Cloning and Prokaryotic Expressions of Cassava MebZIP27
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摘要:目的
碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）蛋白是真核生物中一类独特的转录因子，在植物的生长、发育和生理代谢调控中发挥着关键作用。特别是A类bZIPs通常负责调控携带ABA依赖元件的基因，进而引发ABA响应或实现环境适应。深入研究A类木薯bZIPs转录因子的功能，可进一步了解其调控ABA表达的分子机理。
方法通过RT-PCR技术克隆MebZIP27基因，并运用生物信息学方法对其进行基因和蛋白质水平的分析。此外，通过荧光定量PCR检测MebZIP27基因的时空表达模式及其对逆境的响应，并尝试通过原核表达获得MebZIP27蛋白。
结果MebZIP27基因位于木薯第5号染色体上，编码区全长
1251 bp，具备典型的bZIP结构域特征。该基因与麻风树（Hevea brasiliensis）和橡胶树（Jatropha curcas）的A类bZIP序列一致性分别高达80.00%和85.41%，表明其属于A类bZIP亚族成员。亚细胞定位结果显示，MebZIP27基因位于细胞核。qRT-PCR分析结果表明，MebZIP27基因在木薯储藏根中表达最为显著。在甘露醇、NaCl和低温处理下，MebZIP27基因未表现出显著诱导表达，但在ABA和H2O2处理下表现出显著诱导。通过原核表达成功获得了MebZIP27基因编码的蛋白，并通过谷胱甘肽琼脂糖珠微球分离技术对GST-MebZIP27蛋白进行了纯化。结论木薯中的MebZIP27基因属于A类bZIP基因家族，定位于细胞核，在木薯储藏根中的表达最为显著。此外，MebZIP27基因在ABA和H2O2处理下表现出显著诱导。这些结果为深入研究MebZIP27基因在ABA信号调控中的作用提供了参考依据。
Abstract:ObjectiveThe Class A basic leucine zipper protein(bZIP), which regulates genes carrying ABA-responsive elements associated with the environmental adaptations as well as growth, development, and physiological metabolism of plants, in cassava was studied.
MethodsThe Class A bZIP in cassava, MebZIP27, was cloned using RT-PCR technology to determine the functions of the gene transcription factors. Bioinformatic methods were applied to analyze properties of the gene and protein, fluorescence quantitative PCR employed to examine spatiotemporal expressions and responses to stress, and prokaryotic expression used to produce MebZIP27 protein.
ResultsMebZIP27 was in the 5th chromosome of cassava with a coding region of
1251 bp and characteristic bZIP domain features. It had the highest homology with the Class A bZIP sequences from Hevea rubber at 80.00% and Jatropha curcas at 85.41%, as a member of the A-bZIP subfamily. Located in nucleus, the gene had the highest expression found in the roots. Treatments of mannitol, NaCl or low temperature did not cause significant induction, but ABA and H2O2 did on it. Via the prokaryotic expression, MebZIP27 could be produced and purified using glutathione agarose bead separation techniques.ConclusionLocated in nucleus and belonged to the Class A bZIP gene family, MebZIP27 expressed most significantly in the storage roots of a cassava plant and by an ABA or H2O2 induction.
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Keywords:
- cassava /
- bZIP /
- abiotic stress /
- prokaryotic expression
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0. 引言
【研究意义】碱性亮氨酸拉链（basic leucine zipper, bZIP）转录因子是植物中广泛存在的一类具有较多成员的大家族，具有一个特异的DNA结合结构域和一个亮氨酸拉链二聚化结构域，能够与靶基因启动子上特异的顺式作用元件结合，在植物生长发育、胁迫响应以及次生代谢产物生物合成调控等多个生物学过程中发挥着重要作用[1, 2]。【前人研究进展】bZIP转录因子家族是植物中一类规模庞大的转录因子群体。截至目前，已在拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）、玉米（Zea mays）、小麦（Triticum aestivum）、大豆（Glycine max）和棉花（Gossypium hirsutum）中分别鉴定出127、89、210、186、352和224个bZIP转录因子成员[1]。在植物中，有大量的证据表明bZIP转录因子在生物学过程的各个方面发挥着关键作用，包括器官分化、胚发育、种子成熟、花和维管发育[3]。研究表明，bZIP转录因子在植物对生物和非生物胁迫的响应过程中发挥着重要的调控作用[3−8]。植物激素脱落酸（abscisic acid, ABA）通过调控大量基因和相关生理过程，在植物对非生物胁迫的响应中发挥着中心作用。近年来，ABA的感知和信号传导研究取得显著进展。研究表明，ABA受体RCAR/PYR/PYL、A类PP2Cs和SnRK2s在植物中控制ABA信号通路。SnRK2s可以通过磷酸化在非生物胁迫引起的ABA依赖信号网络中激活AREB/ABFs[9]。属于A类bZIPs的AREB/ABFs已经被证实调节携带ABRE顺式作用元件的ABA依赖基因的转录，从而导致ABA响应或环境适应[10]。在拟南芥中，累积的证据表明A类bZIPs，如AtAREB1、AtAREB2、AtAREB3、AtABF1和AtABF3，在非生物胁迫响应或ABA信号中发挥作用[5, 11]。例如，AtABF2/AtAREB1经第三亚类SnRK2s磷酸化而激活，其过表达提升了植物对干旱胁迫的抗性并增强了ABA敏感性[11−13]。在水稻中，已确认一些A类bZIPs家族成员，如OsbZIP23和OsbZIP46，过表达它们可以增强转基因水稻的耐旱性[14]。总体而言，这些证据显示，bZIPs在植物对非生物胁迫的响应过程中发挥着不可或缺的转录因子作用。【本研究切入点】木薯（Manihot esculenta Crantz）是热带和亚热带地区的重要粮食作物之一，是世界第六大粮食作物，为约7亿人口提供丰富的碳水化合物[15, 16]。课题组之前进行了木薯MebZIP家族的全基因组分析，发现木薯中存在77个MebZIP家族成员。这77个MebZIPs根据拟南芥和水稻中的同源bZIPs被分为10个亚家族[17]。尽管木薯是热带和亚热带地区的重要粮食作物，但关于其A类MebZIPs基因的研究仍相对匮乏[18]，特别是在非生物胁迫下的功能和调控机制尚不明晰。【拟解决的关键问题】本研究通过克隆A类MebZIPs中的MebZIP27基因，对其编码蛋白序列进行生物信息学分析，同时检测MebZIP27基因在组织中的特异性表达、亚细胞定位及胁迫和植物生长调节剂响应模式，并在体外成功表达并纯化MebZIP27蛋白，为下一步研究MebZIP27基因的功能奠定了良好的基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
供试Argentina 7（Arg7）木薯品种由中国热带农业科学院热带生物技术研究所提供。收集大田种植的不同生长阶段[90 d （R1）、150 d（R2）、210 d（R3）、270 d（R4）、330 d（R5）]的木薯储藏根材料。选取生长60 d、生长势一致的Arg7木薯幼苗进行不同植物生长调节剂和胁迫处理。（1）植物生长调节剂处理：使用10% H2O2和100 μmol·L−1 ABA处理幼苗，并在处理0、2、6、10、24 h后采集叶片样本。（2）胁迫处理：使用200 mmol·L−1甘露醇和300 mmol·L−1 NaCl处理另一批幼苗，并在处理0 h、2 h、6 h、3 d、14 d后采集叶片样本。（3）低温胁迫：将部分幼苗转移至4 ℃，在0、2 、6、10、48 h采集叶片样本。采集的所有样本迅速用液氮速冻，并保存在−80 ℃冰箱，以备后续RNA提取和分析。
1.2 MebZIP27基因克隆及其序列分析
基于Phytozome数据库中木薯序列（cassava4.1_010216m）的信息，设计特异性引物MebZIP27-F和MebZIP27-R（表1）。提取叶片总RNA，反转录生成cDNA作为模板，进行PCR扩增。利用ExPASy ProtParam在线工具（http://web.expasy.org/protparam/）分析MebZIP27基因编码蛋白的理化特性。在结构预测方面，借助SOPMA和SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）软件进行预测，并通过BLASTP工具（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）在数据库中搜索同源序列。此外，利用MEGA-X软件中的MUSCLE算法进行序列比对分析，并采用Neighbor-joining法构建系统发育树，以揭示MebZIP27基因与其他相关基因的进化关系。
表 1 引物序列Table 1. Primers applied引物名称
Primer上游序列
Forward primers (5'-3')下游序列
Reverse primers (5'-3')用途
UsageMebZIP27 ATGGGGACTCATCTCAACTTCAAGAACTTC TTACCATGGACCAGTCTGAGTCCTC 基因克隆 MebZIP27Q GAGCAGCAGGGAGTTA TACGCAAAGTGAGACG 实时荧光定量PCR TUB TGCCATGTTCCGTGGAAAGATG CCCCTAGGTGGAATGTCACAGACAC 实时荧光定量PCR MebZIP27-P TTCCAGGGGCCCCTGGGATCATGGGGACTCATCTC
AACTTCAAGAACTTCGTCACGATGCGGCCGCTCGATTACCATGGACCAGT
CTGAGTCCTC原核表达 1.3 基因表达分析
基于MebZIP27基因序列设计特异性qRT-PCR引物MebZIP27Q-F和qMebZIP27Q-R（表1），分析MebZIP27基因在不同处理下的表达模式。内参基因使用MeTUB基因，基因相对表达量的计算采用2−△△Ct法[19]。
1.4 亚细胞定位
首先，将本氏烟草（Nicotiana benthamiana）种子播种于育苗基质中，置于人工气候箱内，在14 h光照（光照强度约120 μmol·m−2·s−1）/10 h黑暗、恒温25 ℃、相对湿度70%的条件下连续培养4～5周，待植株生长至叶龄4～6片真叶且茎叶健壮后，筛选无病虫害的健康植株用于后续试验。接着，采用电转化法将质粒pBWA(V)HS-Green-MebZIP27导入农杆菌（GV3101）中，并在30 ℃下培养2 d。随后，刮取农杆菌接种至含有相应抗性YEB液体培养基的试管中（10 mL），以180 r·min−1的转速培养1 h。通过离心（
4000 r·min−1, 4 min）去除上清液，收集农杆菌菌体，并使用含有10 mmol·L−1 MgCl2和120 μmol·L−1 AS的悬浮液重悬菌体，调节D600 nm至约0.6。接下来，挑选健壮的烟草植株，用1 mL无针头注射器从叶片下表皮注入农杆菌悬液，并标记注射部位。注射后将烟草植株放置在弱光条件下培养2 d，以便后续观察。最后，取注射后的烟草叶片制作玻片样本，使用激光共聚焦显微镜进行观察并拍摄记录。在共定位试验中，将Marker质粒与载体质粒的农杆菌悬液以1∶1的比例混合后注射至烟草叶片。GFP的激发光和发射光分别为488 nm/510 nm，叶绿体的激发光和发射光为640 nm/675 nm，核定位信号蛋白的激发光和发射光为561 nm/580 nm。1.5 原核表达
首先，利用BamH I和Xho I酶将pMD18-MebZIP27载体上的CDS序列克隆至pGEX-6p-1载体中，构建得到pGEX-6p-1-MebZIP27原核表达载体。接着，将该质粒转化入BL21（DE3）菌株，进行菌落PCR筛选，选择正确条带大小的菌落进行扩大培养，并将其保存在20%甘油溶液中备用。然后，将少量甘油菌接种至8 mL LB培养基中培养至D600 nm为0.4～0.6，收集1 mL菌液作为诱导前样本。为了诱导表达，在培养物中加入0.2 mmol·L−1的IPTG，在18 ℃和37 ℃下分别诱导表达16 h。诱导结束后，离心收集菌体，重悬于裂解缓冲液中，使用超声波破碎细胞，并过滤裂解液。接下来，将裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠微球在4 ℃下孵育3 h，收集微球，通过谷胱甘肽琼脂糖珠微球进行GST-MebZIP27的纯化。最后，将纯化后的蛋白样品与SDS上样缓冲液混合，在100 ℃下煮沸10 min，并使用SDS-PAGE进行检测分析。
2. 结果与分析
2.1 MebZIP27基因克隆
在先前的研究中，发现木薯A类bZIP基因（cassava4.1_010216m）在经过ABA处理后表现出显著的诱导表达（图1A）。基于cassava4.1_010216m的序列信息，成功设计并合成特异性引物，通过PCR扩增和测序，获得了一个长度为1 251 bp的片段（图1B和1C），该蛋白片段编码416个氨基酸。保守结构域预测显示，MebZIP27蛋白具有bZIP家族结构域（图1D），将其命名为MebZIP27基因。对MebZIP27蛋白的理化性质进行分析，推测其分子式为C1926H
3130 N604O625S17，相对分子量为45.29 kDa，理论等电点为9.75。此外，其不稳定系数达47.28，表明该蛋白属于不稳定蛋白范畴。在基因结构方面，通过与基因组序列进行比对分析，确定该基因包含4个外显子和3个内含子。![]()
图 1 MebZIP27基因的克隆M：DNA标准物；1：基因克隆产物样品，2～7：菌液PCR样品；A：ABA处理下的表达分析（数值为相比0 h的表达量并对值取log2）；*和**分别表示与0 h相比在0.05和0.01水平上差异显著。B：MebZIP27基因克隆；C：MebZIP27基因片段的菌液PCR检测；D：结构域分析。Figure 1. Cloning of MebZIP27M: DNA marker; 1: sample of gene cloning product; 2–7: samples of bacterial broth. A: MebZIP27 expression under ABA treatment (log2 value relative to 0 h); * and **: significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively. B: clone of MebZIP27. C: PCR detection of MebZIP27 segment in bacterial broth. D: domain analysis.2.2 MebZIP27氨基酸序列的同源性比对与系统发育树分析
为了分析MebZIP27蛋白与其他物种中相关蛋白的序列相似性，在NCBI数据库中检索与MebZIP27蛋白序列相似度超过70%的蛋白序列，并进行详细的比对分析。比对结果显示，MebZIP27蛋白与橡胶树（Hevea brasiliensis）的HbABI5（XP_021688998.2）和麻风树（Jatropha curcas）的JcABI5（XP_012071654.1）序列一致性较高，分别为85.41%和80.00%（图2）。这一结果进一步验证了不同物种间bZIP蛋白序列的保守性。构建系统发育树以分析不同物种中bZIP蛋白的进化关系，结果（图3）显示，木薯（大戟科）的MebZIP27与橡胶树的HbABI5在进化上具有较高的亲缘关系，位于同一分支。
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图 2 MebZIP27蛋白序列与其他bZIPs蛋白序列的比对分析黑色线段为bZIP结构域，总共有54个氨基酸。Figure 2. Alignment of protein sequences of MebZIP27 and othersBlack line indicates segment of bZIP domain of 54 amino acids.![]()
图 3 基于MebZIP27氨基酸序列相似性构建的系统发育树Figure 3. Phylogenetic tree based on MebZIP27 amino acid sequence similarity2.3 转录因子MebZIP27蛋白的亚细胞定位
基于在线预测软件（Softberry和WoLF PSORT servers）的分析，初步推断MebZIP27蛋白定位于细胞核。为了验证这一预测，将MebZIP27基因的CDS序列成功连接至pBWA(V)HS-Glosgfp载体，构建了pBWA(V)HS-Green-MebZIP27植物表达载体。随后在烟草叶片中进行了亚细胞定位试验。通过对比核定位信号、叶绿体信号以及绿色荧光蛋白的表达情况，观察到MebZIP27主要在细胞核中表达。该研究结果进一步证实了MebZIP27转录因子确实定位于细胞核内（图4）。
2.4 MebZIP27基因在不同组织和不同处理下的表达模式分析
为了深入研究MebZIP27基因在木薯不同组织中的表达模式，下载公开的转录组数据（https://shiny.anforthcenter.org/cassava_atlas/），并对其进行分析[20]。通过解析数据，获得了包括储藏根（storage root, SR）、茎（stem）、叶（leaf）、须根（fibrous root, FR）、分化胚组织（organized embryogenic structure, OES）、根尖分生组织（root apical meristem, RAM）、根顶端分生组织（shoot apical meristem, SAM）、松散性胚性愈伤组织（friable embryogenic calli, FEC）、叶柄（petiole）、中脉（midvein）和侧芽（lateral bud）在内的11个木薯组织中的MebZIP27基因表达数据。分析结果显示，MebZIP27基因在木薯不同组织中的表达水平存在显著差异，其中在储藏根中的表达量尤为突出，显著高于其他组织（图5）。进一步对储藏根中不同阶段的表达量进行了分析，结果显示随着块根的发育，MebZIP27基因的表达呈逐渐增加的趋势，在R4（270 d）阶段达最高点，之后开始下降并同时保持较高的表达水平（图6）。
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图 5 不同组织中MebZIP27基因的表达水平不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。表6、7同。Figure 5. MebZIP27 expressions in different tissuesDifferent lowercase letters indicate significant differences at 0.05 levels. Same for Table 6, 7.![]()
图 6 木薯不同块根发育阶段中MebZIP27基因的表达量Figure 6. MebZIP27 expressions in cassava storage roots at different developmental stages为了研究MebZIP27基因在不同外界胁迫条件下的表达特性，分析了MebZIP27基因在不同处理条件下的表达模式。结果表明，随着甘露醇和NaCl处理时间的延长，MebZIP27基因的表达量呈现出上升的趋势，但与对照组相比并未达显著差异水平（图7A和图7B）。在冷处理条件下，MebZIP27基因的表达量与对照相比同样没有显著变化（图7C）。然而，在H2O2处理下，MebZIP27基因的表达受到明显的抑制（图7D）。特别值得关注的是，ABA处理下，MebZIP27基因的表达量随着处理时间的增加，呈现先上升后下降的变化趋势，且在所有处理时间点均表现出显著的诱导表达，其中在10 h时达最高表达水平（图7E）。综合这些结果，推测MebZIP27基因的表达可能受到H2O2和ABA信号的调控，为进一步揭示其在植物胁迫响应中的功能提供了重要线索。
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图 7 不同处理条件下MebZIP27基因的表达模式A：NaCl处理，B：甘露醇处理，C：冷处理，D：H2O2处理，E：ABA处理。Figure 7. MebZIP27 expressions under different treatment conditionsA: NaCl treatment; B: mannitol treatment; C: cold treatment; D: H2O2 treatment; E: ABA treatment.2.5 木薯MebZIP27蛋白的原核表达分析
基于MebZIP27基因序列的预测结果，该基因所编码的蛋白质分子量约为45.29 kDa。同时，质粒上携带的GST标签蛋白分子量为26 kDa。因此，推测在重组质粒经过诱导表达后，形成的融合表达蛋白的分子量应接近71.29 kDa。按照优化的条件，将含有转化重组质粒的菌液培养至D600为0.4～0.6，随后添加0.2 mmol·L−1 IPTG，在37 ℃条件下诱导表达16 h（图8A）。离心收集菌体，将其悬浮于适量的裂解缓冲液中，并对细菌细胞进行超声波破碎。经过滤后得到的细胞裂解液与谷胱甘肽琼脂糖珠微球在4 ℃下孵育3 h，然后使用GSH溶液对收集的微球进行洗脱，最终得到GST-MebZIP27蛋白。结果如图8B所示，目标条带与预测大小一致，成功诱导和纯化出GST-MebZIP27蛋白产物。
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图 8 MebZIP27蛋白的原核表达M：蛋白标准物；1：18 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜上清；2：18 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜沉淀；3：37 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜上清；4：37 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜沉淀；5：细胞裂解后上清；6：细胞裂解后沉淀；7：流穿液；8：20 mmol·L−1GSH洗脱液1；9：20 mmol·L−1GSH洗脱液2；10：20 mmol·L−1GSH洗脱液3；11：20 mmol·L−1GSH洗脱液4；12：20 mmol·L−1GSH洗脱液5；13：20 mmol·L−1GSH洗脱液6。Figure 8. Prokaryotic expression of MebZIP27 proteinM: protein ladder; 1: supernatant after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 18 ℃; 2: precipitate after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 18 ℃; 3: supernatant after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 37 ℃; 4: precipitate after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 37 ℃; 5: supernatant after cell lysis; 6: pellet after cell lysis; 7: flow-through; 8: elution buffer 1 with 20 mmol·L−1 GSH; 9: elution buffer 2 with 20 mmol·L−1 GSH; 10: elution buffer 3 with 20 mmol·L−1 GSH; 11: elution buffer 4 with 20 mmol·L−1 GSH; 12: elution buffer 5 with 20 mmol·L−1 GSH; 13: elution buffer 6 with 20 mmol·L−1 GSH.3. 讨论
木薯是非洲、亚洲和拉丁美洲继水稻和玉米之后的第三大作物。与水稻、玉米、小麦和棉花等主要作物相比，木薯的研究进展极为缓慢。木薯表现出显著的抗逆特性，尤其在耐旱性和低肥力适应能力方面具有独特优势[15]。然而，木薯对非生物胁迫的响应机制尚不明确。已有研究证实，ABA信号通路在植物应对非生物胁迫过程中扮演着核心角色，其中A类bZIPs转录因子作为该通路的关键组成部分，发挥着不可或缺的作用。大量研究表明，A类bZIPs（AREB/ABFs）通过调控ABA依赖基因的表达，在ABA响应或环境适应中发挥重要作用[1]。然而，木薯MebZIPs的身份和功能仍然未知。
本研究已成功克隆出A类bZIPs家族的关键成员——MebZIP27基因。通过表达模式分析，发现MebZIP27基因在木薯Arg7的不同组织间展现出差异性的表达特点，特别是储藏根中的表达水平最高。储藏根中高表达表明，MebZIP27基因可能在木薯储藏根的生长与发育过程中具有重要作用。植物的bZIP类转录因子在不同组织中表达存在差异。研究发现，许多植物的bZIP类基因转录因子主要在根部表达[21, 22]。例如，从小麦条锈菌叶片中分离出的TabZIP1转录因子主要在小麦根系中表达[21]。而有的bZIP基因则在不同组织中都有表达。例如，来自辣椒的CabZIP1基因在不同组织中均有表达[23]。这些研究也表明植物bZIP类转录因子在不同组织中的表达模式存在多样性。
随着基因工程技术的日益精进，利用原核生物表达生物大分子已成为一种切实可行的策略。该技术以其高效、快捷等诸多优势，在植物分子生物学研究领域的应用日益广泛，为科学研究提供了强有力的工具[24]。本研究利用大肠杆菌进行原核表达，成功获得了带有GST标签的MebZIP27融合蛋白。随后，通过谷胱甘肽琼脂糖珠对蛋白进行了纯化，结果显示在目标片段大小处获得了纯化带，证明已经成功制备了GST-MebZIP27蛋白，为进一步利用EMSA等试验分析木薯MebZIP27转录因子调控下游基因机制研究奠定了基础。
A类bZIP转录因子在植物中广泛参与调控ABA信号和胁迫应答基因的表达。以拟南芥为例，过量表达ABF2能够提高植物对多种胁迫的耐受性，为植物适应性提供了潜在机制[25]。在水稻中，干旱胁迫会强烈诱导OsbZIP71基因的表达，而其过表达OsbZIP71基因可以增强转基因植株对干旱胁迫的耐受性[26]。ABF2、ABF3和ABF4都响应ABA信号并参与相关下游信号通路的调控[27]。此外，水稻中的OsABF2、OsABI5和OsbZIP52能结合靶基因中的ABRE元件，有效调控植物ABA响应基因的表达[28]。OsABF1在水稻中通过结合ABA响应元件，增强了水稻对非生物胁迫的逆境信号应答[29]。OsbZIP23是水稻bZIP转录因子家族的关键成员，提高了水稻对ABA的敏感性，并增强了对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性[30]。最后，OsABI5在水稻的幼苗中受到ABA和高盐胁迫的诱导，导致其上调表达；然而，在干旱和低温胁迫下，其表达水平下调，并参与了水稻的育性和对胁迫的耐受性[31]。在葡萄（Vitis vinifera）中，VvABF2参与ABA信号通路，并对葡萄浆果的成熟产生影响[32]。这些研究结果突显了A类bZIPs转录因子在植物生理和逆境应答中的多样性功能。本研究的结果显示，虽然MebZIP27基因的表达在NaCl、甘露醇和低温处理下没有显示出显著差异，但明显受到ABA处理的诱导。推测MebZIP27基因不直接响应这些逆境处理，可能通过ABA信号通路的调控来响应相关逆境胁迫。H2O2作为关键的信号分子，受到环境和发育刺激的诱导[33]。为了验证木薯MebZIP27基因是否参与H2O2信号传递途径，H2O2处理结果表明，MebZIP27基因在处理后显著受到抑制，与BdbZIPs对H2O2的响应结果相似[4]。基于以上结果，本研究推测MebZIP27基因可能参与非生物胁迫的响应调控，这一过程可能与ABA信号通路相关。这些研究成果为进一步研究MebZIP27基因在ABA信号通路中的功能提供了参考依据。
4. 结论
木薯中的MebZIP27基因属于A类bZIP基因家族，定位于细胞核。qRT-PCR分析显示，在木薯储藏根中，MebZIP27基因的表达最为显著；MebZIP27基因在ABA和H2O2处理下表现出显著诱导；通过原核表达成功分离纯化了GST-MebZIP27重组蛋白。这些结果为进一步研究MebZIP27基因在ABA信号途径中的作用提供了一定依据。
致谢
感谢李丹丹女士在试验材料管理和论文撰写过程中所做的校对工作。
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图 1 MebZIP27基因的克隆
M：DNA标准物；1：基因克隆产物样品，2～7：菌液PCR样品；A：ABA处理下的表达分析（数值为相比0 h的表达量并对值取log2）；*和**分别表示与0 h相比在0.05和0.01水平上差异显著。B：MebZIP27基因克隆；C：MebZIP27基因片段的菌液PCR检测；D：结构域分析。
Figure 1. Cloning of MebZIP27
M: DNA marker; 1: sample of gene cloning product; 2–7: samples of bacterial broth. A: MebZIP27 expression under ABA treatment (log2 value relative to 0 h); * and **: significant differences at 0.05 and 0.01 levels, respectively. B: clone of MebZIP27. C: PCR detection of MebZIP27 segment in bacterial broth. D: domain analysis.
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图 2 MebZIP27蛋白序列与其他bZIPs蛋白序列的比对分析
黑色线段为bZIP结构域，总共有54个氨基酸。
Figure 2. Alignment of protein sequences of MebZIP27 and others
Black line indicates segment of bZIP domain of 54 amino acids.
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图 3 基于MebZIP27氨基酸序列相似性构建的系统发育树
Figure 3. Phylogenetic tree based on MebZIP27 amino acid sequence similarity
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图 5 不同组织中MebZIP27基因的表达水平
不同小写字母表示在0.05水平上差异显著。表6、7同。
Figure 5. MebZIP27 expressions in different tissues
Different lowercase letters indicate significant differences at 0.05 levels. Same for Table 6, 7.
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图 6 木薯不同块根发育阶段中MebZIP27基因的表达量
Figure 6. MebZIP27 expressions in cassava storage roots at different developmental stages
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图 7 不同处理条件下MebZIP27基因的表达模式
A：NaCl处理，B：甘露醇处理，C：冷处理，D：H2O2处理，E：ABA处理。
Figure 7. MebZIP27 expressions under different treatment conditions
A: NaCl treatment; B: mannitol treatment; C: cold treatment; D: H2O2 treatment; E: ABA treatment.
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图 8 MebZIP27蛋白的原核表达
M：蛋白标准物；1：18 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜上清；2：18 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜沉淀；3：37 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜上清；4：37 ℃ 0.2 mmol·L−1 IPTG诱导过夜沉淀；5：细胞裂解后上清；6：细胞裂解后沉淀；7：流穿液；8：20 mmol·L−1GSH洗脱液1；9：20 mmol·L−1GSH洗脱液2；10：20 mmol·L−1GSH洗脱液3；11：20 mmol·L−1GSH洗脱液4；12：20 mmol·L−1GSH洗脱液5；13：20 mmol·L−1GSH洗脱液6。
Figure 8. Prokaryotic expression of MebZIP27 protein
M: protein ladder; 1: supernatant after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 18 ℃; 2: precipitate after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 18 ℃; 3: supernatant after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 37 ℃; 4: precipitate after overnight induction in 0.2 mmol·L−1 IPTG at 37 ℃; 5: supernatant after cell lysis; 6: pellet after cell lysis; 7: flow-through; 8: elution buffer 1 with 20 mmol·L−1 GSH; 9: elution buffer 2 with 20 mmol·L−1 GSH; 10: elution buffer 3 with 20 mmol·L−1 GSH; 11: elution buffer 4 with 20 mmol·L−1 GSH; 12: elution buffer 5 with 20 mmol·L−1 GSH; 13: elution buffer 6 with 20 mmol·L−1 GSH.
表 1 引物序列
Table 1 Primers applied
引物名称
Primer上游序列
Forward primers (5'-3')下游序列
Reverse primers (5'-3')用途
UsageMebZIP27 ATGGGGACTCATCTCAACTTCAAGAACTTC TTACCATGGACCAGTCTGAGTCCTC 基因克隆 MebZIP27Q GAGCAGCAGGGAGTTA TACGCAAAGTGAGACG 实时荧光定量PCR TUB TGCCATGTTCCGTGGAAAGATG CCCCTAGGTGGAATGTCACAGACAC 实时荧光定量PCR MebZIP27-P TTCCAGGGGCCCCTGGGATCATGGGGACTCATCTC
AACTTCAAGAACTTCGTCACGATGCGGCCGCTCGATTACCATGGACCAGT
CTGAGTCCTC原核表达 
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