Vector Construction and Immunogenicity of S and N Gene DNA Vaccine for TGEV
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摘要:目的
构建猪传染性胃肠炎病毒（transmissible gastroenteritis virus, TGEV）S、N基因的DNA疫苗载体，并进行免疫原性试验，为猪传染性胃肠炎（transmissible gastroenteritis, TGE）的防控和DNA疫苗研究提供技术支撑和基础数据。
方法扩增S基因的A位点、D位点和N基因，并将N基因（单独）、A位点和D位点（融合）克隆至pCDNA3.1-His-C构建重组疫苗载体，运用生物信息学软件预测分析S（A-D）蛋白、N蛋白二级结构组成、三级构像、亚细胞定位和优势B细胞抗原表位。将构建成功的重组载体分别转染至PK-15细胞进行间接免疫荧光试验，运用共聚焦检测重组蛋白的表达分布情况。将重组疫苗载体单独或联合免疫小鼠，运用间接ELISA检测IgG抗体水平。
结果扩增出S基因的A位点、D位点和N基因，大小分别为498、606、
1149 bp。构建了A位点与D位点（融合）、N基因（单独）的DNA疫苗重组载体p-S（A-D）-His和p-N-His。生物信息学软件预测分析发现TGEV感染宿主细胞时N蛋白主要定位于细胞核和线粒体，S（A-D）蛋白主要定位于细胞质和线粒体，S（A-D）蛋白具有7个优势B细胞抗原表位，N蛋白具有8个优势B细胞抗原表位。重组载体p-S（A-D）-His和p-N-His均在PK-15细胞内成功表达，且S（A-D）-His和N-His在PK-15细胞核和细胞质中均有分布。重组疫苗载体免疫小鼠后，免疫效果由高至低依次为p-N-His＞p-S（A-D）-His + p-N-His＞p-S（A-D）-His。结论本研究构建了TGEV的 S、N基因的DNA疫苗载体，免疫小鼠后均产生了较强的特异性抗体，为TGEV的核酸疫苗的研制提供了基础材料和依据。
Abstract:ObjectiveDNA vaccine vector of S and N genes of porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV) was constructed with the vaccine immunogenicity determined to pave the way for studying, preventing, and controling TGE.
MethodA and D sites on S and N from a TGEV were amplified. The N gene alone as well as the A and D sites fusion were cloned into the vaccine vector pCDNA3.1-His-C. Bioinformatics software was used to predict and analyze the secondary structure, tertiary configuration, subcellular localization, and dominant B cell epitope of S (A-D) and N proteins. The recombinant vectors were transfected into PK-15 cells, and expression distribution of N and the A and D sites fusion detected by indirect immunofluorescence and confocal detection. Mice were immunized with the single or combined recombinant vaccine vector to detect the IgG antibody using indirect ELISA.
ResultThe A and D sites of the S were 498 bp and 606 bp, respectively, and the N,
1149 bp in length. The nucleic acid vaccine expression vectors p-S (A-D)-His and p-N-His for the A and D sites (fusion) and N were constructed. Bioinformatics software predicted that, when TGEV infected the host cells, N protein was mainly located in the nucleus and mitochondria and S (A-D) largely in the cytoplasm and mitochondria, while S (A-D) had 7 and N, 8 dominant B cell epitopes. All p-S (A-D)-His and p-N-His were successfully expressed in PK-15 cells distributed in the nucleus and cytoplasm. The immunized mice showed an effect of immunity in the order of p-N-His＞p-S (A-D)-His + p-N-His＞p-S (A-D)-His.ConclusionThe DNA vaccine vectors of S and N of TGEV were successfully constructed. Strong specific antibodies were generated in lab mice after the immunization.
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0. 引言
【研究意义】甘薯[Ipomoea batatas (L.) Lam.]为旋花科（Convolvulaceae）甘薯属（Ipomoea）作物，原产地为处于热带美洲的墨西哥地区。浙江省台州市气候温暖湿润，且雨热同步，适宜甘薯的优质高产栽培，历史上一直为浙江省甘薯主产区，常年种植面积为2733 hm2，鲜薯产量16.65万t。该地处于南北薯区交接带、为南北病害混合发生区域[1]。2010年以来，在台州市西部山区发生了甘薯基部腐烂病害，主要症状为甘薯茎基部变褐、坏死，薯块腐烂，甘薯产量损失高达50%以上。该病害为新入侵病害，我国大陆以前未有过此病害发生的报道。2017年，经权威部门在台州市黄岩西部山区甘薯地取样，并通过分离培养、致病性测定、形态学鉴定、柯赫氏法则验证等手段[2]，认为该病害与我国台湾地区黄巧雯等研究的甘薯基腐病是同一病害[3-4]。引起甘薯茎基部腐烂病害发生的病原菌有多种，如甘薯茎腐病菌（Erwinia chrysanthemi）、甘薯基腐病菌（Phomopsis destruens Harter
）、甘薯白绢病菌（Sclerotium rolfsii Sacc）、甘薯根腐病菌（Fusarium solami f.sp.batatas）、甘薯茎枯病菌（Rhizoctonia solani Kuhn）、甘薯干腐病菌（Diaporthe batatatis）等[5-9]。该病害既有可能是各种病原菌单独侵染，也有可能是多种病原菌复合侵染造成[10]。甘薯茎基部腐烂病菌会侵染多种园艺作物，使其发生腐烂病，其宿主包括甘蔗（Saccharum officinarum）、马铃薯（Solanum tuberosum L.）、茄子（S. melongena L.）、西红柿（S. lycopersicum）、包心菜（Brassica oleracea var. capitata L.）和牵牛花[Pharbitis nil (Linn.) Choisy]等50余种作物[11]。2016年，浙江省将此病列入补充检疫性有害生物名单[12-14]。研究甘薯茎基部腐烂病土壤中的微生物群落组成及多样性，对于研究该病害发生规律及探索生物防治途径具有重要意义[15-17]。【前人研究进展】土壤微生物在农田生态系统中参与和推动了营养物质循环和能量流动[18]，其群落结构组成及多样性与作物健康状况紧密相关[19]。高通量测序技术可以高效、快速、准确检测微生物群落的多样性，已被广泛应用于作物根际土壤微生物的研究[20-21]。杨尚东等[22]研究了甘蔗宿根矮化病植株根际土壤的细菌群落结构特征，认为感病植株根际土壤细菌多样性与健康植株相比呈下降现象，土壤变形菌门（Proteobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）和硝化螺旋菌门（Nitrospirae）等优势门类相对丰度呈倍级降低，而绿湾菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）等优势门类相对丰度呈倍级增加。感病植株根际土壤β-葡萄糖苷酶、磷酸酶和氨肽酶活性显著减少。伍文宪等[23]采用高通量测序技术研究了根肿病大白菜和健康植株根际土壤细菌的群落组成差异，结果表明，患病植株根际土壤细菌拟杆菌门（Bacteroidetes）相对丰度显著高于健康植株根际土壤（P＜0.05），而放线菌门（Actinobacteria）相对丰度显著降低（P＜0.05），并且感病植株其根际土壤细菌种群的丰富度和多样性指数也降低。施河丽等[24]的研究表明了烟草青枯病发病烟株根际细菌Chao1指数和Shannon指数有低于健康植株的趋势，发病植株根际土壤细菌芽胞杆菌属（Bacillus）、假单胞菌属（Pseudomonas）和链霉菌属（Sereptomyces）等益生菌相对丰度同健康烟株相比有减少趋势，劳尔氏菌属（Ralstonia）和Rudaea等病原菌属的相对丰度与健康烟株相比有增加趋势。蒋景龙等[21]通过高通量测序技术研究了西洋参根腐病发生规律后，认为红游动菌属（Rhodoplanes）、Kaistobacter属和鞘脂菌属（Sphingobiun）可能是引起该病害发生的主要菌群。【本研究切入点】研究学者对甘薯茎基部腐烂病的研究多集中在病原菌的分离鉴定[9]以及杀菌剂的防控试验[10]。但关于甘薯茎基部腐烂病感病植株根际土壤细菌群落结构的研究还有待深入。【拟解决的关键问题】通过采用Miseq Illumina高通量测序技术，分析比较甘薯茎基部腐烂病感病株和非感病株根际土壤细菌物种组成、群落结构、多样性指数，同时测定和分析甘薯茎基部腐烂病对甘薯根际土壤酶的影响，为揭示甘薯茎基部腐烂病发生的根际微生态机制及研发其综合防控技术提供理论依据。 1. 材料与方法
1.1 研究区概况
研究地选自浙江省台州市黄岩区平田乡天灯垟村甘薯种植区，研究区海拔368 m，东经121.083°、北纬28.547°，为亚热带季风气候。年平均气温16.3～17.7 ℃，年平均降水量1725.3 mm。该甘薯种植区土壤类型为沙壤土，种植面积共有12.2 hm2。甘薯薯苗于2020年4月28日下午扦插，扦插前用三元复合肥（N-P2O5-K2O = 15-15-15）600 kg·hm−2作基肥。甘薯植株间距40 cm，垄距83 cm，扦插密度为30 120 株·hm−2。甘薯品种均为红心黄。扦插前研究区土壤pH值6.1、有机质18.173 g·kg−1、速效钾167.526 mg·kg−1、有效磷75.032 mg·kg−1、全氮1.065 g·kg−1，土壤容重1.283 g·cm−3。
1.2 样品采集
于2021年10月22日在该甘薯种植区进行甘薯根际土壤样品采集。根据余继华[2]和黄立飞等[14]描述的甘薯茎基部腐烂病的特征来确定取样点。选取面积为10 m×10 m、间隔6 m的相邻的3个小区，每小区的土壤类型、肥力水平、施肥条件以及栽培管理措施均一致。在每个小区内随机选取3株具有典型发病症状的甘薯植株，同时选取3株生长健康、没有发病的甘薯植株作为对照。共选取发病和健康植株各9株。
用抖落法收集土样[22]，用直径2 mm的网筛过筛。各处理均取20 g土样装入无菌聚乙烯封口袋中，放入冰盒中低温运输，到实验室后−20 ℃低温保存，取10 g土样用于土壤酶活性测定，另取10 g土样用于细菌高通量测序。
1.3 土壤酶活性测定
土壤脲酶活性采用靛酚比色法测定，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水杨酸比色法测定，碱性磷酸酶活性采用磷酸苯二钠比色法测定[25]。
1.4 土壤细菌高通量测序
1.4.1 土壤细菌基因组DNA提取
采用E.Z.N.A. Soil DNA Kit试剂盒法（D5625，美国Omega公司），提取土样的总DNA。经1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量，使用紫外分光光度计Nano Drop ND-1000（美国Nano Drop公司）对DNA进行定量测定。各样品的5份DNA样品随机取3份等量混均，分别制成3个平行样品，于−20 ℃保存、备用。
1.4.2 PCR扩增及高通量测序
采用细菌16S rDNA V3~V4区段引物来扩增各样品，通用引物为341F（5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）和805R （5′-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3′），对16S rDNA基因V3~V4进行PCR扩增[26]。PCR反应条件为：98 ℃，30 s；98 ℃，10 s；54 ℃，30 s；72 ℃，45 s，35个循环；72 ℃，10 min。PCR产物使用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。在整个DNA提取过程中，使用的是超纯水，而不是样品溶液，以排除假阳性PCR结果作为阴性对照的可能性，PCR产物由AMPure XT beads （Beckman Coulter Genomics，Danvers，MA，USA）纯化，Qubit（Invitrogen，USA）定量。扩增子池用于测序，扩增子文库的大小和数量分别在Agilent 2100生物分析仪（ Agilent，美国）和Illumina（Kapa Biosciences，Woburn，MA，美国）的文库定量试剂盒上进行评估。在NovaSeq PE250平台上对库进行排序。
1.4.3 生信分析流程
根据双端序列的重叠区，采用 Pear将R1、R2序列拼接成长的tag序列， 并使用cutadapter去除barcode以及引物序列。然后Fqtrim过滤 低质量序列，采用Vsearch（v2.3.4）过滤嵌合体。使用DADA2进行降噪后，得到特征表和特征序列。Alpha多样性和Beta多样性通过抽平（将所有样本的序列 数抽取至最少序列样本的序列数）的方式来进行归一化，物种注释使用相对丰度来进行归一化处理。Alpha多样性以及Beta多样性均由QIIME2流程分析，图片由R（v3.5.2）包绘制。物种注释采用QIIME2的插件feature-classifier进行序列比对，比对数据库为SILVA和unite数据库，以 SILVA 数据库注释结果为准。
2. 结果与分析
2.1 健康和发病植株根际土壤酶活性
甘薯茎基部腐烂病的发生明显影响了其植株根际土壤脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶的活性。从表1可以看出，甘薯茎基部腐烂病的发生显著降低了甘薯根际土壤脲酶活性。发病植株根际土壤脲酶活性为（0.26±0.02） mg·g−1·d−1，比健康植株根际土壤脲酶活性的（0.48±0.06） mg·g−1·d−1降低45.83%，差异达显著水平（P＜0.05）。该病害的发生显著降低了甘薯根际土壤蔗糖酶的活性，发病植株根际土壤蔗糖酶的活性为（9.56±0.31） mg·g−1·d−1，比健康植株根际土壤蔗糖酶活性的（24.17±0.19） mg·g−1·d−1降低60.45%，差异达显著水平（P＜0.05）。该病害的发生显著降低了土壤碱性磷酸酶的活性，发病植株根际土壤碱性磷酸酶活性（7.12±0.24） µg·g−1·h−1，比健康植株根际土壤碱性磷酸酶活性（12.89±0.63） µg·g−1·h−1降低44.76 %，差异达显著水平（P＜0.05）。
表 1 甘薯茎基部腐烂病发病植株与健康植株根际土壤酶活性比较Table 1. Enzyme activities in rhizosphere soils of healthy and SPSR-infected sweet potato fields根际土壤
Rhizosphere
soils脲酶活性
Urease activity/
(mg·g−1·d−1)蔗糖酶活性
Invertase activity/
(mg·g−1·d−1)碱性磷酸酶活性
Alkaline phosephatase/
(µg·g−1·d−1)发病植株
Infected0.26±0.02 b 9.56±0.31 b 7.12±0.24 b 健康植株
Non-infected0.48±0.06 a 24.17±0.19 a 12.89±0.63 a 同列数值后不同小写字母表示处理间差异在5%水平上显著。
Values followed by different small letters in the column are significantly different at 5% level.2.2 发病与健康甘薯植株根际土壤细菌Alpha多样性分析
本研究中2组共6个样品测序深度已经足够。文库的覆盖率均已大于98%，取样基本合理，样品的OTUs覆盖度已经饱和，测序结果包含了大多数细菌类群，完全能够说明样品中绝大多数的细菌多样性信息。
Miseq测序分析所得样品数据经质检后，所有样品获得的细菌有效序列总数141367，OTUs总数为7786个，发病株有效序列读数70517，分归于6493个OTUs，有效序列比例77.52%。健康植株土壤细菌有效序列读数为70850，分归于6102个OTUs，有效序列比例82.90%。发病植株土壤细菌的OTUs数要高于健康植株，但差异未达显著水平。发病植株与健康植株土壤细菌共有的OTUs数是4809个，占总数的61.76%。发病植株土壤细菌特有的OTUs数1684个，占总数的21.63%。健康植株土壤细菌特有的OTUs数1293个，占总数的16.61%（图1）。
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图 1 基于操作分类单元丰度的土壤细菌群落维恩图Figure 1. Venn diagram of microbial communities in rhizosphere soil发病与健康植株根际土壤细菌物种丰富度指数（Chaol指数）和多样性指数（Shannon指数）区别较大。如表2所示，Shannon指数和Chaol指数均以发病株根际土壤为高，其值分别为10.78和6906.24，比健康植株根际土壤的10.50和6625.01分别高2.67%和4.24%。从细菌群落丰富度指数（Chao1指数）来看，发病植株与健康植株的差异达显著水平。从细菌群落多样性指数（Shannon 指数）来看，发病植株与健康植株的差异未达显著水平。
表 2 发病与健康甘薯植株根际土壤细菌Alpha多样性Table 2. Alpha diversity of microbial communities in rhizosphere soils of healthy and SPSR-infected sweet potato fields根际土壤样品
Rhizosphere soils物种数
Observed speciesChao1指数
Chao1 index辛普森指数
Simpson index香农指数
Shannon index覆盖度
Coverage/%发病植株 Infected 6 493.00 a 6906.24±11.02 a 0.98±0.01 a 10.78±0.03 a 98.35 健康植株 Non-infected 6 072.00 b 6625.01±13.11 b 0.97±0.03 a 10.50±0.05 a 98.61 同列不同小写字母表示差异显著（P＜0.05）。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant difference at P＜0.05.2.3 发病与健康植株根际土壤细菌门分类水平组成
经检测，甘薯茎基部腐烂病发病植株与健康植株根际土壤中相对丰度>1%的优势细菌门有11个，各菌门在总细菌门群落中的相对丰度如图2所示。各样品土壤细菌的优势门类及相对丰度分别是：变形菌门（Proteobacteria）32.55%和33.05%、放线菌门（Actinobacteria）21.11%和24.51%、酸杆菌门（Acidobacteria）17.85%和16.65%、绿湾菌门（Chloroflexia）5.55%和4.01%、浮霉菌门（Planctomycetes）4.48%和4.05%、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）3.91%和3.45%、厚壁菌门（Firmicutes）3.65%和3.30%、拟杆菌门（Bacteroidetes）1.56%和2.52%、疣微菌门（Verrucomicrobia）1.69%和1.92%、未分类细菌（Bacteria-unclassified）1.93%和1.31%，还有Candidate-division-wps-2 1.76%和1.27%。从上述可以看出，甘薯感染茎基部腐烂病后，其根际土壤细菌相对丰度降低的细菌门有：变形菌门、放线菌门、拟杆菌门、疣微菌门，其中后3种菌门的相对丰度降低程度与健康植株相比达显著水平（P＜0.05）。而相对丰度增加的细菌门有：酸杆菌门、绿湾菌门、浮霉菌门、芽单胞菌门、厚壁菌门、未分类细菌门和Candidate-division-wps-2。其中绿湾菌门、未分类细菌门和Candidate-division-wps-2的相对丰度与健康植株的差异程度达显著水平（P＜0.05）。这说明甘薯在感染茎基部腐烂病后，其植株根际土壤微生物群落中存在的拮抗平衡关系受到了破坏。
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图 2 甘薯茎基部腐烂病发病与健康甘薯植株根际土壤细菌门水平群落结构Figure 2. Compositions of microbial communities in rhizosphere soils of healthy and SPSR-infected sweet potato fields at phylum level2.4 发病与健康植株根际土壤细菌属分类水平组成
甘薯茎基部腐烂病发病植株与健康植株根际土壤细菌在属分类水平上优势菌群及其相对丰度如图3所示。发病植株与健康植株根际土壤属水平上的优势菌群及其相对丰度分别是：未分类的链霉菌属（Streptomycetaceae-unclassified）5.23%和8.43%、GP16.52%和5.33%、未分类的β-变形菌属（Betaproteobacteria-unclassified）3.09%和3.2%、Gaiella3.10%和2.95%、Planctomycetaceae-unclassified2.98%和2.7%、GP22.75%和2.65%、芽单胞菌属（Gemmatimonas）2.76%和2.34%、GP32.31%和2.21%、未分类的厚壁菌属（Firmicutes-unclassified）2.48%和1.75%、伯克霍尔德菌属（Burkhoideria）1.75%和1.99%、未分类的γ-变形菌属（Grammaproteobacteria-unclassified）1.64%和1.98%、未分类的α-变形菌属（Alphaproteobacteria-unclassified）1.65%和1.79%、未分类的绿湾菌属（Chloroflexi-unclassified）2.07%和1.34%、未分类的黄单胞菌属（Xanthomonadaceae-unclassified）2.01%和1.39%、纤线杆菌属（Ktedonobacter）1.61%和1.75%、WPS-2-Genera-incertaesedis 1.76%和1.21%、Acidobacteria-GP1-unclassified 1.50%和1.45%、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）1.38%和1.50%、GP61.33%和1.48%、链嗜酸菌属（Streptacidiphilus）0.58%和1.71%。从上述可以看出，甘薯感染甘薯茎基部腐烂病后，其根际土壤细菌在属分类水平上其相对丰度增加的有：Planctomycetaceae-unclassified、GP1、GP2、芽单胞菌属（Gemmatimonas）和未分类的厚壁菌属。其中GP1、未分类的厚壁菌属（Firmicutes-unclassified）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）相对丰度的增加程度达显著水平（P＜0.05）。土壤细菌在属分类水平上相对丰度降低的有：未分类的链霉菌属（Streptomycetaceae-unclassified）、伯克霍尔德菌属（Burkhoideria）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、链嗜酸菌属（Streptacidiphilus）以及线杆菌属（Ktedonobacter）、未分类的黄单胞菌属（Xanthomonadaceae-unclassified）。发病植株其根际土壤细菌在属分类水平上相对丰度降低的还有芽胞杆菌属（Bacillus）和硝化螺旋菌属（Nitrospirae）。其中，链嗜酸菌属（Streptacidiphilus）、伯克霍尔德菌属（Burkhoideria）相对丰度的降低程度达显著水平（P＜0.05）。
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图 3 甘薯茎基部腐烂病发病与健康植株根际土壤细菌属水平群落结构Figure 3. Compositions of microbial communities in rhizosphere soils of healthy and SPSR-infected sweet potato fields at genus level3. 讨论
3.1 甘薯茎基部腐烂病发病与健康植株根际土壤细菌多样性指数变化特征
本研究结果表明，甘薯茎基部腐烂病发病植株根际土壤细菌群落丰富度指数（Chao1指数）显著高于健康植株，二者之间的差异达显著水平。土壤细菌多样性指数（Shannon指数）高于健康植株，但差异未达显著水平。这与在其他作物病害的类似研究结果不一。如伍文宪等[23]的研究表明大白菜根肿病的发生降低了其植株根际土壤中细菌种群的丰富度和多样性程度。杨尚东等[22]的研究结果也表明甘蔗感病植株根际土壤细菌的Chaol指数和Shannon指数与非感病植株相比显著下降。但向立刚等[27]的研究结果表明感染青枯病烟株的根际土壤细菌群落多样性高于健康烟株根际土壤样品。因此，单就细菌群落多样性指数来说，本研究在甘薯茎基部腐烂病的研究结果与向立刚等在烟株青枯病方面的研究结果是一致的。
3.2 甘薯茎基部腐烂病发病植株根际土壤细菌门水平和属水平上群落组成特征
有研究表明，作物土传病害的发生是因为土壤微生物间的生态位竞争造成微生物群落结构失衡而引发的[28]。本研究表明，甘薯茎基部腐烂病发病植株与健康植株根际土壤细菌群落组成，如细菌的门类和属类组成基本类似。但有的菌群相对丰度变化较大，如在门水平上感病植株与非感病植株相比，根际土壤细菌放线菌门相对丰度下降了13.872 %，达显著水平（P＜0.05）。放线菌能够分解土壤中一些芳香化合物、纤维素和木质素，以及一些氰等毒性强的化合物。土壤细菌菌群中放线菌门相对丰度的大小可以代表土壤的健康状况[29]。在属水平上，发病植株根际土壤未分类的黄单胞菌属（Xanthomonadaceae-unclassified）相对丰度比健康植株增加了44.61%，差异达显著水平（P＜0.05），而该属菌群是革兰氏阴性植物病原菌。链霉菌属（Streptomycetaceae）是目前主要的生防菌菌群，在防治草莓灰霉病[30]和烟草青枯病[31]以及马铃薯晚疫病[32]方面均有着明显的防治效果。本研究在甘薯茎基部腐烂病植株根际土壤中检测到该菌群的相对丰度只有5.23%，比健康植株下降了37.959%，差异达显著水平（P＜0.05），说明该菌属对甘薯茎基部腐烂病也存在着拮抗效应，而该菌群相对丰度的降低则引起了甘薯茎基部腐烂病的发生。另外如芽胞秆菌属（Bacillus）对外界不良环境具有较强的抵抗能力，硝化螺旋菌（Nitrospira）可将亚硝酸盐氧化成硝酸盐，是一类具有硝化功能的细菌菌属，在发病植株根际土壤细菌中这些菌属其相对丰度比健康植株要低，差异达显著水平（P＜0.05）。说明甘薯茎基部腐烂病的发生是由于土壤细菌一些功能菌群的降低和一些致病菌的增加引起的。
3.3 甘薯茎基部腐烂病发病植株根际土壤酶活性变化特征
土壤酶酶促土壤中的各种生物化学反应，能灵敏地指示土壤生化过程对环境变化的响应[29，33]。在农田土壤中脲酶专一性水解尿素等有机氮生成氨等无机氮[30]。土壤蔗糖酶参与了土壤有机质的转化过程，可将土壤中的蔗糖分子水解为易被植物所吸收的葡萄糖和果糖等物质[31]。土壤中碱性磷酸酶活性反映土壤微生物的呼吸量和总生物量，反映了土壤中N、P、K元素的有效性[34]。本研究结果表明甘薯在感染甘薯茎基部腐烂病后，其根际土壤酶如脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性与健康植株相比显著下降。甘薯在感染此病后，由于土壤酶活性的改变，会影响根际土壤营养元素的流动与循环，造成农田生态系统的生态失衡。这与许多学者在其他作物病害方面的研究结果是一致的。如游春梅等[35]研究了由连作障碍引发的三七根腐病发病株根际土壤酶特性，发现发病植株根际土壤蔗糖酶、脲酶、磷酸酶活性均低于正常未感病植株，并且2种土壤蔗糖酶和脲酶活性的差异达显著水平（P＜0.05），2种土壤磷酸酶活性的差异达显著水平（P＜0.05）。李雪萍等[36]在甘肃省卓尼县青稞种植区发现青稞根腐病发病株根际土壤蔗糖酶、脲酶、碱性磷酸酶活性显著低于未发病植株。史普酉等[37]在云南比较了不同黑胫病发病程度下烤烟植株土壤酶活性变化，结果发现随着烟株发病程度的加重，其根际土壤脲酶、蔗糖酶活性也呈下降趋势。这说明了土壤酶活性可用来预测作物病害的发生和严重程度。
4. 结论
甘薯茎基部腐烂病显著降低了根际土壤脲酶、蔗糖酶和碱性磷酸酶活性（P＜0.05），显著提高了根际土壤细菌群落丰富度指数。在门分类水平上，甘薯茎基部腐烂病植株根际土壤细菌放线菌门、疣微菌门和拟杆菌门菌群相对丰度显著降低（P＜0.05），而绿湾菌门和Candidate-division-wps-2菌群的相对丰度显著增加（P＜0.05）。从属分类水平上与健康植株根际土壤比较，发病植株根际土壤细菌GP1、未分类的厚壁菌属（Firmicutes-unclassified）和芽单胞菌属（Gemmatimonas）的相对丰度显著增加（P＜0.05），而未分类的链霉菌属（Streptomycetaceae-unclassified）、链嗜酸菌属（Streptacidiphilus）、伯克霍尔德菌属（Burkhoideria）等的相对丰度显著降低（P＜0.05）。其研究结果可为开发该病害的生物防治技术途经提供依据。
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图 1 质粒p-S(A-D)-His构建模式
A：质粒p-S（A-D）-His图谱；B：A位点与D位点连接示意图；C：A位点与D位点连接碱基序列图。
Figure 1. The model diagram of plasmid p-S(A-D)-His construction
A: the plasmid p-S(A-D)-His profile; B: the diagram of the connection between site A and site D; C: the sequence diagram of connecting bases at sites A and D.
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图 2 TGEV S基因A、D位点扩增结果
A：A位点扩增结果；M为DNA分子质量标准DL2000，1为扩增的A位点。B：D位点扩增结果；M为DNA分子质量标准DL2000，1为扩增的D位点。
Figure 2. Amplified A and D sites of TGEV S gene
A: amplification results of A site; M was DNA Marker DL2000, 1 was the PCR-amplified A site. B: amplification results of D site; M was DNA Marker DL2000, 1 was the PCR-amplified D site.
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图 3 TGEV N基因扩增结果
M：DNA分子质量标准DL2000；1、2：扩增的N基因。
Figure 3. Amplified N gene of TGEV
M: DNA marker DL2000; 1, 2: PCR-amplified N gene.
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图 4 S基因A位点重组载体p-S（A）-His的构建与鉴定
M：DNA分子质量标准DL2000；1、2：重组载体p-S（A）-His的单酶切；3、4：重组载体p-S（A）-His的双酶切。
Figure 4. Construction and identification of p-S (A)-His and p-S (D)-His at A and D sites of S gene
M: DNA marker DL2000; M2: DNA marker DL10000; 1: single enzyme digestion of recombinant vector p-S (A)-His; 2: single enzyme digestion of recombinant vector p-S (D)-His; 3 and 4: double digestion of recombinant vector p-S (A)-His.
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图 5 重组载体p-S（A-D）-His的构建与鉴定
M：DNA分子质量标准DL2000； 1：重组载体p-S(A-D)-His的单酶切；2：重组载体p-S(A-D)-His的双酶切。
Figure 5. Construction and identification of recombinant vectors p-S (A-D)-His
M: DNA marker DL2000; 1: single enzyme digestion of recombinant vector p-S(A-D)-His; 2: double digestion of recombinant vector p-S (A-D)-His.
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图 6 重组载体p-N-His的构建与鉴定
M：DNA分子质量标准DL5000；1：重组载体p-N-His的双酶切。
Figure 6. Construction and identification of recombinant vectors p-N-His
M: DNA marker DL5000; 1: double digestion of recombinant vector p-N-His.
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图 7 S（A-D）蛋白、N蛋白三级结构同源建模
A：N蛋白结构图；B：N蛋白表面构象图；C：S（A-D）蛋白结构图；D：S（A-D）蛋白表面构象图。
Figure 7. Homologous modeling on tertiary structures of S (A-D) and N protein
A: Structure of N protein; B: image of N protein structure; C: image of S (A-D) protein structure; D: image of S (A-D) protein structure.
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图 8 N基因、S（A-D）片段表达的间接免疫荧光试验
Figure 8. Expressions of N and S (A-D) fragments verified by indirect immunofluorescence assay
表 1 S基因A位点、D位点和N基因扩增引物序列
Table 1 Sequences of primers for amplifications of A and D sites in S gene and N gene
基因
Gene引物
Primers序列（5′−3′）
Sequence（5′−3′）酶切位点
Restriction enzyme cutting siteS基因A位点
A-site in S geneP1 CGCGGATCCATGTTAGTTACCAAACAGCCGT Bam H I P2 CCGGAATTCTATTGTCCAGAAAACGTCAC Eco R I S基因D位点
D-site in S geneP3 CCGGAATTCAAGTTGAAAACACAGCTATT Eco R I P4 TGCTCTAGA ACTATTATCAGACGGTACACC Xba I N基因
N GeneP5 CGCGGATCCATGGCCAACCAGGGAC Bam H I P6 CCGGAATTCGTTCGTTACCTCATCAATT Eco R I 表中加下划线的碱基序列为酶切位点序列。
Cleavage sites are underlined.
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表 2 小鼠分组及免疫程序
Table 2 Groups and procedures of mice immunization
组别
Group疫苗载体种类
Vaccine carrier type免疫剂量
Immunizing dose/μg小鼠数量
Number of mice免疫时间
Immune frequency免疫位置
Immune site1 p-S（A-D）-His 240 6 第1、7、21天 脚底板 2 p-N-His 240 6 第1、7、21天 脚底板 3 p-S（A-D）-His + p-N-His 120+120 6 第1、7、21天 脚底板 4 pCDNA3.1-His-C 240 6 第1、7、21天 脚底板
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表 3 S（A-D）蛋白和N蛋白亚细胞定位预测
Table 3 Predicted subcellular localization of S (A-D) and N proteins
组别
Group亚细胞定位
Subcellular localization可能性
Possibility/%S（A-D）蛋白
S(A-D) protein细胞质 Cytoplasm 34.8 线粒体 Mitochondria 17.4 细胞核 Cell nucleus 13.0 质膜 Plasmalemma 13.0 内质网 Endoplasmic reticulum 8.7 N蛋白
N protein细胞核 Cell nucleus 65.2 线粒体 Mitochondria 17.4 细胞质 Cytoplasm 13.0 溶酶体 Lysosome 4.3
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表 4 S（A-D）蛋白和N蛋白的B细胞抗原表位预测
Table 4 Predicted B cell epitope of S (A-D) and N proteins
蛋白
Protein序号
Number起始位点
Start site结束位点
End site序列
Amino acid sequenceS（A-D）蛋白
S(A-D)protein1 33 43 FDQCNGAVLNN 2 55 62 TTNVQSGK 3 86 101 DSSFFSYGEIPFGVTD 4 195 211 NLNNGFYPVSSSEVGLV 5 233 250 LGMKRSGYGQPIASTLSN 6 281 295 ALWDNIFKRNCTDVL 7 306 318 CPFSFDKLNNYLT N蛋白
N protein1 4 32 QGQRVSWGDESTKTRGRSNSRGRKSNNIP 2 43 87 QGSKFWNLCPRDFVPNGIGNRDQQIGYWNRQTRYRMVKGQRKELP 3 101 108 ADAKFKDK 4 118 146 DGAMNKPTTLGSRGANNESKALKFDGKVP 5 150 189 QLEVNQSRDNSRSRSQSRSRSRNRSQSRGRQQSNNKKDDS 6 201 244 LGVDTEKQQQRSRSKSKERSNSKTRDTTPKNENKHTWKRTAGKG 7 251 271 GARSSSANFGDSDLVANGSSA 8 316 378 DPKTEQFLQQINAYARPSEVAKEQRKRKSRSKSAERSEQEVVPDALIENYTDVFDDTQVEIID
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表 5 免疫小鼠抗TGEV血清IgG间接ELISA检测
Table 5 Anti-TGEV serum IgG in immunized mice detected by indirect ELISA
组别
Group疫苗载体种类
Vaccine carrier type免疫后不同时间抗TGEV血清IgG水平（OD450 nm）
Anti-TGEV serum IgG levels at different time after immunization (OD450 nm)0天
0 days14天
14 days28天
28 days42天
42 days1 p-S（A-D）-His 0.133±0.011 a 0.218± 0.0075 b0.243± 0.0060 c0.401± 0.0100 c2 p-N-His 0.138±0.016 a 0.244± 0.0025 a0.344± 0.0070 a0.504± 0.0141 a3 p-S（A-D）-His + p-N-His 0.142± 0.0050 a0.225± 0.0021 b0.300± 0.0050 b0.471± 0.0075 b4 pCDNA3.1-His-C 0.134± 0.0089 a0.144± 0.0076 c0.141± 0.0069 c0.139± 0.0020 d同列数据小写字母完全不同表示差异显著（P＜0.05），含相同小写字母表示差异不显著（P＞0.05）。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences at P＜0.05; those with same lowercase letters indicate no significant differences at P＞0.05.
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