl-IR和LeM-IR利用棉籽糖， LbPe-EG、LbPl-IR和ED-IR利用蔗糖， LeP- IR利用木糖，LcG-IR和EG-IR利用混合糖产乳酸效率较高。LbPl-IR在5种单糖中产酸效率均达80%以上。结论 不同菌株对同一碳源的利用率、产酸量和产酸效率均不同；同一株菌株对不同碳源的利用率、产酸量和产酸效率也不相同。其中，蔗糖为大部分菌株的首选碳源，蔗糖和葡萄糖的利用率和产乳酸量较高，葡萄糖的产酸效率较高；青贮调制时，可针对饲草中分布乳酸菌种类选择最适碳源。Abstract:Objective Preferential carbon sources of epiphytic lactic acid bacteria (LAB) were studied in laboratory to aid turning native grasses into silage.Method Sixteen representative LAB were isolated from forage and cultured on MRS broth media using glucose, sucrose, fructose, xylose, raffinose, or a mixture of the 5 sugars as carbon source. Three replicates for each LAB strain and a blank control without LAB inoculation for each sugar treatment were included. After incubation for 24 h, contents of residual sugars and generated lactic acid in the medium were determined by high-performance liquid chromatography.Results (1) Sucrose appeared to be the preferential carbon source by most LAB. Among the other sugars, raffinose and xylose were preferred by Lactobacillus fermentum (LbF-WM), and xylose by Leuconostoc pseudomesenteroides (LeP-IR). (2) An 100% utilization on sucrose by Lb. reuteri (LbR-EG) and Leuconostoc citreum (LeC-IR), on fructose by LbF-WM and LbR-EG, as well as on raffinose by LbF-WM, LbR-EG, and LeP-IR was observed. Enterococcus faecium (EF-KG), Lb. brevis (LbB-KG), Lactobacillus pentosus (LbPe-EG), and Lactococcus lactis (LcL-SC) could more efficiently utilize glucose than the other sugars. (3) The greatest amounts of lactic acid were produced from the fermentation of glucose or the mixed sugars by E. durans (EG-IR), from that of fructose by LbPe-EG, from that of raffinose or the sugar mixture by Leuconostoc mesenteroides (LeM-IR), from that of sucrose by LbPe-EG, from that of xylose by LbF-WM, and from that of the mixed sugars by Lactococcus garvieae (LcG-IR). (4) The lactic acid production was more efficient by E. durans (ED-IR) on glucose, by Lb. plantarum (LbPl-IR), or LbPe-EG on fructose, by LbPl-IR or LeM-IR on raffinose, by LbPe-EG, LbPl-IR, or ED-IR on sucrose, Le. pseudomesenteroides (LeP-IR) on xylose, and LcG-IR or EG-IR on mixed sugars. A lactic acid production efficiency greater than 80% was reached by LbPl-IR grown on the medium with the mixed sugars.Conclusion The sugar utilization and lactic acid production of the LAB fermentations on native grasses varied significantly. Sucrose appeared to be the preferential carbon source by most LAB, sucrose and glucose could obtain the higher utilization rate and lactic acid amount, and glucose could obtain higher lactic acid efficiency. For efficient and effective application of LAB to obtain extended shelf-life silage, it was imperative that careful selection of microbe strains and carbon source be exercised.
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Keywords:
- forage grass /
- epiphytic lactic acid bacteria /
- carbon source /
- glucose /
- sucrose /
- selectivity
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0. 引言
【研究意义】乳酸菌（Lactic acid bacteria, LAB）是青贮过程中发挥重要作用的关键微生物[1,2]。随着畜牧业的发展，利用青贮技术为家畜全年提供安全、可靠的饲料成为现代草地畜牧业提高生产能力与效益的有效手段[3]。在南方，许多中、小型养殖场调制青贮饲料未添加任何发酵菌剂，采用传统方法将原料直接压实、密封进行发酵。因此，牧草天然附着的乳酸菌在青贮发酵过程中起非常重要的作用[4]。【前人研究进展】许多研究常用饲草表面分离获得的乳酸菌作为青贮菌剂进行添加[1,5]。目前，报道中与青贮密切相关的乳酸菌主要有7个属：乳杆菌属（Lactobacillus）、片球菌属（Pediococcus）、肠球菌属（Enterococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、乳球菌属（Lactococcus）、链球菌属（Streptococcus）和魏斯特菌属（Weissella）[6]。乳酸菌发酵需要充足的底物[7]，当无外源底物的添加，青贮发酵主要利用植物本身含有的糖类物质作为底物进行生长繁殖。而饲草中适合乳酸菌发酵的底物含量往往较低，因此，外源发酵底物的选择和添加非常重要。Lindow 等[8]报道，叶片中含碳营养物质是决定微生物群落定殖的主要因素。Meicior等[9]报道，在叶面上的含碳营养物质是细菌种群大小的主要决定因素。郝永伟等[10]在植物乳杆菌增菌培养基碳源优化研究时发现，蔗糖能部分替代葡萄糖作为碳源，不降低发酵性能且节约了成本。金玉洁等[11]优化植物乳杆菌ZU018增殖培养基，确定了麦芽糖、酵母浸粉及柠檬酸三铵为培养基中最主要的3个影响因素，而不是葡萄糖。洪梅等[12]研究报道，德国青贮窖中分离的植物乳杆菌GLP01最适碳源是果糖，最佳氮源是酵母粉。这些报道说明不同乳酸菌对碳源具有选择性。不同饲草表面附生乳酸菌种类不同[13]。笔者在前期研究中发现，不同牧草品种其表面的乳酸菌数量与牧草中可溶性碳水化合物（water soluble carbohydrates, WSC）含量呈极显著正相关，与葡萄糖的含量呈显著正相关，与麦芽糖的含量呈极显著负相关[13]。【本研究切入点】目前，针对饲草源乳酸菌生长的碳源选择相关研究尚未见文献报道。【拟解决的关键问题】本研究以不同饲草中分离的16株乳酸菌为研究对象，通过配制不同碳源的MRS培养基进行碳源选择性生长试验，旨在探明不同乳酸菌生长对碳源的选择性，为乳酸菌高效培养及选择适宜的糖类添加物生产优质青贮料提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 乳酸菌菌株及其来源
乳酸菌来源：从热研四号王草（Pennisetum purpureum × P. americanum cv. Reyan No.4）、意大利黑麦草（Lolium multiflorum）、糯玉米（Zea mays L. Sinensisa Kulesh）、甜玉米（Zea mays L. saccharata Sturt.）、摩特矮象草（P. purputeum cv. Mott）和MT-1象草（P. purpureum cv. MT-1）中分离鉴定得到16株代表菌株（表1）。
表 1 16株乳酸菌的名称及来源Table 1. Names and sources of 16 LAB strains序号
No.编号
Code种名
Species来源
Source序号
No.编号
Code种名
Species来源
Source1 EF-KG 屎肠球菌 E. faecium 热研四号王草 9 LcG-IR 格氏乳球菌 Lc. garvieae 意大利黑麦草 2 ED-IR 耐久肠球菌 E. durans 意大利黑麦草 10 LcL-SC 乳酸乳球菌 Lc. lactis 甜玉米 3 EG-IR 灰黄色肠球菌 E. gilvus 意大利黑麦草 11 LeC-IR 柠檬明串珠菌 Le. citreum 意大利黑麦草 4 LbB-KG 短乳杆菌 Lb. brevis 热研四号王草 12 LeM-IR 肠膜明串珠菌 Le. mesenteroides 意大利黑麦草 5 LbF-WM 发酵乳杆菌 Lb. fermentum 糯玉米 13 LeP-IR 假肠膜明串珠菌 Le. pseudomesenteroides 意大利黑麦草 6 LbPe-EG 戊糖乳杆菌 Lb. pentosus 摩特矮象草 14 WCo-KG 融合乳杆菌 W. confusa 热研四号王草 7 LbPl-IR 植物乳杆菌 Lb. plantarum 意大利黑麦草 15 WCi-MT 魏斯特菌 W. cibaria MT-1杂交象草 8 LbR-EG 罗伊氏乳杆菌 Lb. reuteri 摩特矮象草 16 WP-IR 类肠膜魏斯氏菌 W. paramesenteroides 意大利黑麦草 1.2 不同碳源处理及其培养基组成
6种碳源为葡萄糖、果糖、蔗糖、木糖、棉籽糖和混合糖（棉籽糖-葡萄糖-果糖-蔗糖-木糖）。葡萄糖和蔗糖购于国药集团化学试剂有限公司，分析纯。果糖、木糖和棉籽糖购于上海麦克林生化科技有限公司，分析纯。每种菌株每个碳源处理设3个重复，每个糖处理设空白对照（不接菌）。
MRS培养基：葡萄糖20 g、牛肉膏10 g、蛋白胨10 g、酵母粉5 g、无水醋酸钠5 g、柠檬酸二铵2 g、五水合磷酸氢二钾2 g、吐温80 1 mL、七水合硫酸镁0.58 g、四水合硫酸锰 0.25 g、蒸馏水
1000 mL，pH为6.2。其他培养基分别以相应的糖取代MRS的葡萄糖配制而成；混合糖培养基中棉籽糖 、葡萄糖、蔗糖、果糖和木糖各4 g。1.3 菌株培养及指标测定
将分离鉴定的16株乳酸菌，活化后每个菌株挑一个单菌落接种于4 mL MRS液体培养基中培养24 h备用。
将不同碳源液体培养基分装于干净试管中，每支10 mL，于121 ℃下灭菌20 min。将活化后的16株乳酸菌接种到6种液体培养基中，每个试管接20 µL，30 ℃培养箱静置培养24 h。将培养后菌液
12000 r·min−1离心10 min，取上清液过0.22 µm的滤膜，−20 ℃冰箱保存。培养基中的各种糖含量采用高效液相色谱仪测定，色谱条件：色谱柱（SUGAR P0810，日本），流动相为超纯水，流速0.8 mL·min−1，柱温75 ℃，检测器为RID-10A紫外检测器。乳酸采用岛津L-20高效液相色谱仪测定，色谱条件：色谱柱（RSpak KC-811，昭和电气），流动相为3 mmol·L−1的高氯酸溶液，流速1 mL·min−1，柱温60 ℃，检测器为SPD-20A紫外检测器，检测波长210 nm[14]。牧草原料糖组分测定采用Anthrone比色法测定可溶性糖的方法提取浸提液，然后在浸提液中加入少量阳离子交换树脂，
14000 r·min−1离心5 min后，0.22 µm微孔滤膜过滤后，−20 ℃冰箱保存。各种糖含量测定与培养液中方法相同。产乳酸效率和糖利用率计算公式如下：
糖利用率/%= （实际利用糖的量/总糖量）×100；
产乳酸效率/%= （产乳酸量/实际利用糖的量）×100。
1.4 数据统计分析
用Excel对数据进行整理，采用SPSS 17.0软件对数据进行方差分析，Duncan法对均值进行多重比较。
2. 结果与分析
2.1 牧草原料中糖分组成
不同牧草原料中的5种糖分组成见表2。7种牧草中蔗糖含量均较高。其中，热研四号王草中蔗糖和棉籽糖含量显著（P＜0.05）高于其他3种糖，其次为果糖；MT-1象草中蔗糖含量最高（P＜0.05），其次为果糖和棉籽糖；摩特矮象草中果糖和蔗糖含量较高，其次为棉籽糖；甜玉米中蔗糖含量最高（P＜0.05），其次为葡萄糖和果糖；糯玉米中蔗糖含量显著（P＜0.05）最高，其他为葡萄糖；意大利黑麦草中蔗糖和葡萄糖含量较高，其次为果糖。
表 2 牧草原料中糖分组成Table 2. Sugars in native grass material（单位：%） 项目
Item葡萄糖
Glucose蔗糖
Sucrose果糖
Fructose棉籽糖
Raffinose木糖
Xylose热研四号王草
Pennisetum purpureum × P. americanum cv. Reyan No.40.07±0.01c 1.91±0.37a 1.34±0.23b 1.86±0.06a 0.00±0.00c MT-1象草
P. purpureum cv. MT-10.10±0.01c 1.82±0.08a 1.41±0.25b 1.28±0.27b 0.03±0.00c 摩特矮象草
P. purputeum cv. Mott0.12±0.01c 1.75±0.29ab 2.11±0.13a 1.58±0.31b 0.09±0.09c 甜玉米
Zea mays L. saccharata Sturt.1.84±0.26b 6.00±0.96a 1.12±0.11b 0.00±0.00c 0.00±0.00c 糯玉米
Zea mays L. Sinensisa Kulesh1.81±0.36b 5.06±0.37a 0.93±0.02c 0.00±0.00d 0.00±0.00d 意大利黑麦草
Lolium multiflorum0.70±0.39ab 0.94±0.36a 0.34±0.07b 0.08±0.08c 0.10±0.04c 同行数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。
Data with different lowercase letters on same row represent significant difference(P＜0.05); those with same or no letter, no significant difference(P＞0.05). Same for below.2.2 16株乳酸菌对不同碳源的选择性
16株菌在5种混合糖培养基培养发酵后，培养基中剩余糖量可反映该菌株优先选择碳源的种类（图1）。由图可见，LbB-KG、 LbR-EG、WP-IR、ED-IR、LbPl-IR和LcL-SC培养液中蔗糖被完全利用，其中ED-IR、LbPl-IR和LcL-SC培养液中完全不利用棉籽糖，它们的首选碳源均为蔗糖；EF-KG和WCi-MT培养液中蔗糖和木糖被完全利用，说明其首选糖源为蔗糖和木糖；EG-IR、LbPe-EG、LcG-IR、LeC-IR和WCo-KG培养液中蔗糖和果糖被完全利用，不利用棉籽糖，剩余部分葡萄糖和木糖，说明其首选碳源为蔗糖和果糖； LeM-IR培养液中蔗糖、葡萄糖和果糖被完全利用，未利用棉籽糖，剩余部分木糖，说明其首选糖源为蔗糖、葡萄糖和果糖；LbF-WM培养液中棉籽糖和木糖基本被完全利用，剩余部分的葡萄糖和蔗糖及少量的果糖，说明其首选棉籽糖与木糖；LeP-IR培养液中木糖被完全利用，蔗糖剩余极少量，说明其首选糖源为木糖。综上所述，不同菌株在碳源的利用上存在选择特异性，大部分菌株首选蔗糖；在棉籽糖、葡萄糖、木糖和果糖的选择上，EG-IR、LbPe-EG、LcG-IR、LeC-IR、WCo-KG首选蔗糖和果糖，EF-KG、WCi-MT首选蔗糖和木糖，LeP-IR首选木糖，LbF-WM首选棉籽糖和木糖，ED-IR、LbPl-IR、LcL-SC、EG-IR、LbPe-EG、LcG-IR、LeC-IR和WCo-KG完全不利用棉籽糖。
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图 1 16株乳酸菌培养24 h后在5种糖混合培养基中各种糖的剩余含量1）图中柱状数据表示混合糖培养基中剩余各糖的百分含量。2）CK，无接菌的混合糖培养基。Figure 1. Contents of residual sugars in mixed sugar media of 16 different LAB cultured for 24 h1) Datas on the column are contents of residual individual sugars in medium of mixed sugars; 2) CK, without inoculation on medium of mixed sugars.2.3 16株乳酸菌对不同碳源的利用率
16株乳酸菌对不同碳源的利用率有明显差异（表3），大部分菌株对葡萄糖和蔗糖的利用率较高。多数菌株对蔗糖的利用率最高，对棉籽糖、葡萄糖、木糖和果糖的利用率存在较大的差异。其中LbF-WM和LbR-EG对果糖的利用率达100%，LbF-WM、LbR-EG和Lep-IR对棉籽糖的利用率达到100%，LbR-EG和LeC-IR对蔗糖的利用率达100%。
表 3 16株乳酸菌对6种糖源培养液发酵后的碳源利用率Table 3. Sugar utilization by 16 different LAB in 6 sugar treatments（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 94.68±1.01a 29.25±3.43e 0.73±0.53f 89.99±1.72b 59.95±1.48c 50.27±0.54d ED-IR 44.76±2.10b 60.48±1.52a 63.67±0.91a 69.87±1.16a 5.22±0.18c 39.83±2.34b EG-IR 71.44±3.35ab 58.97±3.27bc 49.20±1.22cd 81.23±1.54a 0.00±0.00e 39.56±0.89d LbB-KG 72.13±1.05a 18.10±0.53c 7.80±4.49c 50.41±0.10b 46.74±0.10b 38.82±2.37b LbF-WM 87.50±1.43b 100.00±0.00a 100.00±0.00a 89.79±3.33b 79.15±0.84b 33.33±4.13c LbPe-EG 82.97±0.73a 60.31±0.62b 37.42±3.02c 76.75±1.05ab 1.10±0.19d 38.56±2.88c LbPl-IR 69.56±1.06a 58.45±1.72a 60.34±1.81a 72.80±2.56a 0c 39.57±2.86b LbR-EG 82.07±2.63b 100.00±0.00a 100.00±0.00a 100.00±0.00a 0d 31.01±5.99c LcG-IR 78.09±0.84ab 60.59±1.02b 74.69±0.71ab 81.48±1.64a 1.92±0.42d 38.11±3.78c LcL-SC 93.58±1.01a 0e 18.52±0.52d 90.29±0.82a 37.25±0.12c 52.81±5.62b LeC-IR 83.17±3.13b 79.15±0.61b 10.49±0.03d 100.00±0.00a 15.54±0.16d 44.51±10.98c LeM-IR 73.89±1.05a 55.36±4.22b 70.94±0.01a 74.02±0.65a 0d 24.70±4.80c LeP-IR 80.19±1.64b 90.59±0.10a 100.00±0.00a 52.23±6.10c 24.86±20.14c 33.81±2.39c WCo-KG 76.66±1.64b 9.93±5.08e 17.11±1.42d 96.40±1.00a 48.27±0.10c 53.27±6.55c WCi-MT 67.93±3.46a 56.89±0.82a 68.83±1.55a 71.00±0.86a 8.80±0.18b 27.70±7.52b WP-IR 79.14±1.24a 73.84±0.01a 79.16±2.21a 79.09±1.13a 0c 41.12±7.76b 由表3可见，EF-KG对葡萄糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05），对棉籽糖利用率最低，显著低于其他糖分（P＜0.05）；ED-IR对果糖、棉籽糖和蔗糖利用率显著高于葡萄糖、木糖和混合糖（P＜0.05），对木糖利用率显著最低（P＜0.05）；EG-IR对蔗糖的利用率显著高于除葡萄糖外的其他糖（P＜0.05），对木糖利用率最低（P＜0.05）；LbB-KG对葡萄糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05），对果糖和棉籽糖的利用率显著低于其他碳源（P＜0.05）；LbF-WM对果糖和棉籽糖利用率显著高于其他碳源（P＜0.05）；LbPe-EG对葡萄糖的利用率显著高于除蔗糖外的其他糖（P＜0.05），对木糖利用率最低（P＜0.05），为0%；LbPl-IR对葡萄糖、果糖、棉籽糖和蔗糖的利用率均较高，其次为混合糖（P＜0.05），对木糖的利用率为0%；LbR-EG对果糖、棉籽糖乳和蔗糖的利用率均为100.00%，显著高于葡萄糖和混合糖（P＜0.05），木糖的利用率最低，为0%；LcG-IR对蔗糖的利用率显著高于果糖、木糖和混合糖（P＜0.05）；LcL-SC对葡萄糖和蔗糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05）；LeC-IR对蔗糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05）；LeM-IR 对葡萄糖、棉籽糖和蔗糖的利用率均达90%以上，显著高于其他糖（P＜0.05），对果糖的利用率为0%；LeP-IR 对果糖和棉籽糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05）；WCo-KG 对蔗糖的利用率显著高于其他糖（P＜0.05），对果糖利用率最低（P＜0.05）；WCi-MT 和WP-IR对葡萄糖、果糖、棉籽糖和蔗糖的利用率较高，显著高于木糖和混合糖（P＜0.05）。
2.4 16株乳酸菌利用不同碳源的产乳酸能力
16株乳酸菌利用相同糖源发酵时，乳酸产量不同，其中EG-IR利用葡萄糖和混合糖，LbPe-EG利用果糖，LeM-IR利用棉籽糖和混合糖，LbPe-EG利用蔗糖，LbF-WM利用木糖，LcG-IR利用混合糖发酵乳酸产量最高（表4）。
表 4 16株乳酸菌在不同碳源培养基发酵中的乳酸产量Table 4. Lactic acid production by 16 different LAB on different carbon media（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 0.69±0.01a 0.32±0.02b 0. 01±0.00c 0.62±0.01a 0.58±0.03a 0.55±0.02a ED-IR 0.89±0.02a 0.85±0.05a 0.21±0.03b 1.14±0.01a 0.02±0.00c 0.86±0.06a EG-IR 1.25±0.05a 0.73±0.05b 0.66±0.03b 0.87±0.00b 0.01±0.00c 1.00±0.03a LbB-KG 0.71±0.00a 0.29±0.03c 0.23±0.00c 0.56±0.06b 0.63±0.04b 0.61±0.04b LbF-WM 0.67±0.01b 0.36±0.04c 0.71±0.01b 0.73±0.00b 0.94±0.00a 0.67±0.05b LbPe-EG 1.08±0.04b 1.10±0.06a 0.43±0.04c 1.31±0.00a 0.01±0.00c 0.98±0.02b LbPl-IR 1.14±0.01a 1.07±0.05a 1.01±0.02a 1.23±0.03a 0.61±0.02b 0.77±0.00b LbR-EG 0.73±0.02ab 0.69±0.04ab 0.86±0.02a 0.55±0.03b 0.63±0.04ab 0.67±0.00 ab LcG-IR 1.18±0.04a 0.88±0.00b 1.02±0.04a 1.15±0.01a 0.31±0.00c 1.08±0.05a LcL-SC 0.69±0.02a 0.45±0.06b 0.15±0.00c 0.52±0.05ab 0.50±0.02ab 0.58±0.00a LeC-IR 0.71±0.02a 0.67±0.02a 0.14±0.05c 0.42±0.02b 0.15±0.00c 0.45±0.01b LeM-IR 1.13±0.04a 1.01±0.05a 1.16±0.00a 1.13±0.00a 0.71±0.01b 1.06±0.02a LeP-IR 0.79±0.00a 0.54±0.02c 0.76±0.02a 0.65±0.01bc 0.78±0.00a 0.61±0.01bc WCo-KG 0.60±0.02a 0.43±0.00b 0.13±0.00c 0.62±0.06a 0.55±0.02a 0.50±0.02ab WCi-MT 1.11±0.05a 0.54±0.00b 0.36±0.02c 0.67±0.05b 0.10±0.01d 0.69±0.02b WP-IR 0.58±0.00a 0.52±0.00a 0.08±0.01c 0.32±0.00b 0.64±0.02a 0.31±0.00b 同一株菌利用不同糖源发酵，乳酸产量也存在显著差异。EF-KG利用葡萄糖、蔗糖、木糖和混合糖的乳酸产量显著高于果糖和棉籽糖（P＜0.05），利用棉籽糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；ED-IR利用葡萄糖、果糖、蔗糖和混合糖的乳酸产量显著高于棉籽糖和木糖（P＜0.05），利用木糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；EG-IR利用葡萄糖和混合糖乳酸产量最高（P＜0.05），利用木糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；LbB-KG利用葡萄糖的乳酸产量显著高于其他糖（P＜0.05），利用棉籽糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；LbF-WM利用木糖的乳酸产量最高（P＜0.05），利用果糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；LbPe-EG利用果糖的乳酸产量最高（P＜0.05），利用木糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；LbPl-IR利用葡萄糖、果糖、棉籽糖和蔗糖的乳酸产量显著高于木糖和混合糖（P＜0.05）；LbR-EG利用棉籽糖的乳酸产量显著高于蔗糖（P＜0.05）；LcG-IR利用葡萄糖、棉籽糖、蔗糖和混合糖的乳酸产量显著高于果糖和木糖（P＜0.05），利用木糖的乳酸产量最低（P＜0.05）；LcL-SC利用葡萄糖和混合糖的乳酸产量较高；LeC-IR利用葡萄糖和果糖的乳酸产量较高，利用棉籽糖和木糖的乳酸产量较低；LeM-IR 利用木糖的乳酸产量显著低于其他碳源（P＜0.05）；LeP-IR 利用葡萄糖、棉籽糖、木糖的乳酸产量显著高于果糖、蔗糖和混合糖（P＜0.05）；WCo-KG 利用葡萄糖、蔗糖和木糖的乳酸产量较高，利用棉籽糖的乳酸产量最低；WCi-MT 利用葡萄糖的乳酸产量最高，利用木糖的乳酸产量最低；WP-IR 利用葡萄糖、果糖和木糖的乳酸产量较高，利用棉籽糖的乳酸产量最低。
2.5 16株乳酸菌利用不同碳源的产酸效率
结果（表5）表明，ED-IR（99.41%）发酵利用葡萄糖的产酸效率最高，LbPl-IR（91.53%）、LeM-IR（91.22%）和LbPe-EG（91.20%）发酵的果糖产酸效率最高，LbPl-IR （83.69%）、LeM-IR（81.76%）和LbB-KG（81.69）发酵棉籽糖产酸效率较高，LbPe-EG（85.34%）、LbPl-IR （84.70%）和ED-IR（81.58%）发酵蔗糖的产酸效率较高；LeP-IR（86.66%）和 LbPl-IR（81.33%）发酵木糖的产酸效率较高； LcG-IR（87.25%）和 EG-IR（82.72%）发酵混合糖的产酸效率较高。LbPl-IR 发酵5种单糖的产酸效率均达80%以上。
表 5 16株乳酸菌的产酸效率Table 5. Acid production efficiency of 16 different LAB（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 36.44±0.01c 54.69±0.06a 34.26±1.17d 34.45±0.01d 48.38±0.06b 54.71±0.59a ED-IR 99.41±0.22a 70.27±0.02d 16.49±0.00f 81.58±0.07b 19.16±0.66e 71.47±0.00c EG-IR 87.49±0.06a 61.90±0.02d 67.07±0.02c 53.55±0.03e 50.00±0.00f 82.72±0.00b LbB-KG 49.21±0.04b 80.12±0.15ab 81.69±0.20a 55.55±0.11b 67.40±0.15ab 49.85±0.00b LbF-WM 38.29±0.01d 18.00±0.00f 35.50±0.00e 40.65±0.01c 59.38±0.03a 49.12±0.00b LbPe-EG 65.08±0.02d 91.20±0.03a 57.46±0.03e 85.34±0.06b 23.10±3.98f 79.76±0.00c LbPl-IR 81.94±0.06d 91.53±0.03a 83.69±0.01c 84.70±0.45b 81.33±0.00e 63.71±0.00f LbR-EG 44.48±0.02c 34.50±0.00e 43.00±0.00d 27.50±0.00f 45.99±0.00b 48.56±0.00a LcG-IR 75.55±0.04b 72.61±0.02c 68.28±0.01e 70.57±0.03d 41.77±0.00f 87.25±0.00a LcL-SC 36.87±0.01d 66.18±0.00b 40.49±0.05e 28.80±0.01f 67.11±0.22a 61.45±0.00c LeC-IR 42.69±0.02c 42.32±0.01c 66.75±0.14a 21.00±0.00e 48.28±0.50b 40.55±0.00d LeM-IR 76.47±0.05d 91.22±0.03a 81.76±0.01b 76.33±0.05e 79.78±0.00c 70.38±0.00f LeP-IR 49.26±0.03c 29.80±0.01f 38.00±0.00e 62.23±0.12b 86.66±0.00a 46.08±0.00d WCo-KG 39.13±0.02d 43.10±0.00c 37.98±0.05e 32.16±0.00f 56.97±0.12a 53.50±0.00b WCi-MT 81.70±0.07a 47.46±0.02c 26.15±0.00d 47.18±0.04c 56.85±1.12b 47.72±0.00c WP-IR 36.65±0.02a 35.21±0.01a 5.05±0.00b 20.23±0.01ab 15.80±27.37ab 26.33±0.00ab 由表5可见，EF-KG利用果糖和混合糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；ED-IR、EG-IR和WCi-MT利用葡萄糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；LbB-KG利用棉籽糖的产酸效率显著高于葡萄糖、蔗糖和混合糖（P＜0.05）；LbF-WM利用木糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；LbPe-EG、LbPl-IR和LeM-IR利用果糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；LbR-EG和LcG-IR利用混合糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；LcL-SC、LeP-IR 和WCo-KG利用木糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；LeC-IR利用棉籽糖的产酸效率显著高于其他糖（P＜0.05）；WP-IR 利用葡萄糖和果糖的产酸效率显著高于棉籽糖（P＜0.05）。
3. 讨论
乳酸菌常用的MRS培养基中，主要以葡萄糖为碳源[14,15]。但在许多乳酸菌培养基优化的报道中发现，不同乳酸菌或者同属不同种、同种不同菌株最适的碳源不全是葡萄糖[16−18]。陈绮等[16]报道植物乳杆菌XN1904E产胞外多糖发酵条件优化时发现，半乳糖为最适碳源，陶静等[17]也发表了相似的报道。本研究中16株乳酸菌除发酵乳杆菌发酵后还检测到一定量的蔗糖，其余菌株都未检测到蔗糖，说明蔗糖最先被完全发酵，表明牧草表面大部分乳酸菌发酵底物首选蔗糖，其次依次为葡萄糖、果糖、木糖，部分菌株首选棉籽糖。乳酸产量中，平均产乳酸量最高的为葡萄糖、蔗糖和混合糖，其次果糖，棉籽糖和木糖较低，因此蔗糖可以作为广泛的青贮添加剂使用，这与郝永伟等[10]报道的蔗糖能部分替代葡萄糖作为碳源的结果一致。刘金玲等[18]报道，罗伊乳杆菌增殖培养基中最佳的碳源种类与浓度为葡萄糖2.1%、蔗糖3.0%。季海蕊等[19]报道，乳酸明串珠菌L2以蔗糖为碳源，其体内耐受性及产胞外多糖能力最佳。金玉洁等[11]报道，植物乳杆菌ZU018培养基中麦芽糖为最主要碳源影响因素，而不是葡萄糖。洪梅等[12]研究报道，植物乳杆菌GLP01生长最佳碳源是果糖，而李想等[20]的结果却表明分离自发酵糯玉米的植物乳杆菌的最佳碳源是蔗糖。这可能是因菌株来源不同，受生存环境的影响，同种的不同菌株间仍有差别[12]。岳苗苗等[21]在不同碳源对2株乳酸菌保存研究中发现，不同温度下两菌株的存活率也因碳源不同而存在显著差异，且两菌株在不同碳源的冻存液中，存活率也存在差异。说明无论在繁殖或冻存中，不同乳酸菌对碳源均有一定的选择性。
不同碳源对微生物的生长代谢及产物有重要影响。诸多微生物培养基优化研究的目的亦是以获得最多目的产物为出发点。刘毓锋等[22]报道，相比白糖和蜂蜜，添加红糖更有利于改善葡萄酵素微生物的生长代谢及提高产品的营养价值。青贮乳酸菌的发酵，是为了使发酵料pH快速下降，抑制不良微生物的活动，从而以产生乳酸为目的产物。许多青贮研究以糖蜜[23,24]、蔗糖[23]和葡萄糖[24]为添加剂，有效提高了青贮发酵品质，说明这些糖能有效地促进乳酸菌生长繁殖，快速产生大量的乳酸。程方方[23]和Yokota等[25]在萎蔫象草中添加糖蜜，均能使青贮料pH显著降低，乳酸的含量显著增加。荣辉等[24]研究表明在象草中添加4%糖蜜可显著提高象草的青贮品质。郭金双等[26]在大麦中添加蔗糖，发酵20 d的pH值降至4.05，极显著低于对照，但对青贮130 d没有显著影响，蔗糖的添加能显著增加青贮料的乳酸含量。说明蔗糖是促进乳酸菌生长繁殖良好的添加剂，能将青贮产酸过程的时间缩短，使营养物质得到有效保存。万里强等[27]在半干青贮和高水分青贮条件下，添加葡萄糖其青贮料pH值均显著降低，且随着糖浓度的增加pH降幅增大，然而在水分43.8%条件下调制青贮，添加糖处理对苜蓿青贮效果的影响不一致。除了青贮过程中压实、密封等原因外，可能在放置过程中乳酸菌的数量和种类发生了很大的变化，而对蔗糖发酵较弱的菌占优势。本次研究结果发现：乳酸乳球菌、柠檬明串珠菌和融合乳杆菌培养后乳酸产量较低，而耐久肠球菌、灰黄色肠球菌、戊糖乳杆菌、植物乳杆菌、魏斯特菌和类肠膜魏斯氏菌乳酸含量较高。以产酸为目标进行选择时，当牧草表面或添加剂主要是植物乳杆菌，添加果糖，相比其他碳源可以更快速地大量产乳酸，快速降低青贮料的pH值，能够更好地保存青贮料中的营养物质；如果牧草表面或添加剂以魏斯特菌属为主，添加葡萄糖效果较好；如果牧草表面或添加剂主要为耐久肠球菌，棉籽糖的添加更适合其生长繁殖。在进行底物添加时，不同菌株对底物的利用产酸效率存在差异。以产酸效率为目标进行选择时，本研究的耐久肠球菌选择以葡萄糖为发酵底物，肠膜明串珠菌选择以果糖为发酵底物。本研究平均产酸效率最高的是葡萄糖，其次是果糖。
综合分析发现，6种牧草中蔗糖含量均较高，16株菌株对蔗糖的选择性较高，说明植株的糖分组成极有可能影响附生乳酸菌对碳源的选择。另外，这一结果也可较好地解释了生产中利用蔗糖作为青贮发酵添加剂可以达到较好发酵效果的原理。葡萄糖作为单糖，可以较迅速地为乳酸菌提供碳源。而蔗糖为二糖，其降解为一分子的葡萄糖和一分子的果糖，根据本研究结果，在这两种单糖中，葡萄糖势必是大部分乳酸菌的首选碳源，因此蔗糖会被大部分菌株利用，但主要利用的是其中的葡萄糖。因此，在产酸量和产酸效率上葡萄糖的效果优于蔗糖。
4. 结论
不同菌株在不同碳源培养基发酵中的碳源选择、利用率以及产酸量和产酸效率均存在差异；同一株菌株对不同碳源的利用率、产酸量和产酸效率也不相同。蔗糖被大部分菌株（EF-KG、WCi-MT、EG-IR、LbPe-EG、LcG-IR、LeC-IR和WCo-KG）优先利用完全；在棉籽糖、葡萄糖、果糖和木糖的选择上，大部分菌株对蔗糖的利用率较高，其中LbR-EG和LeC-IR对蔗糖的利用率达100%，对混合糖利用率其次，对木糖的利用率较低；16株菌在6种不同培养液中，利用葡萄糖的乳酸产量和平均产酸效率最高，其中EG-IR利用葡萄糖乳酸产量和产乳酸效率高于其他菌株。
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图 1 16株乳酸菌培养24 h后在5种糖混合培养基中各种糖的剩余含量
1）图中柱状数据表示混合糖培养基中剩余各糖的百分含量。2）CK，无接菌的混合糖培养基。
Figure 1. Contents of residual sugars in mixed sugar media of 16 different LAB cultured for 24 h
1) Datas on the column are contents of residual individual sugars in medium of mixed sugars; 2) CK, without inoculation on medium of mixed sugars.
表 1 16株乳酸菌的名称及来源
Table 1 Names and sources of 16 LAB strains
序号
No.编号
Code种名
Species来源
Source序号
No.编号
Code种名
Species来源
Source1 EF-KG 屎肠球菌 E. faecium 热研四号王草 9 LcG-IR 格氏乳球菌 Lc. garvieae 意大利黑麦草 2 ED-IR 耐久肠球菌 E. durans 意大利黑麦草 10 LcL-SC 乳酸乳球菌 Lc. lactis 甜玉米 3 EG-IR 灰黄色肠球菌 E. gilvus 意大利黑麦草 11 LeC-IR 柠檬明串珠菌 Le. citreum 意大利黑麦草 4 LbB-KG 短乳杆菌 Lb. brevis 热研四号王草 12 LeM-IR 肠膜明串珠菌 Le. mesenteroides 意大利黑麦草 5 LbF-WM 发酵乳杆菌 Lb. fermentum 糯玉米 13 LeP-IR 假肠膜明串珠菌 Le. pseudomesenteroides 意大利黑麦草 6 LbPe-EG 戊糖乳杆菌 Lb. pentosus 摩特矮象草 14 WCo-KG 融合乳杆菌 W. confusa 热研四号王草 7 LbPl-IR 植物乳杆菌 Lb. plantarum 意大利黑麦草 15 WCi-MT 魏斯特菌 W. cibaria MT-1杂交象草 8 LbR-EG 罗伊氏乳杆菌 Lb. reuteri 摩特矮象草 16 WP-IR 类肠膜魏斯氏菌 W. paramesenteroides 意大利黑麦草 
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表 2 牧草原料中糖分组成
Table 2 Sugars in native grass material
（单位：%） 项目
Item葡萄糖
Glucose蔗糖
Sucrose果糖
Fructose棉籽糖
Raffinose木糖
Xylose热研四号王草
Pennisetum purpureum × P. americanum cv. Reyan No.40.07±0.01c 1.91±0.37a 1.34±0.23b 1.86±0.06a 0.00±0.00c MT-1象草
P. purpureum cv. MT-10.10±0.01c 1.82±0.08a 1.41±0.25b 1.28±0.27b 0.03±0.00c 摩特矮象草
P. purputeum cv. Mott0.12±0.01c 1.75±0.29ab 2.11±0.13a 1.58±0.31b 0.09±0.09c 甜玉米
Zea mays L. saccharata Sturt.1.84±0.26b 6.00±0.96a 1.12±0.11b 0.00±0.00c 0.00±0.00c 糯玉米
Zea mays L. Sinensisa Kulesh1.81±0.36b 5.06±0.37a 0.93±0.02c 0.00±0.00d 0.00±0.00d 意大利黑麦草
Lolium multiflorum0.70±0.39ab 0.94±0.36a 0.34±0.07b 0.08±0.08c 0.10±0.04c 同行数据后不同小写字母表示差异显著（P＜0.05），相同或无字母表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。
Data with different lowercase letters on same row represent significant difference(P＜0.05); those with same or no letter, no significant difference(P＞0.05). Same for below.
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表 3 16株乳酸菌对6种糖源培养液发酵后的碳源利用率
Table 3 Sugar utilization by 16 different LAB in 6 sugar treatments
（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 94.68±1.01a 29.25±3.43e 0.73±0.53f 89.99±1.72b 59.95±1.48c 50.27±0.54d ED-IR 44.76±2.10b 60.48±1.52a 63.67±0.91a 69.87±1.16a 5.22±0.18c 39.83±2.34b EG-IR 71.44±3.35ab 58.97±3.27bc 49.20±1.22cd 81.23±1.54a 0.00±0.00e 39.56±0.89d LbB-KG 72.13±1.05a 18.10±0.53c 7.80±4.49c 50.41±0.10b 46.74±0.10b 38.82±2.37b LbF-WM 87.50±1.43b 100.00±0.00a 100.00±0.00a 89.79±3.33b 79.15±0.84b 33.33±4.13c LbPe-EG 82.97±0.73a 60.31±0.62b 37.42±3.02c 76.75±1.05ab 1.10±0.19d 38.56±2.88c LbPl-IR 69.56±1.06a 58.45±1.72a 60.34±1.81a 72.80±2.56a 0c 39.57±2.86b LbR-EG 82.07±2.63b 100.00±0.00a 100.00±0.00a 100.00±0.00a 0d 31.01±5.99c LcG-IR 78.09±0.84ab 60.59±1.02b 74.69±0.71ab 81.48±1.64a 1.92±0.42d 38.11±3.78c LcL-SC 93.58±1.01a 0e 18.52±0.52d 90.29±0.82a 37.25±0.12c 52.81±5.62b LeC-IR 83.17±3.13b 79.15±0.61b 10.49±0.03d 100.00±0.00a 15.54±0.16d 44.51±10.98c LeM-IR 73.89±1.05a 55.36±4.22b 70.94±0.01a 74.02±0.65a 0d 24.70±4.80c LeP-IR 80.19±1.64b 90.59±0.10a 100.00±0.00a 52.23±6.10c 24.86±20.14c 33.81±2.39c WCo-KG 76.66±1.64b 9.93±5.08e 17.11±1.42d 96.40±1.00a 48.27±0.10c 53.27±6.55c WCi-MT 67.93±3.46a 56.89±0.82a 68.83±1.55a 71.00±0.86a 8.80±0.18b 27.70±7.52b WP-IR 79.14±1.24a 73.84±0.01a 79.16±2.21a 79.09±1.13a 0c 41.12±7.76b
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表 4 16株乳酸菌在不同碳源培养基发酵中的乳酸产量
Table 4 Lactic acid production by 16 different LAB on different carbon media
（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 0.69±0.01a 0.32±0.02b 0. 01±0.00c 0.62±0.01a 0.58±0.03a 0.55±0.02a ED-IR 0.89±0.02a 0.85±0.05a 0.21±0.03b 1.14±0.01a 0.02±0.00c 0.86±0.06a EG-IR 1.25±0.05a 0.73±0.05b 0.66±0.03b 0.87±0.00b 0.01±0.00c 1.00±0.03a LbB-KG 0.71±0.00a 0.29±0.03c 0.23±0.00c 0.56±0.06b 0.63±0.04b 0.61±0.04b LbF-WM 0.67±0.01b 0.36±0.04c 0.71±0.01b 0.73±0.00b 0.94±0.00a 0.67±0.05b LbPe-EG 1.08±0.04b 1.10±0.06a 0.43±0.04c 1.31±0.00a 0.01±0.00c 0.98±0.02b LbPl-IR 1.14±0.01a 1.07±0.05a 1.01±0.02a 1.23±0.03a 0.61±0.02b 0.77±0.00b LbR-EG 0.73±0.02ab 0.69±0.04ab 0.86±0.02a 0.55±0.03b 0.63±0.04ab 0.67±0.00 ab LcG-IR 1.18±0.04a 0.88±0.00b 1.02±0.04a 1.15±0.01a 0.31±0.00c 1.08±0.05a LcL-SC 0.69±0.02a 0.45±0.06b 0.15±0.00c 0.52±0.05ab 0.50±0.02ab 0.58±0.00a LeC-IR 0.71±0.02a 0.67±0.02a 0.14±0.05c 0.42±0.02b 0.15±0.00c 0.45±0.01b LeM-IR 1.13±0.04a 1.01±0.05a 1.16±0.00a 1.13±0.00a 0.71±0.01b 1.06±0.02a LeP-IR 0.79±0.00a 0.54±0.02c 0.76±0.02a 0.65±0.01bc 0.78±0.00a 0.61±0.01bc WCo-KG 0.60±0.02a 0.43±0.00b 0.13±0.00c 0.62±0.06a 0.55±0.02a 0.50±0.02ab WCi-MT 1.11±0.05a 0.54±0.00b 0.36±0.02c 0.67±0.05b 0.10±0.01d 0.69±0.02b WP-IR 0.58±0.00a 0.52±0.00a 0.08±0.01c 0.32±0.00b 0.64±0.02a 0.31±0.00b
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表 5 16株乳酸菌的产酸效率
Table 5 Acid production efficiency of 16 different LAB
（单位：%） 菌株编号
Strain code葡萄糖MRS培养基
MRS-P果糖MRS培养基
MRS-G棉籽糖MRS培养基
MRS-MZ蔗糖MRS培养基
MRS-Z木糖MRS培养基
MRS-M混合糖MRS培养基
MRS- MIXEF-KG 36.44±0.01c 54.69±0.06a 34.26±1.17d 34.45±0.01d 48.38±0.06b 54.71±0.59a ED-IR 99.41±0.22a 70.27±0.02d 16.49±0.00f 81.58±0.07b 19.16±0.66e 71.47±0.00c EG-IR 87.49±0.06a 61.90±0.02d 67.07±0.02c 53.55±0.03e 50.00±0.00f 82.72±0.00b LbB-KG 49.21±0.04b 80.12±0.15ab 81.69±0.20a 55.55±0.11b 67.40±0.15ab 49.85±0.00b LbF-WM 38.29±0.01d 18.00±0.00f 35.50±0.00e 40.65±0.01c 59.38±0.03a 49.12±0.00b LbPe-EG 65.08±0.02d 91.20±0.03a 57.46±0.03e 85.34±0.06b 23.10±3.98f 79.76±0.00c LbPl-IR 81.94±0.06d 91.53±0.03a 83.69±0.01c 84.70±0.45b 81.33±0.00e 63.71±0.00f LbR-EG 44.48±0.02c 34.50±0.00e 43.00±0.00d 27.50±0.00f 45.99±0.00b 48.56±0.00a LcG-IR 75.55±0.04b 72.61±0.02c 68.28±0.01e 70.57±0.03d 41.77±0.00f 87.25±0.00a LcL-SC 36.87±0.01d 66.18±0.00b 40.49±0.05e 28.80±0.01f 67.11±0.22a 61.45±0.00c LeC-IR 42.69±0.02c 42.32±0.01c 66.75±0.14a 21.00±0.00e 48.28±0.50b 40.55±0.00d LeM-IR 76.47±0.05d 91.22±0.03a 81.76±0.01b 76.33±0.05e 79.78±0.00c 70.38±0.00f LeP-IR 49.26±0.03c 29.80±0.01f 38.00±0.00e 62.23±0.12b 86.66±0.00a 46.08±0.00d WCo-KG 39.13±0.02d 43.10±0.00c 37.98±0.05e 32.16±0.00f 56.97±0.12a 53.50±0.00b WCi-MT 81.70±0.07a 47.46±0.02c 26.15±0.00d 47.18±0.04c 56.85±1.12b 47.72±0.00c WP-IR 36.65±0.02a 35.21±0.01a 5.05±0.00b 20.23±0.01ab 15.80±27.37ab 26.33±0.00ab
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