Construction and Biofilm Formation of yibT-and-csgD-deleted Salmonella typhimurium
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摘要:目的 通过构建鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）yibT、csgD双基因缺失株及缺失株的回补株，探究其对鼠伤寒沙门菌生物膜形成的影响，以期为沙门菌的有效防控提供新策略。方法 以鼠伤寒沙门菌野生株CVCC541（wild-type, WT）为研究对象，利用λ-red同源重组技术构建yibT和csgD基因缺失株；利用重组载体技术构建其基因回补株；利用结晶紫染色法比较鼠伤寒沙门菌突变株生物膜形成能力的差异；通过苯酚-硫酸法测定胞外多糖含量、半固体平板测定运动能力的变化；比较不同突变菌株自聚集能力的变化；通过扫描电镜观察生物膜结构；最后利用荧光定量PCR技术鉴定生物膜形成过程中关键基因的mRNA表达水平。结果 成功构建了鼠伤寒沙门菌yibT和csgD的双基因缺失株WTΔyibTΔcsgD和csgD基因单缺失株WTΔcsgD及基因缺失株的回补株WTΔcsgDΔyibT/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD。 yibT和csgD基因的缺失降低了生物膜的形成能力、胞外多糖含量和自聚集能力，增强了运动能力；invF和sdiA基因的mRNA表达水平下降。结论 yibT和csgD基因缺失会降低鼠伤寒沙门菌的生物膜形成能力。Abstract:Objective Strains of Salmonella typhimurium with yibT and/or csgD deleted were created to observe the effect on its biofilm formation for effective prevention and control of the foodborne pathogen.Method The λ-red homologous recombination technique was applied to create the gene-deleted mutants, WTΔyibTΔcsgD and WTΔcsgD, of WT S. typhimurium (CVCC541). Subsequently, the gene-complemented strains were also obtained using recombinant vector technology. Differences of the mutants in biofilm formation were determined by crystal violet staining, content of exopolysaccharide measured by phenol-sulfuric acid, mobility tested on semi-solid agar plates, and self-aggregation monitored. Under a scanning electron microscope, biofilm structure was observed. Finally, mRNA expressions of the target genes in the biofilm were identified by fluorescence quantitative PCR.Result A double-gene deleted WTΔyibTΔcsgD, a WTΔcsgD without csgD, and their respective complemented strains, WTΔcsgDΔyibT/pcsgD and WTΔcsgD/pcsgD, were successfully obtained. The double-gene deletion significantly reduced the ability in forming biofilm, the content of exopolysaccharide, and the aggregation of the genes to targets, and the mRNA expressions of invF and sdiA in WT S. typhimurium.Conclusion Deletion of yibT and csgD significantly impacted some critical biofunctions of S. typhimurium that could become a new approach for control of the foodborne disease.
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Keywords:
- Salmonella typhimurium /
- yibT /
- csgD /
- biofilm
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0. 引言
【研究意义】德化黑鸡是福建省的乌骨鸡珍稀品种之一，因原产福建省德化县而得名，是我国的珍稀乌骨鸡地方品种之一，其生长周期较长，具有黑皮、黑肉、黑骨、黑内脏等乌色性状，肉质细嫩，味道鲜美，营养丰富，是滋补佳品，越来越受人们的喜欢，是德化县特色养殖品牌[1]。玉屏风作为中医扶正固表的经典中药方剂，具有“益气固表、祛风御邪”的作用，是中药预防疾病的重要方剂之一。在“减抗/替抗”时代大背景下，传统土鸡由于散养、品种等因素，疾病较多，养殖中如何减少疾病的发生，减少抗生素的使用，成为当前土鸡养殖的研究焦点。具有抗病防病作用的玉屏风对德化黑鸡养殖品质的影响及德化黑鸡养殖过程中替抗产品的开发具有潜在研究价值。【前人研究进展】“玉屏风散”现存最早记载于元代朱丹所著的《丹溪心法》，玉屏风方剂在人的临床医学中广泛应用，特别是在哮喘[2]、过敏性鼻炎[3]、反复感冒[4]等呼吸系统疾病等方面[5]，也应用于荨麻疹[6]、湿疹、老年皮肤瘙痒、肠道疾病、肾病等方面[7]。现代研究认为玉屏风具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、抗纤维化、调节免疫、抗疲劳、抗肿瘤等作用[7]。玉屏风方剂在畜禽养殖中也有一定的应用。动物研究认为，玉屏风主要成分玉屏风多糖可以提高动物机体的非特异性免疫和特异性免疫功能、修复肠道屏障、提高机体的抗氧化能力、提高动物生长性能等作用[8]，但主要集中于试验小鼠研究，少量应用于猪、鱼类、肉鸡等的研究[7−8] ，在土鸡中的应用研究非常少。【本研究切入点】目前未见玉屏风对德化黑鸡的应用研究。且玉屏风在临床使用时，经常会根据临床辨证进行增减，和玉屏风提取物玉屏风多糖相比，传统的中药煎制方法，入药成分更全面。【拟解决的关键问题】本研究通过在德化黑鸡饮水中添加煎制玉屏风，研究玉屏风煎剂对德化黑鸡生长性能、小肠形态结构、免疫功能、抗氧化功能及血清生化指标的影响，旨为玉屏风散在德化黑鸡养殖中的应用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 玉屏风中药方剂制备
中药方剂玉屏风煎剂由黄芪、白术、防风3味中药组成，各味中药均购于福建同春药业公司，按质量比2∶2∶1混合，冷水浸泡30 min，煮沸文火慢煎30 min，煎制3遍，合并，浓缩成含生药1 g·mL−1的玉屏风煎剂，备用。
1.2 试验动物分组与处理
试验动物由福建德化某黑鸡养殖场提供。选取30日龄体重相近的德化黑鸡160头（公母各半），随机分为低剂量组（L）、中剂量组（M）、高剂量组（H）和空白对照组（CK），每组4个重复，每个重复10头鸡，试验期25 d，每头鸡带脚环标识，处理方法见表１。各组受试动物饲养管理条件基本一致，由福建正大集团提供试验基础日粮，根据《德化黑鸡饲养管理》综合标准进行养殖，免疫程序按照常规进行，免疫程序见表2。
表 1 试验鸡分组与处理Table 1. Treatment of the tested chicken组别
Group动物数
Samples number玉屏风剂量
Yupingfeng dosage/(mL·头−1·天−1)处理
Treatment对照组Control group 40 0 只饲喂基础日粮，自由饮水 低剂量组Low-dose group 40 1.250 50 mL中药+1000 mL水，早晚分两次给药，其他时间自由饮水，连用25 d 中剂量组Medium-dose group 40 1.875 75 mL中药+1000 mL水，早晚分两次给药，其他时间自由饮水，连用25 d 高剂量组High-dose group 40 2.500 100 mL中药+1000 mL水，早晚分两次给药，其他时间自由饮水，连用25 d 表 2 试验鸡免疫程序Table 2. Immunization program of the tested chicken日龄
Age疫苗
Vaccines接种方法
Vaccination method1 d 马立克氏疫苗 颈部皮下注射 5 d 鸡新城疫L系和传支H120二联疫苗 滴鼻 7 d 法氏囊疫苗 滴嘴 10 d 鸡痘疫苗 刺种 15 d 鸡新城疫、传染性支气管（H52）二联疫苗 滴鼻 20 d 法氏囊疫苗（二免） 滴嘴 28 d （H5+H7）三价灭活疫苗 肌注 35 d （H5+H7）三价灭活疫苗（二免） 肌注 43 d 鸡新城疫（LaSota株）、传染性支气管炎（M41株）、禽流感（H9亚型，HL株）三联灭活疫苗
禽流感（H9亚型，HL株）三联灭活疫苗肌注 160 d （H5+H7）三价灭活疫苗（三免） 肌注 165 d 新支流减四联疫苗 肌注 1.3 样品采集
1.3.1 血样的采集与处理
试验第25天，每组每个重复随选取2头鸡，翅静脉采血4～5 mL，放置至析出血清后，3000 r·min−1 离心10 min，收集血清，分装于Eppendorf管中，−20 ℃保存，用于血清免疫指标、抗氧化指标、生化指标检测。
1.3.2 肠道样品的采集与处理
试验第25天，每个重复随机选取2头鸡，处死，取十二指肠（2 cm左右），4%甲醛固定，固定状态良好后，严格按照病理实验检查SOP程序进行修剪、脱水、常规石蜡包埋、切片、HE染色、中性树胶封片，镜检肠道形态结构；随机另取一段小肠（2 cm左右），称取重量，加入一定量的PBS（pH值7.4），用匀浆器将标本匀浆充分，3000 r·min−1 离心20 min，收集上清液，Eppendorf管分装，−20 ℃保存，用于检测肠道分泌型抗体SIgA。
1.4 测定项目及方法
1.4.1 生产性能的测定
于试验当日、试验结束日同一时间空腹称个体重，记录每日采食量，计算日增重、料重比。
1.4.2 十二指肠形态观察及测量
使用Eclipse Ci-L拍照显微镜选取组织的目的区域进行40倍成像，用Image-Pro Plus 6.0分析软件统一以毫米作为标准单位，分别测量每张切片中5根完整绒毛高度，并计算出绒隐比。
1.4.3 抗氧化指标的测定[9]
采用硫代巴比妥酸法测定丙二醛（malondialdehyde, MDA）浓度，采用比色法测定谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxides, GSH-Px） 活性，采用黄嘌呤氧化酶法测定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase, SOD）活性，采用Fe3+还原法测定总抗氧化能力（total antioxidant capacity, T-AOC），采用比色法测定过氧化氢酶（catalase, CAT）浓度，测试仪器为 Infinite F50型瑞士帝肯Tecan酶联免疫检测仪，具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
1.4.4 血清细胞因子及肠道SIgA测定
采用ELISA法测定血清细胞因子（IL-2、IL-6、IFN-γ、TNF-α）及SIgA[10−11]。测试仪器为 Infinite F50型瑞士帝肯Tecan酶联免疫检测仪，具体操作按试剂盒说明书进行，试剂盒购自上海邦奕生物科技有限公司。
1.4.5 血清生化指标测定
总胆红素（total bilirubin, TBIL） 浓度、甘油三酯（triglyceride, TG）浓度、总胆固醇（creatine kinase, CHOL）浓度、谷草转氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase, AST）活性、谷丙转氨酶（glutamic-pyruvic transaminase, ALT）活性、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase, ALP）活性、肌酐（creatinine concentration, CREA）浓度、肌酸激酶（creatinine concentration, CK）活性等采用全自动生化分析[12]，测定仪器为日立7600-020全自动生化分析仪。
1.5 数据处理
采用SPSS19统计处理软件对数据进行单因素方差分析和LSR多重比较，数据值以“平均值±标准差”表示，P＜0.05为差异显著，P＜0.01 为差异极显著。
2. 结果与分析
2.1 玉屏风煎剂对德化黑鸡生长性能的影响
由表3可知，和对照组相比，3个剂量组日增重分别提高8.87%（P＞0.05）、16.77%（P＜0.05）和27.58%（P＜0.01）；高剂量组末重高于低剂量（P＜0.05），高剂量日增重高于低剂量（P＜0.05）；3个剂量组饲料转化率分别提高8.30 %、14.61%、21.92%。
表 3 玉屏方煎剂对德化黑鸡生长性能的影响Table 3. Effect of Yupingfeng decoction on growth performance of Dehua black chicken组别
Group始重
Initial weight/g末重
Final weight/g日增重
Daily weight gain/(g·d−1)日均采食量
Daily average food intake/(g·d−1)料重比
F/G对照组 Control group 353.80±41.04 658.60±69.82Bb 12.40±1.90Bb 37.29±7.22 3.01 低剂量组 Low-dose group 339.80±41.41 676.40±84.91ABb 13.50±2.08ABb 37.29±7.22 2.76 中剂量组 Medium-dose group 365.50±45.48 718.60±48.65ABa 14.48±1.54ABa 37.29±7.22 2.57 高剂量组 High-dose group 348.80±50.23 721.40±72.63Aa 15.82±2.95Aa 37.29±7.22 2.35 同列数据后不同大写字母者表示差异极显著（P＜0.01），不同小写字母者表示差异显著（P＜0.05），相同或无字母者表示差异不显著（P＞0.05）；下表同。
In the same column, values with different uppercase letters mean very significant difference (P＜0.01), with different small letters, significant difference (P＜0.05), and with the same or no letter, no significant difference (P＞0.05); Same for below.2.2 玉屏风煎剂对德化黑鸡血清细胞因子及肠道SIgA抗体的影响
由表4可知，和对照组相比，3个剂量组IL-2含量极显著升高（P＜0.01），IFN-γ、TNF-α含量显著或极显著降低（P＜0.05、P＜0.01），中、高剂量组SIgA水平显著升高（P＜0.05或P＜0.01）。
表 4 玉屏风煎剂对德化黑鸡血清细胞因子及肠道SIgA抗体的影响Table 4. Effect of Yupingfeng decoction on cytokines and SIgA content of Dehua black chicken组别 Group IL-2/(pg·mL−1) IL-6/(pg·mL−1) IFN-γ/(pg·mL−1) TNF-α/(pg·mL−1) SIgA/(μg·mL−1) 对照组 Control group 154.10±17.33Bb 19.71±2.57 62.64±5.67Aa 48.93±2.97Aa 1221.00±45.75Bb 低剂量组 Low-dose group 181.00±11.27Aa 19.10±1.93 51.15±4.24Bb 42.54±3.75ABb 1342.0±40.87ABab 中剂量组 Medium-dose group 182.30±15.97Aa 19.34±2.53 47.89±4.90Bb 42.39±4.89ABb 1408.0±136.40ABa 高剂量组 High-dose group 190.00±24.36Aa 18.25±1.93 49.96±5.03Bb 41.21±5.18Bb 1471.00±201.10Aa 2.3 玉屏风煎剂对德化黑鸡抗氧化功能的影响
由表5可知：和对照组相比，3个剂量组MDA浓度极显著降低（P＜0.01），GSH-Px和SOD活性均极显著升高（P＜0.01）；高剂量组T-AOC和CAT活性显著升高（P＜0.01或 P＜0.05）。高剂量组GSH-Px、SOD活性极显著高于中、低剂量组（P＜0.01），高剂量组CAT活性极显著高于低剂量组（P＜0.01）。
表 5 玉屏风对德化黑鸡抗氧化功能的影响Table 5. Effect of Yupingfeng decoction on antioxidant indices of Dehua black chicken组别
Group丙二醛
MDA/(nmol·mL−1)谷胱甘肽过氧化物酶
GSH-Px/(U·mL−1)超氧化物歧化酶
SOD/(U·mL−1)总抗氧化能力
T-AOC/(U·mL−1)过氧化氢酶
CAT/(U·mL−1)对照组 Control group 7.06±0.24Aa 224.60±12.93Cc 46.61±6.57Cc 19.72±2.63Bb 162.60±19.00ABb 低剂量组 Low-dose group 5.77±0.44Bb 320.00±17.17Bb 57.94±5.90Bb 20.5±2.21ABab 151.50±20.49Bb 中剂量组 Medium-dose group 5.71±0.44Bb 332.00±15.03Bb 65.70±7.95Bb 21.7±1.48ABab 177.30±20.24ABab 高剂量组 High-dose group 5.06±1.01Bb 403.70±29.08Aa 82.08±9.20Aa 24.12±2.70Aa 196.50±25.96Aa 2.4 玉屏风煎剂对德化黑鸡十二指肠形态结构的影响
由表6、图1可知：和对照组相比，中、高剂量组隐窝深度显著降低（P＜0.05），绒隐比显著增加（P＜0.05或P＜0.01）。中、高剂量组绒隐比显著高于低剂量组（P＜0.05或P＜0.01）。
表 6 玉屏风煎剂对德化黑鸡十二指肠形态结构的影响Table 6. Effect of Yupingfeng decoctions on duodenal morphology of Dehua black chicken组别
Group绒毛高度
Villus height/mm隐窝深度
Crypt depth/mm绒隐比
V/C对照组 Control group 1.21±0.17 0.253±0.024ABa 4.75±0.43Bb 低剂量组 Low-dose group 1.28±0.17 0.263±0.015Aa 4.87±0.52Bb 中剂量组 Medium-dose group 1.29±0.13 0.219±0.026Bb 6.00±1.13ABa 高剂量组 High-dose group 1.37±0.08 0.222±0.017Bb 6.18±0.33Aa ![]()
图 1 玉屏风煎剂对德化黑鸡十二指肠形态结构的影响红色箭头：十二指肠绒毛；黄色箭头：隐窝。CK：对照组；L：低剂量组；M：中剂量组；H：高剂量组。Figure 1. Effect of Yupingfeng decoction on duodenal morphology of Dehua black chickenRed arrow: duodenal villus; yellow arrow: crypt. CK: control group; L:low-dose group; M：medium-dose group; H: high-dose group.2.5 玉屏风煎剂对德化黑鸡血清生化指标的影响
由表7可知：和对照组比，3个剂量组总胆红素、甘油三酯、总胆固醇、谷草转氨酶、谷丙转氨酶、碱性磷酸酶、肌酐、肌酸激酶差异均不显著（P＞0.05）。
表 7 玉屏风煎剂对德化黑鸡生化指标的影响Table 7. Effect of Yupingfeng decoction on serum biochemical indices of Dehua black chicken组别
Group甘油三脂
TG/(mmol·L−1)总胆固醇
CHOL/ (mmol·L−1)肌酸激酶
CK/(U·L−1)肌酐浓度
CREA/(μmol·L−1)谷丙转氨酶
ALT/(U·L−1)谷草转氨酶
AST/(U·L−1)碱性磷酸酶
ALP/(U·L−1)总胆红素
TBIL/(μmol·L−1)对照组
Control group0.71±0.25 2.73±0.33 2025.00±528.50 18.50±5.68 6.20±2.10 181.70±19.40 4967.00±2014.00 3.31±1.55 低剂量组
Low-dose group0.58±0.08 2.91±0.39 2006.00±440.60 15.00±3.57 5.38±2.20 191.40±14.38 6017.00±1418.00 3.64 ±0.91 中剂量组
Medium-dose group0.75±0.12 2.93±0.33 2150.00±531.90 17.50±4.21 7.38±2.39 201.30±24.12 4674.00±2671.00 3.31 ±1.34 高剂量组
High-dose group0.69±0.20 2.72±0.42 2380.00±590.50 22.36±9.57 6.30±2.21 179.60±18.99 5155.00±2166.00 4.21 ±1.59 3. 讨论
3.1 玉屏风煎剂处理下德化黑鸡生长性能和十二指肠形态结构的变化
玉屏风由黄芪、白术、防风组成，黄芪补气升阳，固表，止汗，脱毒排脓，利水退肿，入脾、肺经，主治脾肺气虚；白术补脾益气，燥湿利水，固表止汗，入脾、胃经，主治脾虚泄泻；防风发表祛湿，胜湿止痛，主治外感表证，三药合用，邪去脾健正气复，达到益气固表，扶正祛邪之功，脾主运化，可以促进动物消化吸收[13]。尹福泉等[14]研究表明，在草鱼（Ctenopharyngodon idellus）饲料中加入玉屏风多糖可以改善草鱼的肠黏膜形态，降低饲料系数，促进肠道SGLT-1和G LUT-2基因的表达，进而提高肠道吸收功能；Yin等[15]研究表明，在饲料中添加玉屏风多糖，清远麻鸡的十二指肠、空肠和回肠SGLT-1、GLUT-2和GLUTS等转运蛋白的mRNA表达量显著提高，促进肠道的营养吸收；有研究表明[16−17]，在獭兔（Rex Rabbit）、乌鳢（Channa argus）日粮中添加玉屏风多糖，可显著提高獭兔、乌鳢的日增重。本研究结果表明，在饮水中添加玉屏风煎剂，可提高德化黑鸡的日增重，降低料重比，提高饲料转化率，和上述结果相类似，说明玉屏风煎剂可促进消化吸收，提高德化黑鸡生长性能，体现了玉屏风脾健正气复、增强脾运化之功。
小肠绒毛高度、隐窝深度和绒隐比（V/C）值是衡量小肠消化和吸收功能的重要指标。小肠V/C值可综合反映肠道黏膜的功能状态，比值越大，表明肠黏膜结构的功能状态越趋于正常，说明肠道黏膜发育越好，结构越完善[18]。十二指肠是小肠吸收重要部位之一，本研究显示，玉屏风煎剂可降低德化黑鸡十二指肠隐窝深度，提高V/C值，小肠绒毛有提高趋势，和周兆海等[19]、尹福泉等[14]、邓桦等[20]的研究结果基本类似，表明玉屏风煎剂可一定程度促进德化黑鸡肠黏膜形态结构的发育，从而利于肠道内营养物质的吸收，和玉屏风煎剂提高德化黑鸡生长性能相吻合。
3.2 玉屏风煎剂处理下德化黑鸡免疫功能的变化
辅助性T淋巴细胞（Helper T cell, Th）的活化和克隆增殖是免疫应答的中心环节，免疫应答和活化的Th细胞分泌的细胞因子密切相关，Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-α等细胞因子，主要介导细胞免疫应答；Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6和IL-10等细胞因子，主要介导体液免疫[21]。IL-2可促进T细胞的增殖分化和细胞因子的形成，增强Tc细胞的活性，同时促进B细胞增殖和抗体的形成，是机体正常免疫功能的关键和免疫调节的中心[22]；IFN-γ在免疫应答中主要发挥免疫调节作用，可促进Th1细胞分化，降低Th2细胞分化[23]；IL-6、TNF-α介导免疫应答的同时，也是机体重要的促炎细胞因子[24−25]，特别是TNF-α是炎症反应过程中最早、最重要的炎症介质之一[26]；在免疫应答过程中，免疫细胞可通过分泌的细胞因子相互刺激，彼此约束，对免疫应答进行调节，维持免疫平衡。SIgA是肠黏膜免疫主要效应因子，是肠黏膜免疫的重要免疫屏障[27−28]。本研究结果表明，在饮水中添加玉屏风煎剂显著提高了血清中IL-2水平、肠黏膜SIgA水平，显著降低了血清中IFN-γ 、TNF-α水平，IL-6 水平有下降趋势；黏膜相当于中医、中兽医的“表”，黏膜SIgA水平的提高，对于防止微生物黏附上皮细胞、保护黏膜、抵抗外界病邪侵袭有重要意义，体现了玉屏风益气固表作用；IL-2是免疫应答调节的关键和中心，IL-2水平的提高提示玉屏风煎剂可提高机体免疫应答能力，肠黏膜SIgA水平的提高也符合此结论；而促炎细胞因子TNF-α水平降低，IL-6 水平有下降趋势，提示玉屏风煎剂具有抗炎作用，一定程度体现玉屏风祛邪之功；IFN-γ的降低，是否因为IL-2水平提高，Th1上移，机体通过IFN-γ调节Th1/Th2平衡，是否也影响其他细胞因子水平，具体机制有待进一步研究。
有研究表明，玉屏风多糖可提高正常与免疫抑制小鼠黏膜SIgA含量[29−30]和血清IL-2水平[30−32]、正常麻黄鸡黏膜SIgA水平[19]、正常草鱼血清IL-2 mRNA表达[14]，本研究结果也表明玉屏风煎剂可提高德化黑鸡肠道SIgA和血清IL-2水平，提示玉屏风可能对不同品种、不同健康状况动物都可以提高肠道SIgA含量和血清IL-2水平；对IFN-γ而言，研究表明，玉屏风多糖可不影响正常小鼠IFN-γ水平[32]或者提高草鱼IFN-γ mRNA表达[14]、提高免疫抑制小鼠IFN-γ水平[31]，降低佐剂性关节炎小鼠IFN-γ水平[33]，鲜见玉屏风对鸡IFN-γ水平的研究，而本研究结果表明玉屏风煎剂可降低德化黑鸡IFN-γ水平，可能和玉屏风中白术的功效有一定相关。刘美兰等[10]研究发现白术多糖会降低正常南海麻黄鸡IFN-γ水平，提高免疫抑制南海麻黄鸡的IFN-γ水平，和黄芪多糖一样具有双向调节作用[34]，提示以黄芪、白术为主要成分的玉屏风也具有双向调节作用，对不同品种、不同健康状况动物，可根据动物机体的免疫状况进行调整IFN-γ水平，维持动物免疫平稳态，符合中药的免疫调节机制。目前鲜见关于玉屏风对正常动物IL-6、TNF-α影响的研究，本研究结果表明，玉屏风煎剂可降低德化黑鸡TNF-α水平，IL-6水平有下降趋势，白术可能是相关因素之一，杨珍珍[11]在肉鸡饲料中添加白术多糖，显著降低肉鸡的TNF-α、IL-6水平，但在小鼠试验中[35]，白术多糖可显著提高小鼠TNF-α、IL-6水平，白术对不同品种动物的TNF-α、IL-6影响不同，提示玉屏风对不同品种动物TNF-α、IL-6影响可能也会不同，有待临床进一步的实践研究验证。
3.3 玉屏风煎剂处理下德化黑鸡抗氧化功能的变化
机体代谢过程中产生的过氧离子、羟基自由基等会造成细胞损伤，细胞内的GSH-Px、SOD和CAT等抗氧化酶能清除氧自由基，保护细胞膜的结构及功能不受过氧化物损害，T-AOC、SOD、GSH-Px及CAT等指标可直观反映机体抗氧化能力[9]，MDA可作为反映机体氧化程度的指标[12]。刘华等[36]在热应激草鱼饲料添加玉屏风多糖合生元，可提高热应激草鱼肝脏T-AOC、SOD、GSH-Px；王志敬等[37]在草鱼饲料中添加玉屏风多糖，可提高草鱼肝胰SOD、CAT活性，降低MDA浓度；陈方军等[38]给化学性肝损伤小鼠灌服玉屏风多糖，可提高化学性肝损伤小鼠肝匀浆SOD活性、GSH-Px活性，降低MDA浓度。本研究结果也表明，玉屏风煎剂可降低德化黑鸡血清MDA浓度，提高CAT、T-AOC、SOD、GSH-Px活性，增强德化黑鸡总的抗氧化能力，和前人研究结果基本一致。
3.4 玉屏风煎剂在德化黑鸡应用中的安全性
中药较长时间使用，可能会对机体造成损害。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是广泛存在于动物线粒体中的重要氨基酸转氨酶，在机体蛋白质代谢中起重要作用。在正常情况下，血清中正常转氨酶活性较低，但当组织细胞，特别是肝脏和心脏等器官的细胞发生损害时，能引起血清中这两种酶的活力明显升高。谷丙转氨酶和谷草转氨酶是肝细胞受损最灵敏指标之一[39]；血清碱性磷酸酶可以作为临床诊断胆汁淤积型肝病的重要生化指标[40]；总胆红素是用来诊断肝脏或胆道是否发生异常的重要指标之一[41]；肌酐是衡量肾脏滤过功能的常用指标，肌酸激酶主要用于心肌、骨骼肌相关疾病的诊断；血清中的甘油三酯和总胆固醇水平可在一定程度上反映动物脂肪代谢状况[42]。本研究结果显示，3个剂量组血清的谷丙转氨酶活性、谷草转氨酶活性、碱性磷酸酶活性、总胆红素浓度、甘油三酯浓度、总胆固醇浓度、肌酐浓度、肌酸激酶活性都没有发生明显变化，表明德化黑鸡较长时间使用玉屏风煎剂是安全的，可作为提高德化黑鸡生产品质的中药制剂。
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图 1 菌株WTΔyibTΔcsgD:Kan和WTΔcsgD:Kan的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD:Kan PCR产物；2： WTΔcsgD:Kan PCR产物；3：WT PCR产物。
Figure 1. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD:Kan and WTΔcsgD:Kan
M: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD:Kan; 2: PCR product of WTΔcsgD:Kan; 3: PCR product of WT.
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图 2 菌株WTΔyibTΔcsgD和WTΔcsgD的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WT 的 PCR 产物；2：WTΔyibTΔcsgD 的 PCR 产物；3：WTΔcsgD 的 PCR 产物。
Figure 2. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD and WTΔcsgD
M: D2000 marker; 1: PCR product of WT; 2: PCR product of WTΔyibTΔcsgD; 3: PCR product of WTΔcsgD.
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图 3 WTΔyibTΔcsgD/pcsgD和WTΔcsgD/pcsgD的PCR鉴定
M：D2000 Marker；1：WTΔyibTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；2：WTΔcsgD/pcsgD的PCR产物；3：转入空质粒pET28a的菌 PCR产物。
Figure 3. PCR identification for WTΔyibTΔcsgD/pcsgD and WTΔcsgD/pcsgD
M: D2000 marker; 1: PCR product of WTΔyibTΔcsgD/pcsgD; 2: PCR product of WTΔcsgD/pcsgD; 3: PCR product of bacteria transferred to empty plasmid pET28a.
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图 4 鼠伤寒沙门菌突变株的生物膜形成
A：试管法测定生物膜能力；B：二十四孔板测定生物膜能力；C：生物膜的结晶紫量化。*表示与WT差异显著（P＜0.05），**表示与WT差异极显著（P＜0.01）。下同。
Figure 4. Biofilm formation of S. typhimurium mutants
A: test tube method for determining biofilm formation; B: 24-well plates for determining biofilm formation; C: crystal violet quantization of biofilm. Results are comparisons with WT; *: significant difference at P＜0.05; **: extremely significant difference at P＜0.01. Same for below.
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图 6 鼠伤寒沙门菌突变株胞外多糖含量
A：葡萄糖标准曲线；B：胞外多糖含量。
Figure 6. Exopolysaccharide contents in S. typhimurium mutants
A: glucose standard curve; B: exopolysaccharide content.
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图 7 鼠伤寒沙门菌突变株的运动能力
A：鼠伤寒沙门菌突变株在半固体平板的运动性；B：鼠伤寒沙门菌突变株的运动直径。
Figure 7. Motility of S. typhimurium mutants
A: motility of S. typhimurium mutants on semi-solid plates; B: diameters of moving area of S. typhimurium mutants.
表 1 PCR扩增引物
Table 1 Primers applied for PCR
引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bp反应长度
Reaction length/bpP1 TTTCATCATGTTTAATGAAGTCCATAGTAGTCATGGTCAGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC 59 1600 P2 ATCTTTTTGAAAAGATTATAAAGATGTGTCTTAACCGTACATATGAATATCCTCCTTAG 59 P3 GCTGTCAGATGTGCGATT 18 723 P4 TGCTACAATCCAGGTCAGA 19 P5 CCGCTCGAGCCGCCTGAGATTATCGTTTG 29 649 P6 CGCGGATCCATGTTTAATGAAGTCCATAG 29 P7 CAGCCAGGCGTTCCGTGAAT 20 469 P8 AGCCGCCGGTAATATTCCAGAC 22 
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表 2 荧光定量PCR引物序列
Table 2 Primers applied for qRT-PCR
引物名称
Primer names引物序列5′-3′
Primer sequences引物长度
Primer length/bpluxS-F ACTGATGGGCTGCCTGTATC 20 luxS-R
sdiA-F
sdiA-R
invF-F
invF-R
16S-F
16S-RGCCTCTTCGCTATTACGCCA
ATGAAGCGAAGGCGATGT
CGAGGAGCAGCGTAAACT
ACGATGAGAATGCTGGGAGA
TATGTGAAGGCGATGAGTAAC
TTACCCGCAGAAGAAGCACC
CTCAAGGGCACAACCTCCAA20
18
18
20
20
20
20
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[1] TOBOLOWSKY F A, CUI Z H, HOEKSTRA R M, et al. Salmonella serotypes associated with illnesses after thanksgiving holiday, United States, 1998-2018 [J]. Emerging Infectious Diseases, 2022, 28(1): 210−213. DOI: 10.3201/eid2801.211986
[2] JERTBORN M, HAGLIND P, IWARSON S, et al. Estimation of symptomatic and asymptomatic Salmonella infections [J]. Scandinavian Journal of Infectious Diseases, 1990, 22(4): 451−455. DOI: 10.3109/00365549009027077
[3] LAN Y B, WANG S Z, YIN Y G, et al. Using a surface plasmon resonance biosensor for rapid detection of Salmonella typhimurium in chicken carcass [J]. Journal of Bionic Engineering, 2008, 5(3): 239−246. DOI: 10.1016/S1672-6529(08)60030-X
[4] BORIPUN R, SAENGSAWANG P, INTONGEAD S, et al. Molecular characterization and nucleotide substitution of antibiotic resistance genes in multidrug-resistant Escherichia coli isolated from environmental swine farms [J]. Emerging Contaminants, 2023, 9(4): 100249. DOI: 10.1016/j.emcon.2023.100249
[5] KURTZ J R, GOGGINS J A, MCLACHLAN J B. Salmonella infection: Interplay between the bacteria and host immune system [J]. Immunology Letters, 2017, 190: 42−50. DOI: 10.1016/j.imlet.2017.07.006
[6] CHEN L, GU L P, GENG X F, et al. A novel Cis antisense RNA AsfD promotes Salmonella enterica serovar Typhi motility and biofilm formation [J]. Microbial Pathogenesis, 2020, 142: 104044. DOI: 10.1016/j.micpath.2020.104044
[7] JEFFERSON K K. What drives bacteria to produce a biofilm? [J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 236(2): 163−173. DOI: 10.1111/j.1574-6968.2004.tb09643.x
[8] RÖMLING U, ROHDE M, OLSÉN A, et al. AgfD, the checkpoint of multicellular and aggregative behaviour in Salmonella typhimurium regulates at least two independent pathways [J]. Molecular Microbiology, 2000, 36(1): 10−23. DOI: 10.1046/j.1365-2958.2000.01822.x
[9] JAMES G, SWOGGER E, WOLCOTT R, et al. Biofilms in chronic wounds [J]. Wound Repair and regeneration, 2008, 16(1): 37−44. DOI: 10.1111/j.1524-475X.2007.00321.x
[10] HAESLER E, SWANSON T, OUSEY K, et al. Clinical indicators of wound infection and biofilm: Reaching international consensus [J]. Journal of Wound Care, 2019, 28(Sup3b): s4−s12. DOI: 10.12968/jowc.2019.28.Sup3b.S4
[11] LIU J L, JIA R, ZHOU E Z, et al. Antimicrobial Cu-bearing 2205 duplex stainless steel against MIC by nitrate reducing Pseudomonas aeruginosa biofilm [J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2018, 132: 132−138.
[12] LI W K, ZHENG T L, MA Y Q, et al. Current status and future prospects of sewer biofilms: Their structure, influencing factors, and substance transformations [J]. Science of the Total Environment, 2019, 695: 133815. DOI: 10.1016/j.scitotenv.2019.133815
[13] OJIMA-KATO T, YAMAMOTO N, NAGAI S, et al. Application of proteotyping Strain Solution™ ver. 2 software and theoretically calculated mass database in MALDI-TOF MS typing of Salmonella serotype [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2017, 101(23/24): 8557−8569.
[14] FUKUYAMA Y, OJIMA-KATO T, NAGAI S, et al. Improved MALDI-MS method for the highly sensitive and reproducible detection of biomarker peaks for the proteotyping of Salmonella serotypes [J]. Journal of Mass Spectrometry, 2019, 54(12): 966−975. DOI: 10.1002/jms.4469
[15] SI H M, ZHANG F, WU A N, et al. DNA microarray of global transcription factor mutant reveals membrane-related proteins involved in n-butanol tolerance in Escherichia coli [J]. Biotechnology for Biofuels, 2016, 9: 114. DOI: 10.1186/s13068-016-0527-9
[16] WANG Z Q, XUE T L, HU D S, et al. A novel butanol tolerance-promoting function of the transcription factor rob in Escherichia coli [J]. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology, 2020, 8: 524198. DOI: 10.3389/fbioe.2020.524198
[17] 岳敏, 赵威, 王涛, 等. YibT介导鼠伤寒沙门氏菌生物膜形成的分子机制研究 [J]. 动物医学进展, 2022, 43(6):46−51. DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2022.06.009 YUE M, ZHAO W, WANG T, et al. Molecular regulatory mechanism of biofilm formation of Salmonella mediated by protein yibT [J]. Progress in Veterinary Medicine, 2022, 43(6): 46−51. (in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1007-5038.2022.06.009
[18] 王涛, 赵威, 裴芳樱, 等. 鼠伤寒沙门菌yibT基因缺失株的构建及其生物学特性分析 [J]. 中国兽医科学, 2020, 50(3):338−345. WANG T, ZHAO W, PEI F Y, et al. Construction of a Salmonella typhimurium CVCC541 ΔyibT strain and study on its biological characteristics [J]. Chinese Veterinary Science, 2020, 50(3): 338−345. (in Chinese)
[19] MANGWANI N, KUMARI S, DAS S. Bacterial biofilms and quorum sensing: Fidelity in bioremediation technology [J]. Biotechnology & Genetic Engineering Reviews, 2016, 32(1/2): 43−73.
[20] RUPP M E, ULPHANI J S, FEY P D, et al. Characterization of the importance of polysaccharide intercellular adhesin/hemagglutinin of Staphylococcus epidermidis in the pathogenesis of biomaterial-based infection in a mouse foreign body infection model [J]. Infection and Immunity, 1999, 67(5): 2627−2632. DOI: 10.1128/IAI.67.5.2627-2632.1999
[21] OBE T, NANNAPANENI R, SHARMA C S, et al. Homologous stress adaptation, antibiotic resistance, and biofilm forming ability of Salmonella enterica serovar Heidelberg ATCC8326 on different food-contact surfaces following exposure to sublethal chlorine concentrations1 [J]. Poultry Science, 2018, 97(3): 951−961. DOI: 10.3382/ps/pex346
[22] HE S K, ZHAN Z Q, SHI C L, et al. Ethanol at subinhibitory concentrations enhances biofilm formation in Salmonella enteritidis [J]. Foods, 2022, 11(15): 2237. DOI: 10.3390/foods11152237
[23] GOMES L C, MERGULHÃO F J. SEM analysis of surface impact on biofilm antibiotic treatment [J]. Scanning, 2017, 2017: 2960194.
[24] AKIYAMA H, HUH W K, YAMASAKI O, et al. Confocal laser scanning microscopic observation of glycocalyx production by Staphylococcus aureus in mouse skin: Does S. aureus generally produce a biofilm on damaged skin? [J]. British Journal of Dermatology, 2002, 147(5): 879−885. DOI: 10.1046/j.1365-2133.2002.04962.x
[25] KALAI CHELVAM K, CHAI L C, THONG K L. Variations in motility and biofilm formation of Salmonella enterica serovar Typhi [J]. Gut Pathogens, 2014, 6(1): 2. DOI: 10.1186/1757-4749-6-2
[26] RAMESH N, JOSEPH S W, CARR L E, et al. Evaluation of chemical disinfectants for the elimination of Salmonella biofilms from poultry transport containers [J]. Poultry Science, 2002, 81(6): 904−910. DOI: 10.1093/ps/81.6.904
[27] KARYGIANNI L, REN Z, KOO H, et al. Biofilm matrixome: Extracellular components in structured microbial communities [J]. Trends in Microbiology, 2020, 28(8): 668−681. DOI: 10.1016/j.tim.2020.03.016
[28] MAN L L, XIANG D J. Effect of Lu xS/AI-2-mediated quorum sensing system on bacteriocin production of Lactobacillus plantarum NMD-17 [J]. Folia Microbiologica, 2023, 68(6): 855−866. DOI: 10.1007/s12223-023-01060-0
[29] CHOI J, SHIN D, KIM M, et al. LsrR-mediated quorum sensing controls invasiveness of Salmonella typhimurium by regulating SPI-1 and flagella genes [J]. PLoS One, 2012, 7(5): e37059. DOI: 10.1371/journal.pone.0037059
[30] CARNEIRO D G, ALMEIDA F A, AGUILAR A P, et al. Salmonella enterica optimizes metabolism after addition of acyl-homoserine lactone under anaerobic conditions [J]. Frontiers in Microbiology, 2020, 11: 1459. DOI: 10.3389/fmicb.2020.01459
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