Differentiations between Microbes in Cultivated and Wild Paris Polyphylla Field Soils
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摘要:目的 探明栽培与野生七叶一枝花土壤细菌群落组成的差异。方法 采用illumina miseq 2×300 bp高通量测序对栽培与野生七叶一枝花土壤的细菌16S rRNA基因序列进行测序分析；同时，利用LDA Effect Size（LEfSE）软件对组间群落微生物丰富度的差异分析，比较栽培与野生七叶一枝花土壤细菌群落组成的差异，明确影响2种栽培模式的重要微生物门类。结果 七叶一枝花土壤中的微生物组成中，野生七叶一枝花土壤细菌种类优于栽培七叶一枝花土壤。丰富度指数（Ace和Chao）和多样性指数（Shannon和Simpson）分析表明，野生七叶一枝花土壤细菌群落更具有更高的丰富性和多样性。在门水平，栽培和野生七叶一枝花土壤细菌群落具有显著差异的门包括Firmicutes、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）和螺旋菌门（Spirochaetae）；显著差异的属包括芽孢杆菌（Bacillus）、纤线杆菌属（Ktedonobacter）和类芽孢杆菌（Paenibacillus）等。利用LEfSE软件对组间群落微生物丰富度的差异分析发现，厚壁菌门（Firmicutes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）是野生七叶一枝花土壤样本中的优势菌门，优势属包括芽孢杆菌（Bacillus）、类芽孢杆菌（Paenibacillus）、Tumebacillus、Mucilaginibacter、硝化螺菌属（Nitrospira）、Shimazuella和Singulisphaera；栽培七叶一枝花土壤样本中起到重要作用的门水平细菌群落是装甲菌门（Armatimonadetes），属水平细菌群落是Bryobacter、Aquicella和纤线杆菌属（Ktedonobacter）。相关性分析结果表明，土壤pH与土壤全钾是影响七叶一枝花土壤微生物群落多样性的主要因素。结论 不同栽培模式和土壤养分影响七叶一枝花土壤微生物多样性，为七叶一枝花的栽培管理与维护提供参考。Abstract:Objective Diversity of the microbial communities in soils of cultivated and wild Paris polyphylla var. chinensis fields were compared.Method Total DNA of the microbes on cultivated land grown P. polyphylla plants or at field of the plants in the wild were sequenced using high throughput Illumina Miseq (2×300 bp). Structure and abundance of the microbial communities in soils of the fields were comparatively analyzed by LDA Effect Size.Result The microbial diversity of the wild P. polyphylla lots was richer than the cultivated land. The Chao, Ace, Shannon, and Simpson indexes of the wildP. polyphylla soil were higher than the cultivated counterparts. The communities significantly differed on the abundant phyla of Firmicutes, Nitrospirae, and Spirochaetae, and on the genera of Bacillus, Ktedonobacter, and Paenibacillus. LDA Effect Size showed Firmicutes and Nitrospirae to be the predominant phyla, while Bacillus, Paenibacillus, Tumebacillus,Mucilaginibacter, Nitrospira, Shimazuella, and Singulisphaera the dominant genera in the wild. In the cultivated soil, the Armatimonadetes phylum and the Bryobacter, Aquicella, and Ktedonobacter genera predominated the community. pH and total potassium content of soil were the critical factors affecting the diversity of a microbial community.Conclusion Cultivation and soil nutrients significantly differentiated the microbial composition at a P. polyphylla field.
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Keywords:
- Paris polyphylla var. chinensis /
- rhizosphere /
- soil /
- metagenomics /
- diversity
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刺葡萄Vitis davidi是葡萄属Vitis L.东亚种群中珍贵的野生种质资源，广泛分布于我国南方海拔400~1 800 m的山坡、沟谷疏林或灌丛中，在野生葡萄中其浆果最大[1]，品质优良，产量高，鲜食与加工兼用。福安刺葡萄为野生刺葡萄经人工驯化而来，栽培历史较久[2]，对黑痘病、炭疽病、白腐病等有较强的抗性，且耐高温高湿，适应性强，是抗病、抗逆育种方面极其珍贵的种质材料，但目前对福安刺葡萄基因组的研究尚为空白，抗病抗逆特性尚未得到充分利用。
为了解刺葡萄遗传特点，本研究开展基于高通量测序的福安刺葡萄基因组初步研究，比对分析刺葡萄与欧亚种葡萄黑比诺[3-4]的遗传差异，有利于了解刺葡萄的遗传背景及遗传演化过程，以期挖掘刺葡萄优良抗性基因，推动对刺葡萄种质资源的开发和利用。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
福安刺葡萄叶片，采自福安刺葡萄种植园。
1.2 试验方法
1.2.1 测序文库构建、检测与高通量测序
超声片段化刺葡萄基因组DNA，以便获得400~500 bp的DNA片段；将所述DNA片段进行末端修复，补平断口；再将所述DNA片段加A后与特定接头相连，获得连接产物，筛选特定大小片段；最终利用特异序列将所述目的片段进行PCR扩增，获得的扩增产物构成高通量测序文库。
Qubit@2.0测定DNA浓度，Agilent 2000 DNA chip检测文库插入片段大小，Q-PCR定量文库浓度。最终稀释文库至合适浓度，cBOT自动成簇，illuminar 2000 PE250模式双端测序。
1.2.2 高通量测序数据的处理
trim_galore检测并去除测序数据中的index和adapter污染，保留Q20测序数据，获得clean reads。将clean reads利用bowtie2程序 (http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/index.shtml) 比对至黑比诺葡萄参考基因组 (vinifera_145_genoscope.12x, https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。以生成的比对bam文件为输入文件，freebayes程序 (https://github.com/ekg/freebayes) 计算分析可能存在的遗传多态性位点 (small polymorphisms)，生成标准vcf文件用于SNPEFF (http://snpeff.sourceforge.net/SnpEff.html) 进一步解析。
2. 结果与分析
2.1 检测文库与高通量测序数据的质量检测
超声片段化基因组DNA，吸附获得DNA片段，经检测使用片段化后DNA构建的测序文库大小符合预期，峰值位于550 bp左右，呈现正态分布，片段集中 (图 1)，达到illuminar 2000测序要求。
所构建刺葡萄基因组测序文库上机后，共获得33 501 200条raw reads，8.4 G数据量，Q30质量指标0.938 1，表明此次测序效果良好，数据可信度高。若以葡萄基因组471 M大小为参考，则本次刺葡萄基因组测序深度约为17.8 X。使用trim_galore后获得clean reads约占raw reads的96.2%。
2.2 刺葡萄高通量测序reads比对情况分析
使用bowtie2比对刺葡萄clean reads至黑比诺葡萄基因组，共有34.75%的reads有且只有1个位点精确配对，23.71%的reads有多个位点的匹配，41.54%的reads没有匹配。
2.3 刺葡萄基因组与葡萄基因组的遗传差异
以葡萄基因组序列为参考，刺葡萄基因组片段化读长 (reads) 与之相比，存在SNP (single nucleotide polymorphisms，单核苷酸多态性)、indel (insert/, 插入/缺失)、MNP (multi-nucleotide polymorphisms，多核苷酸多态性) 差异共计3 192 484处，平均每152 bp存在1个差异位点 (1 variant every 152 bases)，见表 1。
表 1 刺葡萄与葡萄基因组遗传差异Table 1. Genetic variants of V.davidiidetermined by comparing genomes of grape varieties染色体 染色体长度/bp 遗传差异数/个 遗传差异率/(bp·差异-1) 1 23037639 172435 133 2 18779844 110172 170 3 19341862 112461 171 4 23867706 179247 133 5 25021643 183681 136 6 21508407 170936 125 7 21026613 161855 129 8 22385789 202686 110 9 23006712 137911 166 10 18140952 117766 154 11 19818926 153580 129 12 22702307 159011 142 13 24396255 164821 148 14 30274277 210515 143 15 20304914 120874 167 16 22053297 126617 174 17 17126926 134454 127 18 29360087 216932 135 19 24021853 145933 164 1_random 568933 2995 189 3_random 1220746 7883 154 4_random 76237 543 140 5_random 421237 3224 130 7_random 1447032 6758 214 9_random 487831 737 661 10_random 789605 3497 225 11_random 282498 1756 160 12_random 1566225 9315 168 13_random 3268264 15616 209 16_random 740079 365 2027 17_random 829735 4596 180 18_random 5170003 27137 190 Un 43154196 126175 342 Total 486198630 3192484 152 其中位于基因间区的多态性位点约占总数的30.34%，数目最大；其次是基因上游、下游区域，分别为18.763%和20.854%；基因外显子、内含子区比例为3.67%、24.071%(表 2)。
表 2 不同基因区遗传差异所占比例Table 2. Percentage of variants in different genetic regions基因间区 SNP位点 所占比例/% 基因下游区 1104311 20.854 外显子区 194335 3.670 内含子区 1274699 24.071 基因上游区 993575 18.763 基因间区 1606641 30.34 以SNP数据为参考，检测到刺葡萄基因组中转换 (transitions，嘌呤之间替换或嘧啶之间替换) 数2 616 895，颠换 (transversions，嘌呤和嘧啶之间的替换) 数1 410 733，Ts/Tv比率 (transitions /transversions) 为1.855。同源SNP位点 (homo-type SNP)1 863 237个，异源SNP位点 (hetero-type SNP)1 244 590个，SNP分析基因型结果表明试验用福安刺葡萄在多数等位位点上存在不同的核苷酸类型，相同位置等位基因数最大为2，故初步认为福安刺葡萄有可能为异源二倍体的杂合体，但仍有待通过进一步试验进行验证。
3. 讨论与结论
葡萄属包含圆叶葡萄亚属Muscadinia Planch和真葡萄亚属Euvitis Planch。其中真葡萄亚属内物种通常按原产地划分为欧亚、东亚和北美3个种群，共70余种，且属内种间可以自由杂交，不存在遗传障碍[5]。目前，生产栽培的优良品种多属于欧亚种、北美种及其杂交后代或栽培变种，优良经济性状的有利基因在现有栽培种中已充分利用。作为葡萄属中最大种群的东亚种群，在抗病、抗逆育种资源方面蕴藏着不少珍贵的种质，刺葡萄就是其中重要的种质资源之一。
刺葡萄植株强健，枝梢上密布直立或稍弯皮刺，果皮厚，多籽，品质较好，产量高，与生产栽培种相比，刺葡萄具有抗湿热、抗病性强[6]的优良特性，因而越来越受到人们的重视与利用。自张浦亭等[7]首次在江西玉山县发现由野生刺葡萄经驯化栽培而成的‘塘尾’刺葡萄，研究者陆续利用本地特色刺葡萄野生资源进行人工驯化栽培与优系选育，得到了‘雪峰’[8]、‘紫秋’[9]、‘水晶’[10]、‘惠良’[11]、‘福安’等刺葡萄品种，其在器官形态、果实理化性状等方面存在差异[12-15]。其中，福安刺葡萄为两性花类型，可自花结实[2]，本研究采用高通量测序方法获得福安刺葡萄基因组，并与欧亚种葡萄进行序列比对，结果显示福安刺葡萄异源SNP位点1 244 590个，且在多数等位位点上存在不同的核苷酸类型，相同位置等位基因数最大为2，表明福安刺葡萄有可能是异源二倍体，但仍需进一步研究验证。由于闭花自交植物，随着繁殖代数的增加，其纯合度高，这与本试验福安刺葡萄为异源杂合体的结果不符，因此推测刺葡萄花器在原始状态时为单性花，经异花授粉产生后代，遗传上表现异源杂合特点，此后在人类选择栽培过程中，野生葡萄由清一色的雌雄异株出现了雌雄同株[5]，产生了两性花类型。焦健等[16]在对刺葡萄两性花类型的研究中，发现刺葡萄种内的两性花类型含有仅存在于欧亚种葡萄的VvmyBA1a基因，因此，刺葡萄两性花类型的出现是驯化过程的自然变异还是混入欧亚种的遗传基因，也有待进一步研究。
刺葡萄属于葡萄属东亚种群，资源分布区域较广，生态环境复杂多样，其种内变异多样性值得重视。有学者对东亚种群主要野生种的初步研究表明，其抗病性差异存在于类型间、株系间，表现为复杂的种内多样性[5]。目前，有关刺葡萄的遗传研究多集中于分子标记与聚类分析考量亲缘关系[17-19]，种内与表型相关的特异基因差异尚不完全明确。而本研究尝试利用高通量测序手段对刺葡萄进行分析，有利于全面揭示刺葡萄遗传背景，深入发掘和利用刺葡萄种质资源中的特异基因。
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图 1 栽培和野生七叶一枝花土壤细菌物种数量16S rRNA 相似水平为 97%的稀释性曲线
Figure 1. Rarefaction curves on counts of microbes with 97% 16S rRNA similarity in cultivated and wild P. polyphylla soils
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图 2 栽培和野生七叶一枝花土壤细菌物种（OTU）组成的韦恩图分析
Figure 2. Venn analysis on microbial OTUs of cultivated and wild P. polyphylla soils
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图 3 门（A）和属（B）水平的微生物组成、相对丰度分析
Figure 3. Composition and relative abundance of dominant microbes at phylum level (A) and genus level (B)
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图 4 栽培和野生七叶一枝花土壤细菌物种的Alpha多样性指数
Figure 4. Alpha diversity of microbes in cultivated and wild P. polyphylla soils
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图 5 LDA Effect Size组间群落的差异分析
Figure 5. LDA Effect Size on differential abundant microbes
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图 6 基于OTU水平的Principal co-ordinates analysis分析
Figure 6. Principal coordinates analysis (PCoA) based on OTU of 8 samples
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图 7 不同栽培方式七叶一枝花土壤的unweighted.unifrac差异性矩阵热图（相似水平97%）
Figure 7. Heatmap of unweighted.unifrac dissimilarity matrix on microbes in cultivated and wild P. polyphylla soils (Similar level 97%)
表 1 栽培和野生七叶一枝花土壤样本信息
Table 1 Information on cultivated and wild P. polyphylla soils
编号
Code采集地
Locality栽培模式
Transplanting modes栽培年限
Transplanting period/aYR1 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 野生 — YNR1 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 野生 — YR2 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 野生 — YNR2 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 野生 — ZR1 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 栽培 5 ZNR1 福建省南平市建瓯吉阳镇郭岩山双龙庙 栽培 5 ZR2 福建省南平市政和县官湖村王坑陇 栽培 2 ZNR2 福建省南平市政和县官湖村王坑陇 栽培 2 YR和ZR分别代表野生和栽培的根际土壤，YNR和ZNR分别代表野生和栽培的非根际土壤。
YR and ZR represent wild and cultivated rhizosphere soils, respectively; YNR and ZNR represent wild and cultivated non-rhizosphere soils, respectively.
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表 2 栽培和野生七叶一枝花土壤养分含量
Table 2 Nutrient contents of cultivated and wild P. polyphylla soils
编号
CodepH 有机质
Organic matter/(g·kg−1)全氮
Total nitrogen/(g·kg−1)全磷
Total phosphorus/(g·kg−1)全钾
Total potassium/(g·kg−1)YR1 5.20±0.30ab 118.00±6.81a 2.60±0.15ab 0.70±0.04a 3.20±0.18a YNR1 5.30±0.31ab 105.30±6.08a 1.90±0.11de 0.50±0.03b 3.30±0.19a YR2 5.90±0.34ab 110.10±6.36a 1.40±0.08f 0.80±0.05a 1.50±0.09c YNR2 5.70±0.33ab 107.10±6.18a 1.40±0.08f 0.70±0.04a 1.90±0.11b ZR1 6.30±0.36a 60.70±3.50b 2.30±0.13bc 0.30±0.02c 1.50±0.09c ZNR1 6.30±0.36a 56.80±3.28b 2.70±0.16a 0.40±0.02bc 1.70±0.10bc ZR2 5.10±0.29b 70.30±4.06b 2.20±0.13cd 0.50±0.03b 1.00±0.06d ZNR2 5.30±0.31ab 39.70±2.29c 1.80±0.10e 0.40±0.02bc 1.10±0.06d 同列数据后不同小写字母代表处理间差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences ( P＜0.05).
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表 3 栽培和野生七叶一枝花土壤的细菌分离数量
Table 3 Plate counts of cultivated and wild P. polyphylla soils
样品名称
Sample name细菌含量
Bacterial content /
(×106 cfu·g−1)样品名称
Sample name细菌含量
Bacterial content /
(×106 cfu·g−1)YR1 5.05 ZR1 3.50 YNR1 4.70 ZNR1 6.85 YR2 8.10 ZR2 5.50 YNR2 8.55 ZNR2 1.75
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表 4 栽培和野生七叶一枝花土壤样本不同分类阶元细菌物种（OTU）数量
Table 4 Number of microbes (OTU) at different taxonomical levels of cultivated and wild P. polyphylla soils
样本
SampleOTU 门水平
Phylum level纲水平
Class level目水平
Order level科水平
Family level属水平
Genus level种水平
Species levelYR1 1173 19 31 44 73 114 125 YNR1 1049 21 30 46 77 123 131 YR2 1122 20 28 42 73 114 130 YNR2 1173 19 29 40 70 117 128 ZR1 1198 21 31 47 78 142 140 ZNR1 1417 21 31 48 81 138 149 ZR2 630 20 27 34 62 88 85 ZNR2 904 20 27 36 64 108 104
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表 5 栽培和野生七叶一枝花土壤细菌物种的Alpha多样性指数
Table 5 Alpha diversity of microbes in cultivated and wild P. polyphylla soils
样本 Sample Chao指数
Chao indexAce指数
Ace indexShannon指数
Shannon indexSimpson 指数
Simpson index覆盖率
CoverageYR1 1383.4930 1353.6621 5.2116 0.0200 0.9929 YNR1 1252.7638 1229.8781 5.1894 0.0166 0.9933 YR2 1266.0820 1239.7667 5.4007 0.0143 0.9943 YNR2 1347.2803 1314.3759 5.1740 0.0303 0.9937 ZR1 1318.3147 1313.4214 5.5856 0.0112 0.9944 ZNR1 1544.8750 1515.2990 5.9857 0.0070 0.9944 ZR2 758.2692 708.8108 4.1124 0.0588 0.9967 ZNR2 1013.1720 995.5008 5.0457 0.0211 0.9956
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表 6 门和属水平的微生物组间群落显著性的差异分析
Table 6 Differential abundant microbes at phylum and genus levels
分类水平
Classification level细菌名称
Bacterial name丰富度 Abundance P值
P value栽培 Transplanting 野生 Wild 门
Phylum厚壁菌门 Firmicutes 0.0047 ±0.0009b 0.0713 ±0.0066a 0.0001 硝化螺旋菌门 Nitrospirae 0.0071 ±0.0039a 0.0309 ±0.0052a 0.0107 绿弯菌门 Chloroflexi 0.0617 ±0.0045a 0.0446 ±0.0062a 0.0659 螺旋菌门 Spirochaetae 0.0002 ±0.0002b 0.0009 ±0.0001a 0.0133 属
Genus芽孢杆菌属 Bacillus 0.0015 ±0.0004b 0.0337 ±0.0022a 0.0000 Dyella 0.0022 ±0.0013a 0.0106 ±0.0038a 0.0797 类芽孢杆菌属 Paenibacillus 0.0015 ±0.0005b 0.0245 ±0.0049a 0.0033 Tumebacillus 0.0017 ±0.001b0.0101 ±0.0024a 0.0186 Shimazuella 0.0000 ±0.0000b 0.0028 ±0.0007a 0.0052 Mucilaginibacter 0.0016 ±0.0008a 0.0069 ±0.0023a 0.0689 Bryobacter 0.0195 ±0.0026a 0.0082 ±0.0008b 0.0064 硝化螺旋菌属 Nitrospira 0.0022 ±0.0013b 0.0068 ±0.001a0.0322 分枝杆菌属 Mycobacterium 0.0007 ±0.0001b 0.0013 ±0.0001a 0.0115 丰佑菌属 Opitutus 0.0030 ±0.0007a 0.0009 ±0.0002b 0.0315 中华单胞菌属 Sinomonas 0.0003 ±0.0002a 0.0000 ±0.0000a 0.0826 Dokdonella 0.0001 ±0.0001a 0.0004 ±0.0001a 0.0692 Candidatus_Entotheonella 0.0001 ±0.0001a 0.0005 ±0.0001a 0.0615 Bryocella 0.0006 ±0.0002a 0.0000 ±0.0000b 0.0400 Singulisphaera 0.0001 ±0.0000b 0.0002 ±0.0000a 0.0148 纤线杆菌属 Ktedonobacter 0.0003 ±0.0000a 0.0000 ±0.0000b 0.0015
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表 7 七叶一枝花土壤微生物多样性与土壤理化性质的Pearson相关性分析
Table 7 Pearson correlation between microbial diversity and physicochemical properties of P. polyphylla soil
项目
ItemspH 有机质
Organic
matte全氮
Total
nitrogen全磷
Total
phosphorus全钾
Total
potassium细菌含量
Bacterial
contentChao指数
Chao
indexAce指数
Ace
indexShannon指数
Shannon
indexSimpson 指数
Simpson
index覆盖度
coveragepH 1 有机质 Organic matter 0.043 1 全氮 Total nitrogen 0.718 0.509 1 全磷 Total phosphorus −0.765 0.307 −0.110 1 全钾 Total potassium 0.969* 0.011 0.805 −0.618 1 细菌含量 Bacterial content 0.309 0.660 0.884 0.365 0.451 1 Chao指数 Chao index 0.946 −0.174 0.699 −0.664 0.983* 0.323 1 Ace指数 Ace index 0.950 −0.196 0.671 −0.696 0.978* 0.282 0.999** 1 Shannon 指数 Shannon index 0.912 −0.339 0.552 −0.742 0.934 0.145 0.982* 0.988* 1 Simpson 指数 Simpson index −0.832 0.519 −0.333 0.823 −0.824 0.100 −0.907 −0.923 −0.970* 1 覆盖度 Coverage −0.958* 0.242 −0.534 0.849 −0.928 −0.088 −0.959* −0.970* −0.976* 0.954* 1 *和**分别表示在0.05和0.01水平上相关性显著。
* and * * indicate significant correlation at 0.05 and 0.01 levels, respectively.
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