Comparative transcriptomic analysis of different hemocyte subpopulations in crayfish Cherax quadricarinatus
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摘要:目的
半颗粒细胞（semigranular cell, SGC）和颗粒细胞（granular cell, GC）是螯虾循环血细胞的两大主要类群，它们代表了处于不同发育阶段具有免疫功能的血细胞。了解SGC和GC的功能，可为深入研究甲壳动物血细胞亚群提供基础数据。
方法以红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）为试验对象，运用Percoll不连续密度梯度离心法分离纯化SGC和GC；然后对SGC和GC进行转录组测序，并进行差异分析、GO富集分析以及KEGG富集分析，以探究他们在功能上的差异；最后用实时定量RT-PCR对部分差异基因的表达进行验证。
结果测序获得了红螯螯虾血细胞的非冗余唯一基因（unigene）共
116199 个。这些unigenes的平均长度为763 bp，N50为1313 bp。经对比共发现了4488 个差异表达基因（differentially expressed genes,DEGs），其中3951 个基因在SGC中高度表达，537个基因在GC中高度表达。GO富集分析结果显示：在细胞组分类别中，SGC共富集出7个条目，GC共富集出10个条目；在分子功能类别中，SGC共富集出31个条目，GC共富集出60个条目；在生物过程类别中，SGC共富集出154个条目，GC共富集出102个条目。KEGG富集分析结果显示，SGC共富集出44条通路，GC共富集出10条通路。结论在SGC中高度表达的DEGs主要与细胞增殖、分化、基因表达调控、酶产生、内吞作用和细胞黏附有关；在GC中高度表达的DEGs主要与跨膜转运、代谢、酚氧化酶系统、吞噬作用和抗菌肽的产生有关。
Abstract:ObjectiveSemigranular cell (SGC) and granular cell (GC) are the two primary subpopulations of circulating hemocytes in crayfish, representing distinct stages of immune cell differentiation. This study aims to further elucidate the functions of SGC and GC, providing essential data to facilitate future research on hemocyte subpopulations in crustaceans.
MethodsUsing Cherax quadricarinatus as the experimental model, SGC and GC were isolated and purified via Percoll discontinuous density gradient centrifugation. Transcriptomic sequencing was then conducted on SGC and GC, followed by differential expression analysis, Gene Ontology (GO) enrichment analysis, and Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG) enrichment analysis to investigate their functional divergence. Finally, real-time quantitative RT-PCR was employed to validate the expression of selected differentially expressed genes.
ResultsSequencing identified 116,199 non-redundant unique genes (unigenes) in Cherax quadricarinatus hemocytes. These unigenes had an average length of 763 bp and an N50 of 1,313 bp. A total of 4,488 differentially expressed genes (DEGs) were identified, with 3,951 genes significantly upregulated in SGC and 537 genes showing higher expression in GC. The GO enrichment analysis revealed the following results: in Cellular Component, 7 terms enriched in SGC vs. 10 terms in GC; in Molecular Function, 31 terms enriched in SGC vs. 60 terms in GC; in Biological Process, 154 terms enriched in SGC vs. 102 terms in GC. KEGG analysis identified 44 pathways enriched in SGC and 10 pathways in GC.
ConclusionUltimately, the analysis revealed that: the DEGs enriched in SGC are primarily involved in cellular processes such as proliferation, differentiation, transcriptional regulation, enzyme synthesis, endocytosis, and cell adhesion. In contrast, DEGs enriched in GC are mainly associated with transmembrane transport, metabolic pathways, the prophenoloxidase system, phagocytosis, and antimicrobial peptide synthesis.
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Keywords:
- comparative transcriptome /
- semigranular cells /
- granular cells /
- hemocyte function
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0. 引言
【研究意义】包括对虾、螯虾、蟹等在内的十足目（Decapoda）动物是十分重要的海水或淡水养殖动物，具有重大的商业价值。随着经济甲壳动物养殖规模的扩大和养殖密度的提高，病害问题日益严重，制约了水产养殖业的健康发展。认识甲壳动物免疫系统，研究其作用机制是解决病害问题不可或缺的一环。了解不同血细胞类群的差异是认识免疫系统的基础，然而科学家们尚未就甲壳类动物血细胞的功能达成共识。【前人研究进展】甲壳动物依靠高效的天然免疫系统抵御细菌、病毒等病原体的入侵[1]。血细胞是甲壳类动物免疫系统的关键参与者，参与多种免疫过程，如吞噬、包囊、黑色素化和凝血[1,2]。长期以来，甲壳类动物血细胞主要根据其形态特征分为三大类，即颗粒细胞（granular cell, GC）、半颗粒细胞（semigranular cell, SGC）和透明细胞（hyaline cell, HC）[1,2]。早期的研究假设SGC和GC是属于两个不同谱系的成熟血细胞，而HC是循环中罕见的未成熟细胞[3−5]。最近，通过追踪血细胞的分化过程，我们证明红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）血细胞是沿着一个谱系发育，即GC谱系[6]。GC和SGC是处于不同发育阶段的同一谱系的血细胞。SGC和GC都是功能性免疫细胞。具体来说，SGC还负责针对大型异物的包囊作用[7]，包囊是一种关键的免疫反应机制，可以捕获和清除入侵的病原体[1,8]。GC则负责储存和释放包括酚氧化酶原、抗菌肽、活性酶以及凝集素等在内的免疫活性因子[9, 10]。此外，研究表明HC、SGC和GC均具有吞噬能力，但不同细胞吞噬的对象有所不同[7, 9, 11]。细胞的功能，最终是由其表达的基因所决定的。鉴于血细胞在免疫中的关键性作用，有许多研究采用转录组学方法分析凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）、拟穴青蟹（Scylla paramamosain）、克氏原螯虾（Procambarus clarkii）等甲壳动物的血细胞对病原感染的响应[12−17]。【本研究切入点】绝大多数研究将循环血细胞作为一个整体进行分析，因此无法得知不同细胞类群之间的差异。不同发育阶段血细胞功能的分子基础尚未完全清晰。【拟解决的关键问题】本研究以红螯螯虾为试验模型，通过密度梯度离心分离红螯螯虾的两个优势血细胞群SGC和GC，并通过转录组测序比较其基因表达谱，从基因表达的层面解析SGC和GC在功能上的差异，深入探究甲壳动物血细胞的功能分化，以及不同类群细胞对病原感染的响应，进一步深入对两种血细胞群功能及分化和成熟过程的机理研究。
1. 材料与方法
1.1 试验动物
红螯螯虾[平均体重（55±5）g，雄性]购自广东省汕头市某养殖场。饲养于25 ℃左右的淡水环境中，每两日换水一次，每日投喂饲料一次，在实验室条件下适应7 d后用于后续试验。试验动物使用前经实时荧光定量PCR检测，确认未感染白斑综合症病毒（white spot syndrome virus, WSSV）和十足目彩虹病毒1 （decapod iridescent virus 1, DIV1）。病原检测采用厦门智汇联丰生物科技有限公司生产的白斑综合症病毒荧光定量PCR检测试剂盒，以及十足目彩虹病毒1荧光定量PCR检测试剂盒。
1.2 SGC和GC的分离和收集
依据本实验室建立的Percoll不连续密度梯度离心法分离纯化SGC和GC[18]。从红螯螯虾体内收集血淋巴，并立即与等体积的抗凝剂溶液（26 mmol·L−1柠檬酸钠、30 mmol·L−1柠檬酸、100 mmol·L−1葡萄糖、70 mmol·L−1 NaCl、10 mmol·L−1 EDTA，pH 5.8）混合。4 ℃下350×g离心5 min，去除上清后将细胞重新悬浮在0.5×抗凝剂溶液中。将200 μL细胞悬液（浓度为1×107个·mL−1）加到Percoll的不连续密度梯度体系中（由1 mL 20%、2 mL 70%、0.3 mL 100% Percoll组成）。梯度系统于4 ℃下500×g离心30 min。分别收集位于20%～70%Percoll的SGC以及位于70%～100%Percoll的GC。用5倍体积的0.5倍抗凝剂溶液稀释，在4 ℃下以500×g离心5 min以收获细胞。通过流式细胞术和显微镜分析GC和SGC的纯度，在随后的试验中使用纯度大于98%的细胞。共采集三组血细胞（C1、C2和C3）用于SGC和GC的制备，每组采集10～20只红螯螯虾的血细胞。
1.3 RNA提取
使用TRIzol™试剂（Thermo Fisher Scientific）从细胞中提取总RNA。并采用Evo M-MLV RT Mix试剂盒（Accurate Biology）中的gDNA Clean Reaction Mix消除基因组DNA污染。
1.4 文库制备和测序
文库制备和测序由广州基迪奥生物技术有限公司完成。利用Oligo（dT）珠子富集mRNA，采用Fragmentation Buffer将富集的mRNA片段化，并用随机引物将mRNA片段反转录成cDNA。然后用QiaQuick PCR提取试剂盒（Qiagen, V enlo，Netherlands）纯化cDNA片段，进行末端修复，加入poly（A）尾，并连接上Illumina接头。连接产物经琼脂糖凝胶电泳选择大小（200～300 bp），PCR扩增后，使用Illumina HiSeqTM
4000 进行测序。1.5 生物信息学分析
测序得到的原始序列由Trinity进行组装[19]。然后用RSEM软件对组装的非冗余唯一基因（unigene）进行定量分析[20]。使用BLASTx程序和NCBI非冗余蛋白质（Nr）数据库（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）、Swiss-Prot蛋白质数据库（https://www.uniprot.org/）、京都基因与基因组百科全书（KEGG）数据库（http://www.kegg.jp/）和COG数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/COG/），对得到的unigenes进行注释，e值阈值为1×10−5。计算单基因表达量，并归一化为FPKM值（fragment per kilobase of transcript per million mapped reads）[21]。采用DESeq2软件进行两组间RNA差异表达分析。其中错误发现率（false discovery rate, FDR）＜0.05且差异倍数（fold change）的绝对值≥2的基因被认为是两组间的差异表达基因（differentially expressed gene, DEG）。然后将每组的DEG进行比较，以在3个生物重复中筛选常见的DEG。对平均FPKM≥1的常见DEG进行GO和KEGG富集分析。
1.6 实时荧光定量RT-PCR
使用Evo M-MLV RT Mix试剂盒（Accurate Biology）合成cDNA，并使用SYBR Green Pro Taq HS Premix（Accurate Biology）试剂盒进行实时定量RT-PCR分析，引物见表1。反应先在95 ℃下进行1 min的预变性，然后进行40个循环的扩增（95 ℃，15 s；57 ℃，30 s；72 ℃，45 s），后从60 ℃加热到80 ℃以产生熔解曲线，预计产物长度在 150～250 bp。以红螯螯虾β-actin为内参基因，参照2−ΔΔCt方法计算相对表达量[22]。试验重复3次。
表 1 实时定量RT-PCR中使用的引物序列Table 1. Primer sequences used in real-time quantitative RT-PCR基因ID 注释Annotation 引物序列（5’-3’）
Primer sequence(5’-3’)Unigene0075897 c型溶菌酶 F:GTTAGCGTGCTCGTGGTTG R:TCCCGTAGACTTTTGCCG Unigene0027599 半乳糖特异性凝集素 F:ATTGGTGGGGCTGGAAGA R:TTTGAGTGTGATTGAGCAGAAGTA Unigene0049690 造血因子2a F:TAACCTTCACTACCCCAACAAT R:ACCAGTCCAGCTCCGCA Unigene0022931 酚氧化酶原激活因子3 F:GGGTTGATAATGCTTCCTTC R:TGCTTGTCTGGTCACTGGT Unigene0112798 造血因子变种3 F:CCAGTTGGCTGCCTCACA R:GACCACGACCGACTTTGC Unigene0006621 甲壳素1 F:TACAACACACTCGCAGCATCT R:GCAGTCTGGGGGGAACC 内参基因Internal reference gene β-肌动蛋白 F:ATTACCATCCAGGCTGTGCT R:GGGCGAAACCTTCATACACG 2. 结果与分析
2.1 序列分析和基因功能注释
从红螯螯虾血细胞获得6个cDNA文库，3个来自SGC，3个来自GC，在Illumina HiSeqTM
4000 平台进行测序。总共获得了17.5 Gb的原始数据，将其存储在国家基因组学数据中心GSA数据库中，登录号为CRA009714（https://ngdc.cncb.ac.cn/gsa）。测序总共获得2.57亿原始读长（raw reads），其中GC样本中获得了1.31亿个，SGC样本中获得约1.26亿个。超过99%的reads符合质量标准。过滤后的高质量读数被组装成116199 个基因，长度201～20262 bp，平均长度763 bp，N50为1313 bp。组装结果通过BUSCO验证[23]。用主要数据库对获得的基因进行注释，分别有36.94%、24.77%、18.24%和21.12%的基因在NR、KEGG、COG/KOG和Swiss-Prot数据库中被注释；总共有
45570 个单基因被成功注释，占总数的39.22%。2.2 SGC和GC 差异表达基因的转录组学分析
为了比较SGC和GC的基因表达谱，对从3个生物学重复（C1、C2和C3）获得的数据进行了PCA分析。PCA结果显示，来自相同细胞类群的转录本紧密聚集，不同细胞类群的转录本彼此分离（图1A），表明SGC和GC之间基因表达存在很大差异。
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图 1 红螯螯虾SGC和GC的主成分分析和DEGs表达热图A：红螯螯虾血细胞亚群（SGC和GC）主成分分析；B：基因表达热图分析。Figure 1. PCA and heat map of DEGs expression of C. quadricarinatus SGC and GCA: principal component analysis (PCA) of hemocyte subpopulations (SGC and GC); B: gene expression heatmap analysis.对SGC和GC进行DEG筛选，最终筛选出
4488 个常见的DEG，3951 个基因在SGC中高度表达，537个基因在GC中高度表达（图1B）。2.3 DEGs的功能富集
为了解不同血细胞类群之间的功能差异，对在SGC中特异性高表达的
3951 个基因和在GC中特异性高表达的537个基因分别进行了KEGG、GO富集分析。2.3.1 GO富集分析
GO富集分析结果显示：在细胞组分（cellular component，CC）类别中，SGC中高表达的DEG富集于7个GO条目，分别为核（nucleus）、内质网腔（endoplasmic reticulum lumen）、微管组织中心（microtubule organizing center）、剪切复合体（spliceosomal complex）、染色体及端粒区（chromosome，telomeric region）、大核糖体亚基（large ribosomal subunit）、基底膜（basement membrane）（图2A）。GC中高表达的DEG富集于10个GO条目，包括胞外区（extracellular region）、胞外区域的部分（extracellular region part）、膜（membrane）、细胞表面（cell surface）、膜的组成部分（integral component of membrane）、质膜外侧（external side of plasma membrane）、膜的固有成分（intrinsic component of membrane）、膜部分（membrane part）、膜的侧面（side of membrane）、内肽酶Clp复合物（endopeptidase Clp complex）（图2B）。
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图 2 SGC或GC特异性高表达基因的GO富集分析（细胞组分）Figure 2. GO enrichment of SGC or GC up-regulated genes(cellular component)在分子功能（molecular function, MF）类别中，SGC高表达的DEG富集于31个GO条目（图3A）；其中有21个与酶活性相关，包括脂肪酶活性（lipase activity）、磷脂酶活性（phospholipase activity）、乳酸脱氢酶活性（lactate dehydrogenase activity）；14个与信号转导有关，特别是与细胞增殖和分化有关的信号转导，包括果蝇母抗同源序列蛋白（drosophila mothers against decapentaplegic protein, SMAD）结合（SMAD binding）、环核苷酸依赖性蛋白激酶活性（cyclic nucleotide-dependent protein kinase activity）和G蛋白偶联受体活性（G-protein coupled receptor activity）；5个与DNA修复和转录有关，包括错配碱基对DNA N-糖苷酶活性（mismatch base pair DNA N-glycosylase activity）、DNA N-糖苷活性（DNA N-glycosylase activity）和核酸结合（nucleic acid binding）。GC高表达的DEG富集于60个GO条目（图3B）；其中36个与跨膜转运有关，包括转运活动（symporter activity）、跨膜转运活性（transmembrane transporter activity）、通道活动（channel activity）、底物特异性转运蛋白质活性（substrate-specific transporter activity）、主动跨膜转运活性（active transmembrane transporter activity）等；6个与氧化活性相关，包括单加氧酶活性（monooxygenase activity）、儿茶酚氧化酶活性（catechol oxidase activity）等；3个与病原体识别相关，分别为多糖结合（polysaccharide binding）、模式结合（pattern binding）和碳水化合物结合（carbohydrate binding）。
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在生物过程（biological process, BP）类别中，SGC高表达的DEG富集于154个GO条目（图4A）。其中，与生长发育相关的条目共有71个，包括多细胞生物生长（multicellular organism growth）、细胞命运决定（cell fate determination）、BMP信号通路（BMP signaling pathway）、心脏内皮细胞分化（cardiac endothelial cell differentiation）、想象椎间盘模式形成（imaginal disc pattern formation）、结缔组织发育（connective tissue development）；有29个条目与DNA复制、修复和转录有关，包括核酸代谢过程（nucleic acid metabolic process）、基因表达（gene expression）和通过剪接体进行mRNA剪接（mRNA splicing via spliceosome）。与细胞迁移和黏附相关的11个条目，包括细胞基质黏附（cell-substrate adhesion）、细胞黏附（cell adhesion）和细胞迁移（cell migration）；以及与受体介导的内吞作用相关的5个条目，包括受体内化调节（regulation of receptor internalization）、受体介导的内吞作用的调节（regulation of receptor-mediated endocytosis）和内吞作用调控（regulation of endocytosis）。GC高表达的DEG富集于102个GO条目（图4B）；其中有42个与代谢相关，包括硫化合物代谢过程（sulfur compound metabolic process）、多巴胺代谢过程（dopamine metabolic process）、含酚化合物代谢过程（phenol-containing compound metabolic process）和细胞胺代谢过程调节（regulation of cellular amine metabolic process）；13个与免疫相关的条目，包括对细菌的防御反应（defense response to bacterium）、吞噬作用与识别（phagocytosis, recognition）、抗菌体液反应（antibacterial humoral response）、巨噬细胞因子产生（macrophage cytokine production）。
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图 4 SGC或GC特异性高表达基因的GO富集分析（生物过程）Figure 4. GO enrichment of SGC or GC up-regulated genes(biological process)综上，GO富集分析表明，SGC高度表达参与细胞增殖、分化和发育的基因，在基因表达和酶生产方面尤其活跃。GC高度表达与代谢和代谢物转运相关的基因。作为功能性免疫细胞，SGC高度表达参与细胞黏附、迁移和内吞作用的基因，而GC高度表达涉及细胞识别、细胞因子产生、吞噬作用和氧化还原过程调节的基因。
2.3.2 KEGG富集分析
KEGG富集分析结果显示：SGC高表达基因富集于44个通路中（图5A）。其中7个与细胞分化和发育有关，包括TGF-β信号通路（TGF-beta signaling pathway）、VEGF信号通路（VEGF signaling pathway）、Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）等。6个与免疫反应有关，包括TRP通道的炎症介质调节（inflammatory mediator regulation of TRP channels）、趋化因子信号通路（chemokine signaling pathway）；3个与基因表达有关，包括真核生物核糖体生物合成（ribosome biogenesis in eukaryotes）、核糖体（ribosome）和剪接体（spliceosome）。此外，SGC中还富集了与细胞黏附相关的4条通路，如细胞黏附分子（cell adhesion molecules）、黏附连接（adherens junction）和ECM受体相互作用（ECM-receptor interaction）；与神经系统相关的4个通路，包括吗啡成瘾（morphine addiction）、轴突再生（axon regeneration）和血清素能突触（serotonergic synapse）。在这些通路中，参与多种细胞过程的一些关键调节因子，包括SMAD、STAT、notch、MAPK、CREB和PKA的同源物，在SGC中高度表达。
相比之下，GC的基因表达谱较为简单。GC高表达的基因在11个通路中富集（图5B）；其中5个与代谢有关，包括谷胱甘肽代谢（glutathione metabolism）、花生四烯酸代谢（arachidonic acid metabolism）和肌萎缩侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis）；2个与蛋白质翻译有关，包括真核生物核糖体生物合成（ribosome biogenesis in eukaryotes）和核质运输（nucleocytoplasmic transport）。此外，免疫相关途径补体和凝血级联（complement and coagulation cascades）也得到了富集。在GC中，参与激活酚氧化酶原（prophenoloxidase，proPO）的几种蛋白质显著上调，包括酚氧化酶原激活因子（prophenoloxiase activating factors，PPAFs）、serine protease SP7和SERPINB1。超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GPx）等抗氧化酶也高度表达。
KEGG富集分析表明，SGC在基因转录中特别活跃，它们高度表达参与细胞增殖和发育的基因。而GC在蛋白质的合成、代谢以及proPO系统组分的生产中很活跃。
2.3.3 SGC和GC中差异表达的其他基因
由于KEGG和GO仅对红螯螯虾血细胞的一部分基因进行了分析，一些DEG未涵盖在富集分析中，这些基因也可能对SGC和GC的功能分化产生重要作用。表2显示了一些与免疫系统相关的DEG。其中，HPT因子9、Notch同源蛋白1、转谷氨酰胺酶、钙蛋白酶B、半乳糖特异性凝集素、锌指蛋白544样亚型X3、造血因子2a在SGC中高表达。转谷氨酰胺酶是凝血和免疫的关键分子[24,25]。它还通过控制年轻血细胞的释放在造血中发挥作用[26]。半乳糖特异性凝集素是一种C型凝集素（C-type lectins），参与先天免疫、发育、免疫调节和稳态[27]。另一方面，甲壳素1、酚氧化酶原、甲壳素2、甘露糖结合蛋白、造血因子变种3、细胞黏附蛋白在GC中高表达。甲壳素是甲壳类动物中的一种抗菌肽，具有抗革兰氏阳性细菌的活性[28]。甘露糖结合蛋白是在病原体识别中起作用的模式识别分子[29]。细胞黏附蛋白是一种细胞粘附蛋白质，可介导吞噬和包囊作用[30,31]。
表 2 基于FPKM值的两个血细胞亚群差异表达基因Table 2. Differentially expressed genes between two sub-populations of hemocytes based on FPKM value基因ID 平均表达量 FPKM 注释Annotation SGCs GCs Unigene0005146 5568.05 66.81 HPT因子9 HPT factor 9 [Pacifastacus leniusculus] Unigene0034901 3514.74 50.20 NOTCH同源蛋白1 Predicted neurogenic locus notch homolog protein 1-like [Hyalella Azteca] Unigene0070406 3468.68 36.63 转谷氨酰胺酶 Transglutaminase [Pacifastacus leniusculus] Unigene0043100 2227.69 43.31 钙蛋白酶B Calpain B [Gecarcinus lateralis] Unigene0081651 1817.96 32.81 半乳糖特异性凝集素（galactose-specific lectin nattectin-like protein, partial）[Procambarus clarkii] Unigene0044871 1604.99 15.45 伸展蛋白结构域 Extensin-like [Cricetulus griseus] Unigene0025602 986.96 12.41 锌指蛋白544样亚型X3 Zinc finger protein 544-like isoform X3 [Rhinatrema bivittatum] Unigene0049690 246.33 28.40 造血因子2a Astakine 2a [Pacifastacus leniusculus] Unigene0006621 1295.81 12639.05 甲壳素1 Crustin 1 [Procambarus clarkii] Unigene0085460 1806.77 6228.55 酚氧化酶原 Prophenoloxidase [Cherax quadricarinatus] Unigene0106531 1065.41 3376.95 甲壳素2 Crustin 2 [Cherax quadricarinatus] Unigene0045189 265.39 2496.35 甘露糖结合蛋白 Mannose-binding protein [Pacifastacus leniusculus] Unigene0112798 53.04 1839.86 造血因子变种3 Astakine variant 3 [Penaeus monodon] Unigene0013166 27.08 1283.46 细胞黏附蛋白Peroxinectin [Procambarus clarkii] 2.4 实时定量RT-PCR验证
为了验证转录组序列结果，选择了6个DEG进行定量RT-PCR分析，分别为造血因子2a、半乳糖特异性凝集素、c型溶菌酶、造血因子变种3、甲壳素1、酚氧化酶原激活因子3相关基因（表1）。结果显示，造血因子2a、半乳糖特异性凝集素、c型溶菌酶相关基因在SGC中特异性高表达。而造血因子变种3、甲壳素1、甲壳素2和酚氧化酶原激活因子3相关基因在GC中特异性高表达（图6）。定量逆转录PCR结果与转录组分析一致，说明转录组数据具有可靠性。
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图 6 12个基因mRNA表达水平的实时定量RT-PCR结果Figure 6. Quantitative RT-PCR results showing the mRNA expression level of 12 genes3. 讨论与结论
为更好地了解红螯螯虾血细胞功能和分化的分子基础，本研究比较了SGC和GC的基因表达谱，共发现
4488 个基因在SGC和GC中差异表达，其中3951 个基因在SGC中高表达，537个基因在GC中高表达。这一结果表明，相对GC而言，SGC细胞内的生命活动更为活跃多样。作为未成熟的血细胞，SGC仍处于分化过程中[6]。同时，它们也是功能性免疫细胞，参与吞噬、包囊和清除入侵病原体等免疫过程[1]。相比SGC，GC是具有更特异性的且处在分化末端的免疫细胞，如产生酚氧化酶原和抗菌肽等[1,6]。因此，GC的基因表达谱比SGC更简单。在其他十足目动物中也观察到类似的差异[32,33]。SGC是正在分化的未成熟血细胞[6]。因此，许多与细胞增殖、分化和发育相关的基因都在其中高表达，包括Wnt信号通路、TGF-β信号通路和VEGF信号通路等的基因。由于红螯螯虾的循环血细胞在正常条件下很少增殖[6]，所以上述通路很可能参与调节血细胞的分化。在这些富集的通路中，我们发现了两种SMAD家族蛋白SMAD4和SMAD6。SMAD是TGF-β信号通路的中枢介质[34]。作为多功能因子，SMAD还可以调节Wnt信号通路、EGF信号通路和Toll样受体信号转导通路[35]。SMAD还可以通过影响免疫细胞的增殖、分化和凋亡，以及调节细胞因子的产生来调节先天性和适应性免疫系统[36]。本研究结果表明，SMAD可能在调节SGC的功能和分化中发挥作用。在对虾、螯虾和螃蟹的单细胞转录组研究中，一些参与细胞生长和分化调控的基因也在与SGC相关的细胞簇中高表达[37,38]。此外，SGC在细胞生长和分化调控相关的基因表达和酶的产生中特别活跃。在对虾中，还发现SGC中涉及基因表达的通路显著上调[32]。可见在分化和成熟过程中，年轻的血细胞可能需要产生成熟阶段所需的物质。
尽管SGC仍处于分化过程中，但它们在免疫反应中起着积极作用。SGC是负责包裹大颗粒异物的主要细胞[1,8]。在本研究中，SGC中与细胞黏附相关的通路上调，如细胞黏附和细胞-基质黏附。在SGC中高表达的整合素（integrin）是介导细胞外基质和细胞间黏附的重要细胞表面受体。相应的，与细胞迁移和黏附相关的基因在对虾的SGC中也高表达[37,38]。
GC是更具特定免疫功能的且完全分化的血细胞[6]。众所周知，它们是激活proPO系统的主要细胞[10,39]。酚氧化酶（Phenoloxidase, PO）介导的黑色素化是抵抗入侵病原体最有效的免疫机制之一[39]。模式识别蛋白（patten recognition proteins, PRPs）识别微生物来源的病原体相关分子模式（pathogen-associated molecular patterns, PAMPs）会触发一系列丝氨酸蛋白酶的激活，该蛋白酶称为酚氧化酶原激活因子（PPAFs）或酚氧化酶原激活酶（prophenoloxidase activating enzyme, PPAEs）。随后，PPAE将失活的porPO激活为PO。PO氧化酚类分子，产生细胞毒性醌和黑色素，包裹并杀死入侵的病原体。本研究发现proPO激活系统的相关基因在GC中高表达，其中包括proPO和3种丝氨酸蛋白酶（PPAF1、PPAF2、PPAF3）。proPO的激活需要酶联级系统严格控制。因此，一些蛋白酶抑制剂在GC中也高表达。这与之前在其他十足目动物中的发现一致[32,33]。
此外，与跨膜转运和代谢相关的基因也在GC中高表达。免疫细胞的功能受到代谢转运的极大影响[40]。在脊椎动物T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤细胞和中性粒细胞的激活中发现了代谢重塑。葡萄糖、氨基酸、脂肪酸和乳酸转运蛋白表达的上调已被证明可以通过影响免疫细胞的激活和通讯来调节免疫反应。GC中多种转运蛋白的高表达表明这些细胞在免疫反应中起着积极作用。代谢物质的主动运输可能是快速生产反应性物质和激活GC所必需的。
吞噬作用是一种古老而保守的免疫反应，可以消除入侵的病原体和细胞碎片。在螯虾中，一小部分SGC和GC是具有吞噬功能的[11,41,42]。SGC大颗粒和小颗粒物质都可以吞噬，而GC往往只吞噬大颗粒物质。在这里，我们发现与受体介导的内吞作用和肌动蛋白细胞骨架调节相关的基因在SGC中高表达，而与病原体识别和巨噬细胞细胞因子产生相关的基因则在GC中高度表达。在对虾中，透明细胞是主要的吞噬细胞。参与吞噬作用的基因，包括吞噬受体、细胞骨架和几种水解酶，都在透明细胞中高表达[32]。
另外，与神经系统相关的一些通路或条目也在SGC中被富集。前人研究已经提出了甲壳类动物免疫系统和神经系统之间的联系。对克氏原螯虾的研究表明，循环血细胞可能被招募到神经发生生态位并分化为神经元[43−45]。此外，在通讯螯虾（Pacifastacus leniusculus）中，造血组织前增殖中心（anterior proliferation center, APC）的一部分细胞被认为是神经细胞的潜在前体[46,47]。
综上所述，作为未成熟的血细胞，SGC中的基因转录和翻译尤其活跃，它们表达参与细胞生长和发育的基因，并产生成熟阶段可能需要的酶。相比之下，GC高表达与proPO激活系统相关的基因，并产生抗菌肽。此外，能量和物质代谢在GC中特别活跃，这可能是感染时激活免疫细胞所必需的。这些结果为深入研究螯虾血细胞亚群的功能和分化提供了基础信息。
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图 1 红螯螯虾SGC和GC的主成分分析和DEGs表达热图
A：红螯螯虾血细胞亚群（SGC和GC）主成分分析；B：基因表达热图分析。
Figure 1. PCA and heat map of DEGs expression of C. quadricarinatus SGC and GC
A: principal component analysis (PCA) of hemocyte subpopulations (SGC and GC); B: gene expression heatmap analysis.
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图 2 SGC或GC特异性高表达基因的GO富集分析（细胞组分）
Figure 2. GO enrichment of SGC or GC up-regulated genes(cellular component)
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图 4 SGC或GC特异性高表达基因的GO富集分析（生物过程）
Figure 4. GO enrichment of SGC or GC up-regulated genes(biological process)
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图 6 12个基因mRNA表达水平的实时定量RT-PCR结果
Figure 6. Quantitative RT-PCR results showing the mRNA expression level of 12 genes
表 1 实时定量RT-PCR中使用的引物序列
Table 1 Primer sequences used in real-time quantitative RT-PCR
基因ID 注释Annotation 引物序列（5’-3’）
Primer sequence(5’-3’)Unigene0075897 c型溶菌酶 F:GTTAGCGTGCTCGTGGTTG R:TCCCGTAGACTTTTGCCG Unigene0027599 半乳糖特异性凝集素 F:ATTGGTGGGGCTGGAAGA R:TTTGAGTGTGATTGAGCAGAAGTA Unigene0049690 造血因子2a F:TAACCTTCACTACCCCAACAAT R:ACCAGTCCAGCTCCGCA Unigene0022931 酚氧化酶原激活因子3 F:GGGTTGATAATGCTTCCTTC R:TGCTTGTCTGGTCACTGGT Unigene0112798 造血因子变种3 F:CCAGTTGGCTGCCTCACA R:GACCACGACCGACTTTGC Unigene0006621 甲壳素1 F:TACAACACACTCGCAGCATCT R:GCAGTCTGGGGGGAACC 内参基因Internal reference gene β-肌动蛋白 F:ATTACCATCCAGGCTGTGCT R:GGGCGAAACCTTCATACACG 
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表 2 基于FPKM值的两个血细胞亚群差异表达基因
Table 2 Differentially expressed genes between two sub-populations of hemocytes based on FPKM value
基因ID 平均表达量 FPKM 注释Annotation SGCs GCs Unigene0005146 5568.05 66.81 HPT因子9 HPT factor 9 [Pacifastacus leniusculus] Unigene0034901 3514.74 50.20 NOTCH同源蛋白1 Predicted neurogenic locus notch homolog protein 1-like [Hyalella Azteca] Unigene0070406 3468.68 36.63 转谷氨酰胺酶 Transglutaminase [Pacifastacus leniusculus] Unigene0043100 2227.69 43.31 钙蛋白酶B Calpain B [Gecarcinus lateralis] Unigene0081651 1817.96 32.81 半乳糖特异性凝集素（galactose-specific lectin nattectin-like protein, partial）[Procambarus clarkii] Unigene0044871 1604.99 15.45 伸展蛋白结构域 Extensin-like [Cricetulus griseus] Unigene0025602 986.96 12.41 锌指蛋白544样亚型X3 Zinc finger protein 544-like isoform X3 [Rhinatrema bivittatum] Unigene0049690 246.33 28.40 造血因子2a Astakine 2a [Pacifastacus leniusculus] Unigene0006621 1295.81 12639.05 甲壳素1 Crustin 1 [Procambarus clarkii] Unigene0085460 1806.77 6228.55 酚氧化酶原 Prophenoloxidase [Cherax quadricarinatus] Unigene0106531 1065.41 3376.95 甲壳素2 Crustin 2 [Cherax quadricarinatus] Unigene0045189 265.39 2496.35 甘露糖结合蛋白 Mannose-binding protein [Pacifastacus leniusculus] Unigene0112798 53.04 1839.86 造血因子变种3 Astakine variant 3 [Penaeus monodon] Unigene0013166 27.08 1283.46 细胞黏附蛋白Peroxinectin [Procambarus clarkii]
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