Role of pAPN and NEU3 in TGEV Infection on Pig
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摘要:目的
氨基肽酶（ pAPN ）是猪的传染性胃肠炎病毒（TGEV）侵染的主要受体，验证pAPN和唾液酸神经氨酸酶（NEU3）双基因对猪的传染性胃肠炎病毒（TGEV）入侵机制的影响。 方法 应用CRISPR-Cas9基因编辑技术，敲除猪睾丸细胞（ST）的pAPN和NEU3两个基因。经过病毒感染试验，测定敲除pAPN和NEU3两个目标基因的ST细胞对病毒的侵染变化以及病毒拷贝数的变化、细胞病变改善，同时监测病毒侵染后纤连蛋白的变化。结果 与对照组相比，敲除pAPN和NEU3两个目标基因的ST细胞，明显减轻TGEV侵染引起的细胞病变，TGEV的拷贝数也出现明显下降。此外，同样滴度的TGEV侵染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞后，诱导ST细胞的免疫应答物IFNβ的mRNA水平明显低于野生型ST细胞组。结论 pAPN和NEU3双基因的敲除，明显降低了ST细胞中的TGEV病毒拷贝数，同时也减少病毒引起的细胞病变，这个结果证实细胞中的pAPN和NEU3双基因可作为将来养猪生产中抗病毒治疗及抗病品种选育的靶基因。Abstract:Objective Role of aminopeptidase gene pAPN and sialic acid neuraminidase gene NEU3 in the transmissible gastroenteritis virus (TGEV) infection on pigs was investigated.Methods Being the main receptor of TGEV, pAPN was removed from pAPN and NEU3 in ST cells to verify its supposed key function on the disease. The CRISPR gene editing technique was applied to clip the target gene in ST cells prior to an artificial TGEV infection test. The resulting changes on the infection, virus copy number, cytopathic improvement, and fibronectin were monitored.Results Compared with control, the ST cells free of pAPN and NEU3 significantly attenuated TGEV infection-induced cytopathies and the virus copy number. In addition, at a same TGEV titer the mRNA immune responders induced by the knockdown ST cells were significantly lower than the wild-type counterparts.Conclusion It was confirmed that the removal of pAPN and NEU3 inhibited the TGEV infection in pigs with reduced viral induced cytopathies. Thus, an antiviral therapy and a guideline for breeding resistant pigs could be developed by targeting these two key genes in the ST cells.-
Keywords:
- pAPN /
- NEU3 /
- TGEV /
- Titer of virus
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0. 引言
【研究意义】猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）是猪传染性胃肠炎的病原，不同种类和不同日龄猪都呈现易感性。以往该病主要在冬季较为常见，但近几年，随着养殖密度和规模增加，呈现一年四季皆有报道发病[1-3]。其主要临床症状为呕吐、脱水和严重腹泻等。中大猪和成年母猪感染后死亡率低，但哺乳仔猪感染后发病率和死亡率可达100%，是我国当前生猪养殖中的一种痼疾，给畜牧业生产带来巨大的损失[4-6]。为了进一步加强该病的防控，有必要深入研究影响TGEV感染的机制，为药物和疫苗开发以及抗病品种研发奠定基础[7-8]。【前人研究进展】已有研究报道，pAPN是TGEV侵染的主要受体，猪体内的pAPN敲除后，明显抑制TGEV病毒的侵染，减少TGEV的发病率[9-12]。但是，很多证据证实，TGEV病毒的侵染方式多样，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染[13]。NEU3作为病毒侵染的另一个重要中间体，发挥了重要的作用[12-14]。因为病毒的侵染是相互配合的一个复杂系统，详细的作用机理尚待进一步揭示。pAPN和NEU3共同敲除是否能更好抑制该病毒的入侵，尚待进一步研究。【本研究切入点】腺相关病毒作为治疗靶标的传递体，已经成功应用在人类疾病治疗，以腺相关病毒的传递治疗载体作为切入点，以TGEV为靶标，进行TGEV病的治疗，有待深入研究。pAPN 和 NEU3共同敲除是否能更好抑制该病毒的入侵，尚待进一步研究。【拟解决的关键问题】本试验旨在运用CRISPR基因敲除技术，对ST细胞中的pAPN和NEU3双基因共同敲除，以评估对TGEV的入侵影响，从而推动相关疫苗和抗TGEV品种猪的育种研究。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验细胞、细菌和质粒
猪肾睾丸细胞（ST）购自上海英杰生物科技有限公司；pX459购自美国Addagen公司。
1.1.2 试剂
本试验中所用到的试剂及来源见表1。
表 1 试剂及来源Table 1. Names and suppliers of reagents applied试剂 Reagents 来源 Sources MiniBEST通用DNA提取试剂盒5.0 TaKaRa 9765 TaKaRa小型DNA片段纯化试剂盒Ver.4.0 TaKaRa 9761 无内毒素质粒小提试剂盒 康为-cw2106 MiniBEST通用RNA提取试剂盒 TaKaRa 9767 PrimeScriptTM常温反应试剂 TaKaRa DRR047A SYBR® Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time） TaKaRa RR091A SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），ROX Plus TaKaRa RR82WR 1640 RPMI粉 life technology RPMI 1640培养基 Gibco 1598911 DMEM/F12（高糖） Hyclone 11966-025 DMEM Gibco 11960-044 T4 DNA连接酶 TaKaRa 2011B TaKaRa Ex Taq® TaKaRa RR001C PrimeSTAR® Max DNA聚合酶 TaKaRa R045A Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0） TaKaRa RR003A RNA酶 全式基因-j11030 FastDigest Sac I ThermoFD1134 FastDigest Bam HI Thermo FD0055 FastDigest EcoRI Thermo FD0274 兔抗抗磷酸化-STAT6抗体 DZ-23319 兔抗抗-STAT6抗体 CST 9362s IRF3（D614C）XP Rabbit mAb CST 11904 磷酸化-IRF-3（Ser396）（4D4G）兔抗 CST 4947 1.1.3 引物及sgRNA
为了敲除ST细胞中的pAPN和NEU3基因，在sgRNA设计网站https://zlab.bio/guide-design-resources进行双基因的sgRNA设计，并送测序公司合成。
1.2 试验方法
1.2.1 试验设计
本研究设计了针对pAPN和NEU3两个关键基因CRISPR基因编辑系统，通过脂质体转染ST细胞，培养24 h后，用嘌呤霉素进行筛选，然后挑取单克隆细胞，测序验证（图1）。再将TGEV感染pAPN和NEU3两个关键基因敲除的ST细胞，观察对细胞病变的改善、TGEV滴度的影响、干扰素的mRNA水平变化等指标，以评估它对TGEV侵染的影响。
1.2.2 重组编辑两目标基因载体的构建
sgRNA的设计和重组质粒的构建：本研究中使用的sgRNA是在sgRNA Designer: CRISPRko（broadinstitute.org）网站上设计，针对pAPN和NEU3两个关键基因设计多个sgRNA（表2），送福州铂尚生物科技公司合成，合成后的sgRNA退火，与酶切的Px459编辑质粒（表3），按相关体系组成进行连接，见表3。连接后转化至感受态细菌DH5a，然后挑取单克隆菌，进行扩增并提取DNA，进行PCR扩增，将扩增出来的产物送福州铂尚生物科技公司测序验证。sgRNA退火体系：10×PCR缓冲液2.5 μL，F-sgRNA 1 μL，R-sgRNA1 μL，双蒸水16 μL，总计20 μL。
表 2 sgRNA名称及序列Table 2. Names and sequences of sgRNA名称 Name 序列 Sequences pAPN sgRNA-1F: 5′CACCGGGGCATCCTCCTCGGCGTGG3′ pAPN sgRNA-1R: 5′AAACCCACGCCGAGGAGGATGCCCC3′ pAPN sgRNA-2F: 5′CACCGCTACCGCAGCGAGTACATGG3′ pAPN sgRNA-2R: 5′AAACCCATGTACTCGCTGCGGTAGC3′ pAPN sgRNA-3F: 5′CACCGCCTCATGTTCGACCGCTCCG3′ pAPN sgRNA-3R: 5′AAACCGGAGCGGTCGAACATGAGGC3′ pAPN sgRNA-4F: 5′CACCGCGACAAACTCCGCTCAGCGC3′ pAPN sgRNA-4R: 5′AAACGCGCTGAGCGGAGTTTGTCG3′ NEU3 sgRNA1-F: 5′CACCGATGCTCAGTCATCGGCGTGA3′ NEU3 sgRNA1-R: 5′AAACTCACGCCGATGACTGAGCATC3′ NEU3 sgRNA2-R: 5′AAACTGGGCAGTACGTATAACTACC3′ NEU3 sgRNA2-F: 5′CACCGGTAGTTATACGTACTGCCCA3′ 表 3 验证引物Table 3. Primers for verification名称 Name 序列 Sequences pAPN F:5′ATGGCCAAGG GATTCTACAT3′ pAPN R:5′AACCAAGTATCTCGTGTCGATT3′ NEU3 F:5′ATGGGAAACTCGCCATCAAAAA3′ NEU3 R:5′TTCTTTCTGTTCTTCTACGCAACT3′ 将sgRNA的各组分依次加入后混匀，再低速离心20 s。将各反应物，置于反应管进行反应，反应条件：初始温度95 ℃，10 min；然后进行梯度温度处理：按95 ℃～85 ℃，2.5 ℃·s−1；85 ℃～25 ℃，0.25 ℃·s−1；25 ℃ 5 min。反应结束后取3 μL反应产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测验证。双酶切体系：质粒（1 μg），10×Fast缓冲液2 mL，快消化酶-F 1 μL，快消化酶-F–R 1 μL，双蒸水补足25 μL。
Px459质粒的酶切：将质粒所需各组分，同上依次加入后低速离心混匀20 s，后37 ℃维持15 min，取3 μL用1%琼脂糖凝胶电泳检测验证。连接反应体系: 10×T4 DNA缓冲液2.5 μL，sgRNA2质粒70 ng，T4 DNA连接酶1 μL，双蒸水补足25 μL，总计25 μL。
按连接试剂盒的说明进行常规的连接，再将连接产物转化到50 μL感受态细胞，于37 ℃培养1 h，3 000 g离心，再用20 μL重悬液，后均匀涂至含AMP的LB平板，于37 ℃倒置培养过夜。18 h后，挑取单克隆并加入2 mL LB，进行扩增培养14 h。然后吸取单克隆菌液300 μL送福州铂尚测序公司测序验证，将测序结果使用bioedit软件进行比对分析验证。
1.3 构建pAPN和NEU3两个关键基因敲除ST细胞
1.3.1 双基因敲除系统的构建
将构建成功的重组编辑质粒Px459-pAPN和Px459-NEU3，按1∶2的比例加入脂质体LIPO2000，混匀并加入20 μL无血清培养基。待6孔板ST细胞长至汇合度70%时，用无血清培养基清洗两次，然后加入转染混合液，37 ℃培养18 h，去除转染混合液，加入正常的血清培养液，并按100 μg·mL−1加入嘌呤霉素进行筛选，4～7 d后，去除含嘌呤霉素的培养液，加入新鲜DMEM培养基，培养12 h后，显微镜观察，可见微小单克隆细胞群落，然后在镜下进行挑取单个克隆，置于新的培养皿，加入新的培养基进行扩大培养。扩大培养后收取克隆细胞，提取总DNA，进行pAPN−/−和NEU3−/−双基因敲除PCR验证。接着，利用Western blot在蛋白水平上验证pAPN−/−和NEU3−/−双基因敲除细胞株。
1.3.2 PCR及Western blot验证
为了进一步验证单克隆细胞株是否成功敲除pAPN和NEU3双基因，设计了两对引物，进行PCR验证，引物序列见表3。PCR的反应条件和反应系列同上。细胞的基因组DNA的提取见常规DNA提取试验盒操作。PCR验证反应体系：5×PCR反应混合液（Mix）25 μL，模板5 μL，双蒸水20 μL，反应条件：42 ℃，2 min，4 ℃。免疫印迹试验：配置10%的分离胶，并加入制胶板底层，为了去分离胶内的气泡并保持分离胶的平行，在加完分离胶前加入水进行压平放置15 min。再用滤纸将分离胶上层的水吸干净，再缓缓加入5%的浓缩胶，并插入加样梳，并放置40 min；接着轻缓拔除凝胶上的梳子，再重新把胶板放入电泳槽，添加一定比例的电泳缓冲液，当缓冲液没过长玻璃板后，停止添加。待液面静止5 min，后用加样器往凝胶上样孔加入蛋白样品。后打开电泳仪电源，设置恒压80 V持续20 min，后调整电压至120 V持续约1 h 40 min；关闭电源，废弃上层的浓缩胶，再用刀片将含有目的蛋白和内参蛋白的凝胶切下置于4 ℃冰箱保存及待用。接着再根据本次凝胶大小来裁剪的滤纸和PVDF膜，将胶、PVDF膜和滤纸浸入转膜缓冲液约10～20 min后，先铺好3层滤纸，用玻璃管除去气泡，将胶水涂在去除气泡的滤纸上，然后将PVDF膜覆盖在胶水上，轻轻去除气泡，然后将靠近胶水的一侧指向黑板，靠近薄膜的一侧与白板对齐组装改进的薄膜装置，将安装一个改进的膜，300 mA恒定电流至50 min；电转后，取膜，冲洗靠近胶水的一侧，用TBST（5×TBS稀释0.05%吐温-20）3次。封闭反应：室温下（25 ℃），用10%脱脂奶粉或5%BSA封闭PVDF膜1 h；抗原抗体反应：蛋白一抗按抗体规格比例加入，4 ℃摇床过夜孵育。第二天，取出PVDF膜，用TBST冲洗3次，每次10 min，然后加入相应的荧光标记二抗，室温孵育2 h，然后丢弃第二次，用TBST冲洗PVDF膜，每次10 min；每片扫描膜用双色红外激光成像仪（Odysey）；用CorelDRAW12软件分析绘图。
1.4 TGEV的感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞
分别取1.1×106个·mL−1 ST细胞和除pAPN和NEU3双基因敲除的ST细胞，分别置于4个6孔板，过夜培养，待细胞贴壁完成后，加入1.1×105 TCID50·mL−1的TGEV病毒，并分别在6、12、24、36、48 h在显微镜下观察并拍照记录细胞的病变情况，同时收集一孔细胞，提取细胞中的病毒RNA和细胞中干扰素的mRNA，然后实时定量验证TGEV的拷贝数变化、干扰素的mRNA水平及TGEV病毒的纤连蛋白mRNA水平。RNA提取过程如下：按10 cm2 ·mL−1比例加入Trizol，对培养贴壁两种ST细胞进行消化、裂解，转移至离心管于室温放置5 min，使其充分裂解；Trizol和氯仿按1∶0.2比例添加，温和地进行混匀，在室温（25 ℃）放置15 min；然后在4 ℃离心机中按转速12 000 g离心15 min；取出离心管，小心地吸取上层液体，将其转移至另一根干净的离心管中；再按1∶0.5的比例（Trizol∶异丙醇）加入异丙醇。再上下轻轻摇混匀，室温25 ℃放置5～10 min；再经4 ℃ 12 000 g转速离心10 min，小心弃上清；以1∶1加入75%乙醇，温和温匀；4 ℃ 8 000 g离心5 min，弃上清；室温晾干干燥5～10 min。
Real-time PCR相对定量法检测基因的表达情况要求各引物的扩增效率在90%～110%，各个引物的扩增效相差不超过5%。因此我们用不同引物对模板进行PCR，将PCR产物进行纯化后导入T载体。然后以108拷贝为起始浓度，依次10倍稀释5个梯度，摸索出最佳PCR扩增条件后，再对样本进行相对定量。Real-time PCR反应系列：SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）ROX Plus 10 μL，前引物Forward Primer（10 μmol·L−1）0.4 μL，反向引物Reverse Primer（10 μmol·L−1）0.4 μL，mRNA溶液（30 ng·μL−1）3 μL，双蒸水ddH2O 7.2 μL，总计20 μL。反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s, 55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s ×40 cycles；熔解曲线阶段：95 ℃ 15 s，72～88 ℃，每个周期0.1 ℃递增。所用实时荧光PCR引物见表4。
表 4 实时定量PCR引物Table 4. Primers for RT-PCR reaction system基因名称 Name of genes 序列 Sequences h-GAPDH-F CCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC h-GAPDH-R CTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGCT h-IFNβ-F AGGACAGGATGAACTTTGAC h-IFNβ-R TGATAGACATTAGCCAGGAG h-Spike protein-F TAATAGCAGT TGTTTCTGCT h-Spike protein-R GCATTGCTGT ACTCTTTGTA 2. 结果与分析
2.1 pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞
挑取经嘌呤霉素筛选的pAPN和NEU3双基因敲除ST单克隆细胞，提取细胞的基因组，进行PCR验证，结果产生预期的两个条带，分别在2 881 bp和1 349 bp，与预期的引物结果一致（图2）。接着将该PCR产物送测序，结果证实分别在pAPN和NEU3的245 bp位置和227 bp位置出现碱基缺失。接着又用pAPN和NEU3的双抗，进行Western blot验证，结果野生型细胞完全能孵出预期的条带，但敲除株的ST细胞，在预定位置并没有明显的条带，证实pAPN和NEU3双基因在ST细胞中成功敲除，该基因的蛋白表达或受到抑制，或结构遭破坏。
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图 2 pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞电泳结果注：1：DNA Marker；2~3：阴性克隆；4~5：阳性克隆。Figure 2. PCR of ST cells after pAPN and NEU3 knockdownNote: First band: 5000 DNA marker; 2nd and 3rd bands: negative clones; 4th and 5th bands: positive clones.由图2可知，在单克隆细胞中，吸取200 μL提取基因组DNA，然后进行PCR反应，结果在2 881 bp位置和1 349 bp位置出现了条带，证明筛选得到了双基因敲除的细胞株。
将2 881 bp位置和1 349 bp位置出现的条带送测序，结果证实245 bp位置和227 bp位置出现碱基缺失（图3）。
由图4可知，取245 bp位置和227位置出现碱基缺失的ST细胞，进行蛋白免疫印迹试验，敲除株的ST细胞pAPN蛋白明显减弱，而NEU3完全看不到。
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图 4 pAPN和NEU3的敲除及免疫印迹印证（pAPN, NEU3和GAPDH)Figure 4. Western blot on ST cells after pAPN and NEU3 knockdown2.2 TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞的影响
将1.1×105 TCID50 ·mL−1的TGEV病毒感染pAPN和NEU3双基因敲除的ST细胞和野生型ST细胞，6 h后，野生型ST细胞出现部分细胞病变，感染TGEV病毒12 h，野生型细胞出现明显的细胞聚集和死亡的细胞病变。24 h和36 h后，野生型细胞的聚集、拉网和死亡的细胞病变现象比双基因敲除的ST细胞更为明显（图5）。
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图 5 TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞和野生型ST细胞结果Figure 5. TGEV infection on pAPN-and-NEU3-knockdown and wild-type ST cells2.3 TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞明显下调了干扰素和纤连蛋白产生
Beta干扰素是机体产生的一类糖蛋白，它具有高度的种属特异性。当机体感染病毒时，会产生大量的干扰素，来抵制病毒的增殖。因此，在本试验中，通过干扰素的mRNA水平，间接地反映初期病毒的强弱，当前期感染病毒较强，激发机体的免疫反应就大，产生的Beta干扰素水平就较高。本研究结果表明，pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞，产生的干扰素水平远低于野生型细胞，这个结果间接说明敲除细胞里的病毒量可能低于野生型细胞（表5）。
表 5 干扰素mRNATable 5. Real time PCR assay for the expression of IFNβ时间
Time/h双基因敲除细胞
Double knockout/拷贝数野生型细胞
Wild type cells/拷贝数20 1 4 1 1103000 1103900 1102700 40 2 3 3 1290030 1203009 1203007 60 2 2 3 1322000 1322004 1322043 80 3 5 5 1103005 1103008 1103009 100 3 3 3 1140001 1143006 1143003 120 1 2 3 1120000 1102300 1102307 TGEV病毒属于冠状病毒科冠状病毒属，病毒直径为90～200 nm，它的主要结构蛋白是纤突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白。因此，将细胞中TGEV的纤突（S）蛋白的mRNA作为TGEV病毒侵染细胞的标志。结果表明，感染TGEV后，pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞纤突（S）蛋白的mRNA远低于野生型细胞（表6）。这个结果也表明pAPN和NEU3双基因敲除ST可能抑制了病毒的入侵。
表 6 纤突蛋白的mRNATable 6. The T vector containing the TGEV spike protein gene fragment时间
Time/h双基因敲除细胞
Double knockout/拷贝数野生型细胞
Wild type cells/拷贝数20 41 43 45 1423341 1322356 1421345 40 68 67 60 1367893 1323567 1309876 60 62 69 62 1656431 1665789 1632454 80 43 50 54 1456445 1433421 1432098 100 31 35 32 1432223 1432554 1478909 120 49 35 36 1444009 1422112 1423115 2.4 不同滴度TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞
为进一步验证pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞可以抑制TGEV病毒的入侵，用不同滴度的TGEV侵染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞，结果发现，和对照组细胞相比，在2.2×104 TCID50·mL−1、4.4×104 TCID50·mL−1、4.4×105 TCID50·mL−1和8.8×105 TCID50·mL−1细胞病变明显较少，并且随着滴度增加，敲除细胞并没有明显的变化。而对照组细胞，随着滴度上升，细胞病变更为明显（图6）。
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图 6 不同滴度的TGEV感染pAPN和NEU3双敲除ST细胞和野生型细胞Figure 6. Morphological changes on knockdown and wild-type ST cells induced simultaneously by TGEV of different titers3. 讨论
前人研究证实pAPN是TGEV侵染机的主要受体，将猪体内的pAPN敲除，会明显抑制TGEV病毒的侵染，减少TGEV的发病率[7-11]。但是，TGEV病毒的侵染方式多样，pAPN敲除不足以完全抑制TGEV的感染。NEU3作为病毒侵染的另一个重要中间体，发挥了重要的作用[12-14]。本研究的结果证实，将pAPN和NEU3双敲的ST细胞，不管是病毒主要结构蛋白，还是病毒感染引起的Beta干扰素的水平，都明显比野生型低，细胞的病变也不明显。此外，用不同滴度的TGEV侵染双基因敲除细胞，细胞病变并不随着感染滴度的增加而变化。这个结果在另一个层面说明，pAPN和NEU3双敲，对TGEV的侵染有更为明显的抑制，但对病毒滴度的变化，还有待继续深入研究。
本研究中，将纤突蛋白作为病毒在体内滴度变化的主要指征，主要基于TGEV病毒主要结构蛋白是纤突（S）蛋白、包膜（E）蛋白、膜（M）蛋白和核衣壳（N）蛋白[15-18]。其中，尤其以纤突（S）蛋白尤为重要，也常作为病毒变异或毒力变化的指征[16-18]。在人的冠状病毒感染中也尤为多见，近来发生的新冠病毒，大多以纤突（S）蛋白作为研究的核心，不管是从检测还是疫苗的研究等。因此，本研究将细胞中TGEV的纤突（S）蛋白的mRNA作为TGEV病毒侵染细胞的标志。细胞病变以及Beta干扰素的结果也证实，纤突蛋白作为病毒在体内滴度变化的主要指征，能正确反映病毒侵染细胞的情况。
此外，将Beta干扰素作为病毒侵染细胞初期情况的其中一个指征，也是基于大部分病毒侵染机体或细胞都会激起机体强烈的免疫反应，产生大量的Beta干扰素[19-22]。病毒滴度越高或毒力越强，产生的Beta干扰素量就越大。因此，它在一定程度反映了病毒侵染细胞的强弱和病毒滴度的高低。但它并不能替代病毒的滴度测定，它只能间接反映病毒的入侵情况。
4. 结论
本研究中将pAPN和NEU3双敲的ST细胞，可明显减少TGEV入侵，病毒的拷贝数明显低于对照组，并且病毒滴度的增加，对细胞的病变改变不明显。因此pAPN和NEU3双敲，可作为将来抗TGE猪品种选育和抗TGEV病毒的药物靶点。
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图 2 pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞电泳结果
注：1：DNA Marker；2~3：阴性克隆；4~5：阳性克隆。
Figure 2. PCR of ST cells after pAPN and NEU3 knockdown
Note: First band: 5000 DNA marker; 2nd and 3rd bands: negative clones; 4th and 5th bands: positive clones.
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图 4 pAPN和NEU3的敲除及免疫印迹印证（pAPN, NEU3和GAPDH)
Figure 4. Western blot on ST cells after pAPN and NEU3 knockdown
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图 5 TGEV感染pAPN和NEU3双基因敲除ST细胞和野生型ST细胞结果
Figure 5. TGEV infection on pAPN-and-NEU3-knockdown and wild-type ST cells
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图 6 不同滴度的TGEV感染pAPN和NEU3双敲除ST细胞和野生型细胞
Figure 6. Morphological changes on knockdown and wild-type ST cells induced simultaneously by TGEV of different titers
表 1 试剂及来源
Table 1 Names and suppliers of reagents applied
试剂 Reagents 来源 Sources MiniBEST通用DNA提取试剂盒5.0 TaKaRa 9765 TaKaRa小型DNA片段纯化试剂盒Ver.4.0 TaKaRa 9761 无内毒素质粒小提试剂盒 康为-cw2106 MiniBEST通用RNA提取试剂盒 TaKaRa 9767 PrimeScriptTM常温反应试剂 TaKaRa DRR047A SYBR® Premix DimerEraserTM（Perfect Real Time） TaKaRa RR091A SYBR® Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus），ROX Plus TaKaRa RR82WR 1640 RPMI粉 life technology RPMI 1640培养基 Gibco 1598911 DMEM/F12（高糖） Hyclone 11966-025 DMEM Gibco 11960-044 T4 DNA连接酶 TaKaRa 2011B TaKaRa Ex Taq® TaKaRa RR001C PrimeSTAR® Max DNA聚合酶 TaKaRa R045A Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0） TaKaRa RR003A RNA酶 全式基因-j11030 FastDigest Sac I ThermoFD1134 FastDigest Bam HI Thermo FD0055 FastDigest EcoRI Thermo FD0274 兔抗抗磷酸化-STAT6抗体 DZ-23319 兔抗抗-STAT6抗体 CST 9362s IRF3（D614C）XP Rabbit mAb CST 11904 磷酸化-IRF-3（Ser396）（4D4G）兔抗 CST 4947 
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表 2 sgRNA名称及序列
Table 2 Names and sequences of sgRNA
名称 Name 序列 Sequences pAPN sgRNA-1F: 5′CACCGGGGCATCCTCCTCGGCGTGG3′ pAPN sgRNA-1R: 5′AAACCCACGCCGAGGAGGATGCCCC3′ pAPN sgRNA-2F: 5′CACCGCTACCGCAGCGAGTACATGG3′ pAPN sgRNA-2R: 5′AAACCCATGTACTCGCTGCGGTAGC3′ pAPN sgRNA-3F: 5′CACCGCCTCATGTTCGACCGCTCCG3′ pAPN sgRNA-3R: 5′AAACCGGAGCGGTCGAACATGAGGC3′ pAPN sgRNA-4F: 5′CACCGCGACAAACTCCGCTCAGCGC3′ pAPN sgRNA-4R: 5′AAACGCGCTGAGCGGAGTTTGTCG3′ NEU3 sgRNA1-F: 5′CACCGATGCTCAGTCATCGGCGTGA3′ NEU3 sgRNA1-R: 5′AAACTCACGCCGATGACTGAGCATC3′ NEU3 sgRNA2-R: 5′AAACTGGGCAGTACGTATAACTACC3′ NEU3 sgRNA2-F: 5′CACCGGTAGTTATACGTACTGCCCA3′
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表 3 验证引物
Table 3 Primers for verification
名称 Name 序列 Sequences pAPN F:5′ATGGCCAAGG GATTCTACAT3′ pAPN R:5′AACCAAGTATCTCGTGTCGATT3′ NEU3 F:5′ATGGGAAACTCGCCATCAAAAA3′ NEU3 R:5′TTCTTTCTGTTCTTCTACGCAACT3′
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表 4 实时定量PCR引物
Table 4 Primers for RT-PCR reaction system
基因名称 Name of genes 序列 Sequences h-GAPDH-F CCCTGAGCTGAACGGGAAGCTCAC h-GAPDH-R CTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGCT h-IFNβ-F AGGACAGGATGAACTTTGAC h-IFNβ-R TGATAGACATTAGCCAGGAG h-Spike protein-F TAATAGCAGT TGTTTCTGCT h-Spike protein-R GCATTGCTGT ACTCTTTGTA
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表 5 干扰素mRNA
Table 5 Real time PCR assay for the expression of IFNβ
时间
Time/h双基因敲除细胞
Double knockout/拷贝数野生型细胞
Wild type cells/拷贝数20 1 4 1 1103000 1103900 1102700 40 2 3 3 1290030 1203009 1203007 60 2 2 3 1322000 1322004 1322043 80 3 5 5 1103005 1103008 1103009 100 3 3 3 1140001 1143006 1143003 120 1 2 3 1120000 1102300 1102307
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表 6 纤突蛋白的mRNA
Table 6 The T vector containing the TGEV spike protein gene fragment
时间
Time/h双基因敲除细胞
Double knockout/拷贝数野生型细胞
Wild type cells/拷贝数20 41 43 45 1423341 1322356 1421345 40 68 67 60 1367893 1323567 1309876 60 62 69 62 1656431 1665789 1632454 80 43 50 54 1456445 1433421 1432098 100 31 35 32 1432223 1432554 1478909 120 49 35 36 1444009 1422112 1423115
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