Optimization of Culture Conditionsand Analysis of Fermentation Process for Plant Vaccine-producing Bacterium, FJAT-1458
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摘要: 对番茄青枯病植物疫苗菌株FJAT-1458进行培养条件优化和发酵过程状态参数研究。采用摇瓶培养和单因素试验研究菌株FJAT-1458的培养条件，确定最适培养基为SPA（蛋白胨5 g·L-1，蔗糖20 g·L-1，KH2PO4 0.5 g·L-1，MgSO4 0.25 g·L-1），最适培养温度为30℃，250 mL三角瓶最适装液量为35 mL。用50 L发酵罐发酵FJAT-1458，发酵过程中菌体数量呈现先升后降的变化趋势，FJAT-1458的生长可分为4个时期：0～6 h为发酵适应期、6～36 h为对数生长期、36～60 h为稳定生长期，72 h后为消亡期。发酵过程中，菌体的致病性指标-弱化指数变化小，介于0.832～0.855，方差分析表明其差异不显著，P>0.05；发酵液pH值从7.23上升至8.78；菌体细胞为短杆状，大小为（1.0～1.5）μm×（0.5～0.8）μm，随着发酵进程，细胞颜色变深，发酵后期细胞开始变形、裂解。Abstract: Conditions to culture FJAT-1458, a bacterium that produces plant vaccine against the tomato bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum, were optimized by asingle factor experiment. They were determined to be the use of an SPA medium containing peptone 5 g·L-1, sugar 20 g·L-1, KH2PO40.5 g·L-1, and MgSO40.25 g·L-1 at 30℃ with 35 mL of broth in a 250 mL shaking flask. Subsequently, in a 50 L fermentation tank, the fermentation was carried out and the process monitored. During the fermentation, the cell count on FJAT-1458 increased initially and followed by a gradual decline with a 4-stage growth period that included the adaptive (0-6 h), logarithmic (6-36 h), stationary (36-60 h), and decline phases (after 72 h). In addition, it was observed that(a) the pathogenicity indicator, attenuation index, of FJAT-1458 ranged from 0.832 to 0.855 showing no significant difference (P>0.05) throughout the entire process; (b) the pH of the fermentation broth increased from 7.23 to 8.78; (c) morphologically, the bacteria appeared to be(1.0-1.5)μm×(0.5-0.8)μm rods with a darkening color as the process proceeded; (d) the cellular secretion from the bacteria increased with time; and, (e) some of the bacterial cells deformed and lysed near the end of fermentation.
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0. 引言
【研究意义】在经济社会的长期发展、工矿业和农业生产多重因素下，土壤受农药和重金属复合污染的程度日益加重，蔬菜生长发育和质量安全也受到严重威胁[1]。【前人研究进展】Cd是毒性最强、污染范围最广的重金属，部分地区农业土壤和谷物、蔬菜等农产品中Cd含量严重超标[2−4]；其中，茎叶类蔬菜对Cd有极强的富集能力，比其他蔬菜品种容易受到污染[5−6]。五氯硝基苯（pentachlorobenzene, PCNB）是取代苯类杀菌剂，属有机氯农药(Organochlorine pesticides, OCPs)，曾是土壤和种子的高效、广谱的强力杀菌剂。五氯硝基苯具有高残留、难降解等特性，半衰期可达5～10个月[7−10]。目前，包括中国在内的许多国家仍在使用PCNB，土壤中依然可检测到残留 [8−11]，并能通过食物链富集。然而，关于PCNB污染对蔬菜的影响研究较少，多数集中在PCNB毒性或中药材的研究。因此，探究PCNB污染土壤上不同蔬菜品种吸收累积PCNB特性对发展生态农业、构建农产品质量安全体系具重要意义。【本研究的切入点】成都作为“天府之国”，土地肥沃、物产丰富，是全国重要的蔬菜生产基地。随着城市化进程的快速推进，工业 “三废”排放和农药大量使用，土壤环境中的污染物正趋于多元化和复杂化，复合污染已成为普遍的污染形式[12−13]，其中有机氯农药和重金属复合污染是较为普遍的土壤污染类型。成都市区蔬菜地中，检测出了双对氯苯基三氯乙烷（dichlorodiphenyltrichloroethane, DDT）、六氯环己烷（hexachlorocyclohexane, HCH）、六氯苯（hexachlorobenzene, HCB）、PCNB在内的18种OCPs，部分检出率高达100%[14]。14个区县内OCPs虽低于国家土壤质量标准（GB15618—1995）的阈值，但部分OCPs残留水平已高于基于人体健康风险和生态风险评价基础上得到的荷兰标准[14]；农田土壤中，Cd较为严重，其含量范围为0.04～0.80 mg·kg−1，有8.63%的农田土壤超过了GB 15618—1995 Ⅱ类土壤所规定的限制值0.6 mg·kg−1，主要污染来源是农业生产中农药大量使用、工业生产和交通排放[15]。农药和重金属复合污染土壤修复的难度大、费用高，种植低富集的农作物是抑制污染物在食物链中传递和保障人体健康的一种有效措施，亦成为农业安全生产和农田安全利用领域关注的重点[5,16−18]。【拟解决的关键问题】本研究通过盆栽试验，探究成都平原普遍种植的5种蔬菜在PCNB-Cd复合污染下的吸收累积特征，探讨蔬菜对PCNB、Cd的富集能力，为成都平原种植结构调整以及污染农田的合理安全利用提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
背景土壤：采自成都大学实验基地表层土壤（5～20 cm），土壤类型为紫色土，基本理化性质：pH值7.06，有机质15.63 g·kg−1，碱解氮109.44 mg·kg−1，速效磷17.82 mg·kg−1，速效钾98.23 mg·kg−1；PCNB和Cd含量分别为0 mg·kg−1和0.012 mg·kg−1，其Cd含量值低于《食用农产品产地环境质量评价标准》（HJ/T 332—2006）中Cd含量≤0.3 mg·kg−1的限量值[19−20]，满足种植业环境要求。土壤阴干备用。
5种供试蔬菜分别为意大利耐抽苔生菜（Lactuca sativa）、云南四季无斑油麦菜（Lactuca sativa var. longifolia）、良明四季奶油小白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis）、正发满身红樱桃萝卜（Red Raphanus sativus）、四季大尖叶莴笋（Lactuca sativa var. angustata），其种子均购于四川省良明农业有限公司。
1.2 仪器和试剂
仪器：气相色谱仪-电子捕获检测器GC-ECD（7890B，Agilent），配双塔自动进样器；电子天平（BSA-2202S-CW，Sartorius）；冷冻高速离心机（X3R，Thermo）；振荡混匀器（Multi Reax， heidolph）；电感耦合等离子体质谱仪ICP-MS（NexION1000, PE）。
试剂：五氯硝基苯标准液，购自Supelco公司；乙腈、甲醇、甲酸和乙酸铵均为色谱级，提取盐包（4 g MgSO4、1 g NaCl、0.5 g Na2H2C6H6O7和1 g C6H5Na3O7）；净化管（2 mL 离心管，内含 20 mg PSA、7.5 mg GCB、142.5 mg无水 MgSO4）；以上试剂均购自安捷伦科技（中国）有限公司。
1.3 试验方法
PCNB-Cd污染土壤：参照成都平原土壤PCNB、Cd污染水平，模拟配制污染土样[13−15,21−24]。精确称取9组不同量的PCNB溶于甲醇、9组不同量CdCl2（CdCl2·2.5H2O）溶于水后，均匀喷洒混入土样中，搅拌均匀后，再将其中4组PCNB土壤和4组Cd土壤多次搅拌、混合制得复合土壤；待甲醇和水挥发后，黑色塑料袋封口、加盖，室温下平衡30 d后，得1个对照组和14个污染处理组，用GC-ECD[25]、ICP-MS[26]分别检测配制土壤中PCNB和Cd的浓度，并按照单因子污染指数法和内梅罗污染指数法对污染程度进行划分[27]，具体见表1。
表 1 各处理组污染水平Table 1. Soil contamination at test lot序号
No.处理
Treatment土壤PCNB
Soil total PCNB/
（mg·kg−1）土壤Cd
Soil total Cd/
（mg·kg−1）污染程度
Pollution
degree1 CK 0.00 0.012 安全 2 PCNB-1 0.44 0.012 轻污染 3 PCNB-2 0.94 0.012 轻污染 4 PCNB-3 2.54 0.012 中污染 5 PCNB-4 6.25 0.012 中污染 6 PCNB-5 9.96 0.012 重污染 7 Cd-1 0.00 0.35 轻污染 8 Cd-2 0.00 0.54 轻污染 9 Cd-3 0.00 0.78 中污染 10 Cd-4 0.00 1.25 重污染 11 Cd-5 0.00 1.96 重污染 12 PCNB-Cd-1 0.47 0.46 轻污染 13 PCNB-Cd-2 1.01 1.07 中污染 14 PCNB-Cd-3 6.74 1.63 中污染 15 PCNB-Cd-4 9.88 0.77 重污染 盆栽试验：试验于2023年2～6月在成都大学大棚实验基地进行。将吸附平衡30 d 后的土壤装入黑色塑料盆（25 cm×20 cm×17 cm），每盆土重4 kg；塑料盆底配有垫纱网和托盘，以防止渗透液溢出。种植前每盆施加1.5 g复合肥，浇水平衡1周后播种，5种蔬菜在1个对照组和14个不同污染处理组中均做5次重复，共计375盆。
蔬菜培育和试验管理：根据蔬菜生长习性，生菜、油麦菜、小白菜和萝卜采用直播方式种植，每个盆均匀播种10～15颗，待幼苗长出四片真叶后间苗，每盆留4株，于3月中旬播种，60 d后收获；莴笋采用移栽方式，从种子市场选择4片真叶、长势一致的幼苗进行移栽、每盆2株，保持均等生长距离，在4月初移栽，50 d后收获。种植期间，试验盆每周轮换1次，以保证相同的气候条件，并根据天气温度适宜进行浇灌、施肥，土壤保湿保持田间持水量（65±2）%。蔬菜以商品成熟为采集标准。由于莴笋从种子市场购买幼苗移栽非直接播种，与其他4种蔬菜不同，因此对莴笋的评估具有一定局限性。
1.4 测定方法
1.4.1 样品采集
参考《土壤环境监测技术规范》（HJ/T 166—2004）采集土壤样品。收集5种蔬菜的可食部分，用去离子水冲洗干净，将莴笋分为茎和叶两种器官，称取鲜重后，部分在105 ℃杀青30 min后，经70 ℃恒温条件下烘干至恒重，称取干重；部分用食品加工粉碎机匀浆，置于塑料自封袋中，在–18 ℃下保存、待测。土壤和蔬菜均为单盆取样。
1.4.2 PCNB含量测定
蔬菜样品：蔬菜中PCNB含量测定参照《蔬菜和水果中有机磷、有机氯、拟除虫菊酯和氨基酸酯类农药多残留的测定》（NT/Y 761—2008）气相色谱检测法[28]。样品用食品加工粉碎机匀浆保存，取25 g试样于100 mL具塞锥形瓶中，加50 mL乙腈和提取盐包，涡旋震荡10 min，离心5 min，取上层清液全部于10 mL聚四氟乙烯净化管中，震荡1 min，离心5 min，使有机相和水相分层。取分层后的乙腈溶液5 mL于玻璃管中，在60 ℃下，氮吹干，用正己烷定容至5 mL，涡旋1 min，过0.22 µm有机滤膜至1 mL进样瓶中，待上机检测。
土壤样品：取10 g土壤样品于50 mL离心管中，加10 mL乙腈，振荡提取30 min，加5 g氯化钠，涡旋1 min，离心5 min，取上清液2 mL于玻璃管中，氮吹干，用乙腈定容2 mL，涡旋1 min，过0.22 µm有机滤膜至1 mL进样瓶中，待上机检测。
GC-ECD分析：DB-
1707 毛细管柱（30 m×0.32 mm，0.25 µm），Ni-ECD电子捕获检测器；进样口温度230 ℃；检测器温度300 ℃ ；进样量1 μL，分流进样，分流比10∶1；色谱柱升温程序为初始 85 ℃，10 ℃·min−1 升至 170 ℃，5 ℃·min−1 升至 220 ℃，20 ℃·min−1升至300 ℃，3 min。此方法中，PCNB的回收率为85%～110%，检出限为0.0002 mg·kg−1。测定时每批上机样品用标准液进行蔬菜和土壤样品质量控制。1.4.3 Cd含量测定
蔬菜样品：蔬菜中Cd含量测定采用《食品安全国家标准 食品中多元素的测定》（GB 5009.268—2016）电感耦合等离子体质谱法[29]。取1 g前处理蔬菜样品于硝化管中，加入 5 mL HNO3，1 mL 氢氟酸，静置过夜，采用微波消解仪（CEM-MARS）硝解，去离子水定容至25 mL后，过水系，25 mm×0.45 μm过滤针头滤器转移至 50 mL 离心管。硝化后样品置于冰箱保存，待上机检测。
土壤样品：称取 0.2 g 前处理土壤样品粉末置于硝化管，加入 5 mL HNO3，1 mL HF，静置过夜，采用微波消解仪（CEM-MARS）硝解，去离子水定容至 25 mL 后，过水系，25 mm×0.45 μm 过滤针头滤器转移至 50 mL 离心管。硝化后样品置于冰箱保存，待上机检测。
ICP-MS分析：采用氦气碰撞模式分析；等离子体功率
1200 W，采样深度8 mm，雾化室温度2 ℃，雾化气流速 0.66 L·min−1，等离子体气流量 17 L·min−1，辅助气流速 1.20 L·min−1，蠕动泵转速60 r·min−1。此方法，Cd的回收率为 90%～97%，检出限为0.002 mg·kg−1。分析过程以“GBW10048（GSB-26）生物成分分析标准物质芹菜”和“GBW07409土壤成分分析标准物质”分别进行蔬菜和土壤样品质量控制。1.5 数据处理
通过《食品安全国家标准 食品中农药最大残留限量》（GB 2763—2021）查询叶菜类蔬菜和根茎类蔬菜中五氯硝基苯的最大残留限量值；通过《食品安全国家标准 食品中污染物限量》（GB 2762—2022）判定5种蔬菜中镉含量是否超标。
富集系数（bioconcentration factors, BCF）：蔬菜体内某种污染物含量与土壤中该污染物含量的比值[30]，反映了蔬菜对土壤中污染物的积累能力。富集系数=蔬菜体内目标污染物含量（mg·kg−1）/ 土壤中目标污染物的含量（mg·kg−1）。
耐性指数：通常采用胁迫响应生物量（biomass response to stress, BRS）作为评价指标，评估蔬菜对污染物的耐受性[5,19]。生物量对胁迫的响应/%=[（不同处理下可食用部分生物量−CK处理下蔬菜可食用部分生物量）/ CK处理下蔬菜可食用部分生物量]×100。
采用SPSS 27.01对数据进行统计分析；用 Origin 8.0作相关的统计图表。
2. 结果与分析
2.1 土壤PCNB和Cd污染对蔬菜生长的影响
2.1.1 PCNB污染土壤
PCNB对蔬菜生物量的影响见图1。在CK处理组的土壤上，生菜、油麦菜、小白菜、萝卜、莴笋茎叶的干重分别为1.24、2.15、0.52、5.63、8.62、4.55 g·株−1。与对照组CK相比，随着PCNB处理浓度的升高，生菜、油麦菜和小白菜的干重呈现先升高后降低的趋势，而根茎类蔬菜的干重则呈现下降趋势。在污染浓度为PCNB-5时，蔬菜可食用部分的干重都显著低于对照组CK。
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图 1 不同PCNB、Cd含量土壤上5种蔬菜可食部分的干重不同小写字母表示处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 1. Dry weight edible part of vegetables grown on PCNB-Cd contaminated soilDifferent lowercase letters indicate significant differences at P＜0.05.中低浓度PCNB污染土壤中（PCNB-1～PCNB-4），生菜、油麦菜、小白菜的生物量分别增加了8.21%～54.52%、11.35%～53.71%、0.85%～24.92%；较高PCNB污染土壤上（PCNB-5），生菜、油麦菜、小白菜的BRS为负值，说明中低浓度PCNB土壤对叶类蔬菜生长有促进作用，高浓度下会抑制蔬菜生长。在PCNB处理的土壤上，萝卜、莴笋茎叶BRS均为负值，范围在−22.55%～−8.26%、−26.71～−10.91%、−19.56%～−6.92%，表明PCNB对根茎类蔬菜的生长有抑制作用，其中对莴笋茎的影响高于叶片。
2.1.2 Cd污染土壤
在Cd污染土壤上，5种蔬菜的生长均受到影响（图1）。在Cd-1～Cd-5的污染水平上，5种蔬菜可食部分的干重随Cd处理浓度升高而减小，且都显著低于CK处理。土壤Cd污染对5种蔬菜的生长均为抑制作用，但对根茎类蔬菜的抑制作用更为明显。
与对照组CK相比，5种蔬菜在镉污染土壤上的生物量均有所下降，且BRS均为负值。叶类蔬菜BRS范围为−32.89%～−12.27% ，其中小白菜受Cd影响最为显著。根茎类蔬菜BRS为−34.26%～−19.56%，受影响程度大于叶类蔬菜。在Cd污染土壤环境下，Cd对莴笋的茎的影响高于对莴笋叶片的影响。
2.1.3 PCNB-Cd复合污染
5种蔬菜在复合污染土壤生长过程中均未出现农药药害、重金属毒害等现象。蔬菜可食部分干重如图1所示。随着复合污染程度的加剧，蔬菜干重的变化与单PCNB污染相似。生菜、油麦菜和小白菜的干重为1.12～1.74 g·株1、1.84～3.06 g·株−1，0.41～0.58 g·株−1，随复合污染程度升高呈现先上升后下降的趋势；而萝卜和莴笋茎叶的干重随复合污染程度升高呈现出下降趋势，其干重分别为3.75～4.62 g·株−1、6.22～7.33 g·株−1、3.59～3.67g·株−1。但相对单独PCNB污染土壤，复合污染下的5种蔬菜干重均有所下降，可能是土壤Cd污染减弱了PCNB对叶类蔬菜的促进作用和根茎的抑制作用。而与单独Cd污染土壤比较，5种蔬菜的干重有所增加，可能是土壤中PCNB缓解了Cd对蔬菜生长的抑制作用。
除小白菜外，其余4种蔬菜的BRS与单PCNB污染相似。复合污染PCNB-Cd-1～PCNB-Cd-3对生菜、复合污染PCNB-Cd-1～PCNB-Cd-2对油麦菜均有促进作用，但小于单PCNB污染对蔬菜的促进作用； PCNB-Cd复合污染土壤均对萝卜、莴笋茎叶的生物量也为抑制作用。小白菜的BRS为−20.42%～10.34%，仅在低复合污染（PCNB-Cd-1）时为正值，起促进作用；在其他污染水平下均为负值，为抑制作用，原因可能为小白菜更易受土壤Cd的影响。
2.2 不同处理组下蔬菜PCNB和Cd的吸收富集差异
2.2.1 PCNB污染土壤
在无污染土壤CK和镉污染土壤上，蔬菜均未检测出PCNB。蔬菜可食部分PCNB含量见图2，生菜、油麦菜、小白菜在PCNB污染土壤（PCNB-1～PCNB-4）上PCNB的含量为2.98×10−3～3.87 ×10−2 mg·kg−1，均未超过食品安全标准叶类蔬菜最大残留量0.05 mg·kg−1，但在PCNB质量浓度为9.98 mg·kg−1的土壤上，3种叶类蔬菜超过限量值的2%～6%。PCNB在萝卜茎块中检出率较低，含量为1.20×10−3～3.00×10−3 mg·kg−1，可能与萝卜对PCNB富集能力有关。莴笋茎的含量为1.09×10−2～1.65×10−1mg·kg−1，未超过食品安全根茎类蔬菜可食部分限量值标准0.20 mg·kg−1，而莴笋叶在PCNB-4～PCNB-5污染土壤上，超过限量值1～2倍。
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图 2 5种蔬菜可食部分PCNB含量不同的小写字母表示在相同处理条件下，不同蔬菜之间存在显著差异（P ＜ 0.05）。同图4。Figure 2. PCNB contents in edible part of vegetablesDifferent lowercase letters indicate significant differences between different vegetables under the same treatment (P ＜ 0.05).Same for Fig.4.PCNB平均富集系数为1.0×10−4～3.92×10−2（图3），其中莴笋叶最大，萝卜最小，莴笋茎、小白菜、油麦菜和生菜的富集系数介于二者之间。
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图 3 5种蔬菜可食部分Cd含量同小写字母表示不同蔬菜处理间差异显著（P＜0.05），同图5。Figure 3. Cd contents in edible part of vegetablesDifferent lowercase letters represent significant differences between vegetables at P＜0.05，same for Fig.5.2.2.2 Cd污染土壤
图4所示，在CK组和单独PCNB污染处理（PCNB-1～PCNB-5）上，蔬菜Cd含量在4.0×10−3～8.0×10−2 mg·kg−1，均未超标食品安全叶菜类限量值0.20 mg·kg−1或根茎类限量值0.1 mg·kg−1。在Cd污染土壤上（Cd-1），生菜、油麦菜、小白菜Cd含量分别是0.159 、0.117 、0.184 mg·kg−1，但萝卜、莴笋茎叶均超标；在Cd含量为0.54 mg·kg−1土壤上生长的蔬菜，仅有油麦菜未超标，其蔬菜中Cd含量为0.174 mg·kg−1；在Cd-3～Cd-5污染土壤上，5种蔬菜中Cd含量均超标，其中莴笋叶含量是标准限量值的60倍。
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图 4 5种蔬菜可食部分PCNB、Cd富集系数（n=5）CL-生菜；RL-油麦菜；PC-小白菜；RR-萝卜；ALS-莴笋茎；ALL-莴笋叶。Figure 4. Bioconcentration coefficients of PCNB and Cd in edible part of vegetables（n=5）CL: Lactuca sativa；RL: Lactuca sativa var. longifolia；PC: Brassica rapa subsp. chinensis；RR: Red Raphanus sativus；ALS: Lactuca sativa var. angustata stem；ALL- Lactuca sativa var. angustataleafCd平均富集系数为0.338～2.52（图5），种间差异显著（P＜0.05，n=5）。莴笋叶最大，莴笋茎次之，且富集系数大于1；油麦菜Cd富集系数最小为0.338，莴笋茎叶Cd富集系数差异可能与Cd在蔬菜的体内的转运有关。
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图 5 5种蔬菜可食部分Cd富集系数（n=5）Figure 5. Bioconcentration coefficients of Cd in edible part of vegetables（n=5）2.2.3 PCNB-Cd 复合污染土壤
复合污染下，5种蔬菜吸收富集PCNB、Cd情况见图2、图4。3种叶类蔬菜在复合污染土壤（PCNB-Cd-1～PCNB-Cd-4）上的PCNB含量是2.98×10−3～3.87 ×10−2 mg·kg−1，也未超过最大残留限量0.05 mg·kg−1；在PCNB-Cd复合污染土壤上，生菜、油麦菜和小白菜吸收富集PCNB情况和单独PCNB污染一致。萝卜在复合污染下，吸收积累PCNB能力并未受Cd影响，其可食部分PCNB含量范围在1.2×10−3～2.5×10−3 mg·kg−1。莴笋茎和叶在复合污染下，PCNB含量也具有明显差异，莴笋叶组织中PCNB含量高于茎组织含量。PCNB-Cd复合污染土壤环境下，萝卜受污染程度最小、莴笋叶最高，与单PCNB污染土壤结果一致。
5种蔬菜在复合污染土壤上均受到Cd不同程度的污染。仅在PCNB-Cd-1土壤上（PCNB: 0.47 mg·kg−1, Cd: 0.46 mg·kg−1），部分蔬菜未超过限量值（生菜为0.187 mg·kg−1、油麦菜为0.145 mg·kg−1），而在其余污染水平下，5种蔬菜均超标，其中莴笋叶超标最严重。
随着土壤中PCNB和Cd处理浓度的升高，蔬菜吸收的PCNB和Cd的浓度呈现出上升的趋势。蔬菜在复合污染上吸收PCNB与在单独PCNB污染上吸收PCNB含量没有显著差异；PCNB对蔬菜Cd含量影响也不显著（t验证），表明PCNB-Cd复合污染对蔬菜吸收PCNB、Cd的无促进作用。
复合污染土壤下，5种蔬菜PCNB和Cd的平均富集系数分别1.0×10−4～3.92×10−2和0.337～2.52，与单污染土壤环境下的富集系数无明显差异，说明PCNB-Cd复合污染不影响蔬菜对PCNB和Cd的富集效应。
3. 讨论
3.1 土壤 PCNB和Cd污染对蔬菜生物量的影响
重金属、农药等环境污染物会引起植物生理变化，最直观的影响是对植物生长的抑制。本研究中，5种蔬菜发芽均未受到抑制，没有发黄病害现象。叶类蔬菜的干重在中轻度PCNB污染中有增加的趋势，但随PCNB浓度越高，干重的增量越小。相关性分析表明污染土壤PCNB浓度与根茎类蔬菜的生物量有显著的负相关性（相关系数R2= −0.18, n=5），可能与土壤中微生物或酶活性有关。PCNB为高效杀菌剂，在中低浓度时PCNB能提高土壤酶活性，使土壤中的有害霉菌失活，促进土壤中有机质趋于平衡利于叶菜类蔬菜生长，较高浓度时PCNB抑制土壤酶活性使土壤肥力降低进而影响叶菜类蔬菜生长[10]。PCNB对根茎类蔬菜的生物量均为抑制作用，且效果显著，可能是PCNB主要积累在蔬菜根下部，根茎类蔬菜直接接触对其更为敏感，更易受到影响[8]。在复合污染土壤中 Cd的存在可能导致蔬菜生物量显著低于单一PCNB污染土壤。这是由于Cd作为重金属对植物根系及其生长发育产生直接的毒害作用，抑制了营养物质的吸收[12,31−32]。同时，受PCNB的影响，Cd对蔬菜生长的抑制作用有所减缓。这一现象可能与PCNB提高植物抗氧化酶活性的能力有关[8,10]，从而减轻Cd所引发的氧化应激，降低其对植物的毒性影响[13]。然而，PCNB和Cd之间没有吸附行为，一方面原因可能是土壤有机质有螯合和吸附Cd2+的作用，降低了Cd污染的危害[5,33,34]，另一方面原因可能重金属与以分子形态存在的疏水性有机氯污染物在土壤有机质上的吸附机理不同而不会有影响[13]。
有机氯农药由植被根吸附，通过蒸腾流，由木质部导管向叶片扩散[35,11]。植被根系吸收有机氯农药的能力、向地上部转运能力与污染物的正辛醇-水分配系数（lg Kow）有关[36]。亲水性物质（lg Kow＜1.8）容易从根部转运到木质部，而疏水性物质（lg Kow＞3）易与根中脂质结合，难以将物质从根部转运到木质部[35,37−38]。PCNB疏水性较强（lg Kow=4.64），生菜、油麦菜和小白菜对中轻度PCNB污染土壤的高耐受性，原因可能是PCNB与蔬菜根部脂质结合，蔬菜在土壤中吸收的PCNB难以从蔬菜根部转运到地上部。叶类蔬菜在有机氯农药和重金属轻度复合污染土壤上有高耐受性，一方面是有机氯农药与根部脂质物结合，难以将有机氯农药通过木质部扩散到叶片，一方面是蔬菜具有不良环境胁迫的能力，吸收的重金属只有少部分向地上部转运[39−40]。
不同蔬菜BRS值差异可能与根部富集PCNB和Cd能力、根向地上部转运污染物比例以及重金属螯合物等特性有关[8,41]。不同蔬菜品种吸收OCPs能力与其根系结构也有关[37]，较为发达的根系具有的吸附表面积也较大，因此更易吸收土壤中的有机氯农药。植物通过吸收重金属并将其螯合到根部液泡中来减轻地上部分受到的胁迫，进而降低地上部分的重金属积累[42]。不同蔬菜的品种差异[36,43−44]、螯合物含量差异[41−42]，与蔬菜对PCNB、Cd的BRS有显著相关性。在污染土壤上生长的蔬菜虽无明显毒害现象，但部分蔬菜中Cd含量已经超过国标限量标准（图4），因此无法凭借蔬菜生长情况或生物量来判断其是否受到污染[8,18,45]。相关性分析表明，不同品种蔬菜生物量大小或产量高低与PCNB、Cd含量积累的高低无关，而是由不同品种蔬菜的生理遗传属性决定。
3.2 PCNB和Cd低富集蔬菜品种对比
有机氯农药及其衍生物、重金属可通过食物链富集，蔬菜是其进入生物体的主要途径。因此，选育低富集蔬菜品种对食品安全有重要意义[3,18]。蔬菜对有机氯农药、重金属的富集具有品种特异性，在白菜[35,46]、番茄[36,44]、西葫芦[44]、生菜[43]以及韭菜[47]等蔬菜上得到了证实。土壤在单PCNB污染浓度6.25 mg·kg−1时、复合污染PCNB浓度在6.74 mg·kg−1时，莴笋叶组织已超过食品安全标准根茎类0.2 mg·kg−1。土壤在单PCNB污染浓度9.96 mg·kg−1时、复合污染PCNB浓度在9.88 mg·kg−1时， 3种叶类蔬菜可食部分和莴笋叶组织部分已超过食品安全标准叶菜类0.05 mg·kg−1和根茎类0.2 mg·kg−1。说明生菜、油麦菜、小白菜、莴笋是PCNB高富集型蔬菜，对PCNB较为敏感。萝卜、莴笋茎组织在土壤PCNB的浓度范围内均未受到污染。萝卜虽为根茎类蔬菜，但其富集PCNB的能力较弱，为低吸收型蔬菜，可能与萝卜的根系结构有关。生菜、油麦菜、小白菜在PCNB中低污染时，均在食品安全标准范围内，可与萝卜共同作为在轻度PCNB污染土壤上推荐种植蔬菜。本研究中莴笋茎的PCNB的含量小于叶的含量，与其他研究结论茎＞叶不相符，可能原因是莴笋生长受PCNB抑制使其生物量减少从而促进了PCNB向地上部转运[45]。根据这一结果，不建议食用在PCNB污染土壤或含PCNB复合污染上生长的莴笋叶部分。
土壤Cd浓度为0.35 mg·kg−1，生菜、油麦菜及小白菜可食部分未超出食品安全限量值标准0.2 mg·kg−1。土壤Cd浓度在0.46 mg·kg−1时，除生菜、油麦菜外，其余3种蔬菜可食部分均超过Cd限量值。土壤Cd浓度大于0.67 mg·kg−1时，5种蔬菜可食部分均超过限量值。5种蔬菜在处理组均受到不同程度的污染，受污染程度为莴笋＞萝卜＞小白菜＞生菜＞油麦菜，这表明5种蔬菜都为Cd高富集型蔬菜，对Cd均易感。但在低浓度Cd污染土壤上，生菜、油麦菜未受污染，推荐在轻度Cd污染土壤或轻度PCNB-Cd复合污染土壤上种植。
本研究中，小白菜PCNB的富集系数与Li等[11]的盆栽试验所得结果一致，相关研究结论与Zhang[36] 、Gonzale[44]和Donnarumma[45]在OCPs的田间试验研究结论一致。本试验生菜、油麦菜Cd富集系数与孟媛等[5]以西安为背景值盆栽试验结果一致。Cd富集系数生菜＞油麦菜，这与珠江三角洲[48]、南宁市[49]两个地方Cd富集系数一致。Cd富集系数莴笋＞萝卜，莴笋叶＞莴笋茎，根茎蔬菜＞叶类蔬菜与成都市[50−53]和山东省[54]两个地区蔬菜Cd富集系数结果一致。研究数据均为田间土壤-蔬菜“一对一”采样，表明盆栽试验结果与田间试验结果吻合、品种差异性与田间试验结果也相似，验证了盆栽试验结果对实际农业生产是具有参考性的，因此用盆栽试验对比不同蔬菜品种对农药-重金属富集能力的方案可行。也有研究表明盆栽试验蔬菜的富集系数、污染物浓度高于田间试验，可能与生长气候和栽培条件有关，因此本研究尽量模拟田间真实情况。
4. 结论
（1）中低PCNB污染土壤对叶类蔬菜生物量有促进作用，但随处理浓度升高促进作用变小，且在高浓度时则呈现出抑制作用；PCNB污染土壤对根茎类蔬菜生物量均为抑制作用。在PCNB-Cd复合污染下蔬菜吸收PCNB不受影响。叶用莴苣、油麦菜、小白菜、莴笋叶可食部分PCNB含量均有超过食品安全限量标准，而萝卜和莴笋茎可食部分PCNB含量未超标。此外，5种蔬菜体内PCNB的含量随土壤PCNB浓度升高有所增加的趋势。
（2）Cd污染土壤上，5种蔬菜可食部分均受到不同程度的污染，且种间差异显著。其中，萝卜和莴笋可食部分Cd含量均超出国家食品安全限量值标准。叶用莴苣、油麦菜和小白菜仅在轻度Cd污染浓度上未超标。
（3）5种蔬菜PCNB、Cd富集系数具有显著差异， PCNB富集系数为：莴笋叶＞小白菜＞莴笋茎＞油麦菜＞叶用莴苣＞萝卜；莴笋叶Cd富集系数高于莴笋茎Cd，且都大于1，油麦菜的Cd富集系数最小。莴笋叶PCNB、Cd富集系数均大于其他蔬菜品种。
（4）叶用莴苣、油麦菜对PCNB和Cd的富集能力均较低，宜作为轻度PCNB-Cd复合污染土壤环境条件下低富集蔬菜品种推广种植。萝卜对五氯硝基苯吸收能力低，可在单PCNB污染土壤环境条件下推广种植，但其对Cd富集能力较大，不宜在含Cd土壤上种植。莴笋受生长抑制的影响，PCNB更易积累在莴笋叶中，因此不建议食用在中高度PCNB污染土壤或复合污染土壤下种植的莴笋叶部分。莴笋茎叶组织对Cd吸收富集能力均较大，不建议在中高度Cd污染土壤环境下种植。
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图 1 菌株FJAT-1458发酵过程菌体形态变化
Figure 1. Morphological changes on FJAT-1458 during fermentation process
表 1 植物疫苗菌株FJAT-1458在不同培养条件下的生长量
Table 1 Growth of avirulent strain, FJAT-1458, under varied culture conditions
测定项目 FJAT-1458菌体浓度/
(×108cfu·mL-1)培养基 SPA 1.56±0.12 a NA 0.93±0.05 c LB 1.39±0.11 a 温度 20℃ 1.14±0.06 bc 25℃ 1.27±0.12 b 30℃ 1.77±0.10 a 35℃ 0.91±0.06 c 40℃ 0 装液量 15mL 1.82±0.07 a 25 mL 1.75±0.07 a 35 mL 1.87±0.11a 45 mL 1.77±0.04 a 55 mL 1.71±0.06a 注：同例不同小写字母表示差异达显著水平(P < 0.05)。表 2同。 
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表 2 植物疫苗菌株FJAT-1458发酵过程各参数变化
Table 2 Changes on parameters during fermentationprocess of avirulent strain, FJAT-1458
时间
/hFJAT-1458菌体浓度
/(×108cfu·mL-1)菌株弱
化指数pH值 0 1.12±0.07 a 0.84±0.03 a 7.23±0.01 h 6 1.37±0.15 a 0.84±0.01 a 7.51±0.01 g 12 3.05±1.56 b 0.84±0.03 a 8.27±0.01 f 24 9.37±1.02 c 0.85±0.01 a 8.53±0.03 d 36 12.48±2.55 d 0.85±0.01 a 8.38±0.02 e 48 11.72±1.82 e 0.85±0.01 a 8.72±0.01 b 60 11.05±1.22 f 0.85±0.02 a 8.67±0.01 c 72 8.32±0.43 g 0.83±0.03 a 8.78±0.03 a
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