Identification and Sequencing of Duck Hepatitis A Virus 1 Subtype a Isolated from Mule Ducklings
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摘要: 自胰腺泛黄的雏半番鸭中分离获得1株病毒（命名为FJ1605株），经RT-PCR检测为鸭1型甲肝病毒，通过鸭胚中和试验发现该株病毒可被鸭1型甲肝病毒亚型（DHAV-1a）高免血清特异性中和，确定该株病毒为鸭1型甲肝病毒亚型。对该株病毒VP1基因进行分子特征分析，发现其核苷酸大小为714 bp，与GenBank登录的DHAV-1a同源性为98.1%~99.7%，与DHAV-1 FJ1220毒株同源性最高达99.7%；而与鸭2型甲肝病毒（DHAV-2）、鸭3型甲肝病毒（DHAV-3）VP1基因的核苷酸同源性仅分别为65.7%和68.3%左右。基于VP1基因的遗传进化分析表明，FJ1605分离株属鸭1型甲肝病毒亚型谱系。以该株病毒对7日龄雏半番鸭进行人工感染试验，可完全复制出同于临床病例的病变。以上结果显示，雏半番鸭也可感染DHAV-1a，且表现为胰腺泛黄。Abstract: A strain of duck hepatitis A virus 1 subtype a (DHAV-1a), coded as FJ1605, was isolated from the mule ducklings with pancreatitis. It was identified by RT-PCR analysis and a neutralization test in duck embryos that showed the strain specifically being neutralized by the anti-DHAV-1a hyperimmune serum. Molecular characteristics of VP1 gene of the virus was analyzed to indicate the nucleotide to be 714 bp in length with a homology with those of other DHAV-1a isolates ranging from 98.1% to 99.7% and sharing the greatest similarity to strain FJ1220.On the other hand, the homology between FJ1605 and DHAV-2 was merely 65.7%; and, that between FJ1605 and DHAV-3, approximately 68.3%. Phylogenetic analysis on the VP1 gene also showed FJ1605 to be in the viral lineage of DHAV-1a. Furthermore, an animal infection test clearly displayed the same clinical symptoms as those shown inclinical cases. Thus, it was concluded that the pancreatitis in the mule ducklings was caused by DHAV-1a.
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Keywords:
- DHAV-1a /
- mule duckling /
- VP1 gene
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茶多糖(Tea Polysaccharides, TPs)是一类茶叶中含有的杂多糖复合物，构象繁杂，具有多种生物学活性，如抗氧化、降血糖等[1-3]。其提取制备在传统方法诸如酸碱法、水提醇沉法的基础上，常采用柱层析法纯化，成本高，得率低，限制其产业化推广[4-6]。大量研究报道已经证实，乙醇具有分级纯化富集植物多糖的特性，诸如黄芪[7]、香薷[8]、桑叶[9]等，且易实现工业化生产，成本低廉。
茶叶多糖多采用水提醇沉法制得。前期本课题组研究发现，乙醇可用于辅助提取制备茶叶多糖，即茶叶原料先通过一定浓度的乙醇提取后，实现茶多酚、蛋白质等物质的高浸出，而茶多糖则低浸出，醇提茶渣进一步再通过水相浸提达到茶叶多糖的富集[10]。因此，本研究以清香乌龙茶为原料，通过小规模中试分析比较先65%醇洗+后水提和常规法先水提+后醇沉2种提取方式，以期探究2种制备工艺条件下茶叶多糖与其他物质的分离富集特性，以及粗茶多糖的生物学活性变化，从而为茶叶多糖的工业化量产奠定理论基础。
1. 材料与方法
1.1 材料与设备
清香乌龙茶系福建省农业科学院茶叶研究所自制；粗茶多糖及其分离物在大闽食品(漳州)有限公司制备完成；福林酚(北京索莱宝科技有限公司)；儿茶素单体(EGC、EC、C、EGCG、ECG)及咖啡因，纯度均大于98%(阿拉丁生化科技有限公司)；芦丁，纯度≥98%(UV)(成都曼思特生物科技有限公司)；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH，纯度>97.0%) (东京化成工业株式会社)；无水乙醇、蒽酮、浓硫酸、葡萄糖等均为分析纯试剂(国药集团上海试剂有限公司)。
T6新世纪紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；BioSpec-nano超微量分光光度计(岛津公司)；Agilent1260型液相色谱系统及色谱柱Zorbax SB-C18(美国安捷伦科技有限公司)；ACD-0502-U实验室超纯水系统(重庆颐洋企业发展有限公司)；DK-8D型电热恒温水浴槽(上海一恒科学仪器有限公司)；DHC-9246A电热恒温鼓风干燥箱(上海精宏实验设备有限公司)。
1.2 试验方法
1.2.1 粗茶多糖及其分离物的提取制备
以自制清香乌龙茶为原料，单批次提取投料量10 kg，参照相关文献报道[10]，分别使用2种工艺制备茶叶多糖及分离物(图 1)。工艺1：采用先65%醇洗+后水提的制备方式，分别制得65%乙醇洗取物“TPs-A”，以及醇洗茶渣的水提物粗多糖“TPs-水提”；工艺2：茶叶水提物经浓缩及喷雾干燥得“TPs-B”；水提物经65%乙醇沉淀处理，上清液经浓缩及喷雾干燥，制得“TPs-C”，醇沉物(粗多糖)经分离，制得“TPs-醇沉”。分别称取上述各样品0.100 g，溶于50 mL超纯水后进行茶多糖、蛋白质等项目的定量检测。
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图 1 2种粗茶叶多糖及分离物的工艺制备流程Figure 1. Process route of 2 crude tea polysaccharides and other constituents1.2.2 茶多糖含量的测定
采用蒽酮-硫酸法[11]测定粗茶多糖及其分离物水溶液中的茶多糖含量。
1.2.3 可溶性蛋白含量的检测[11]
准确移取配制的粗茶多糖及其附属产物水溶液4.0 μL，滴加于BioSpec-nano超微量分光光度(以Cy3标记蛋白)检测位置，设光程0.7 mm、波长280 nm检测可溶性蛋白含量。
1.2.4 茶多酚含量的检测
参照国标GB/T 8313-2008中的福林酚法检测配制的粗茶多糖及其分离物水溶液中的茶多酚含量。
1.2.5 儿茶素及咖啡因的测定
儿茶素及咖啡因的测定采用HPLC法[12]，采用TSKgel ODS-100Z色谱柱，流动相为2‰甲酸水溶液(A相)和甲醇(B相)，洗脱方式为83%A(0 min)→75%A(5 min)→73%A(7 min)→58%A(16 min)→83%A(18 min)，柱温40℃，流速1.0 mL·min-1，检测波长280 nm。
1.2.6 总黄酮含量的检测
采用三氯化铝法[11]，分别吸取0.1 mg·mL-1芦丁标准液(50%乙醇配制)0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL于25 mL容量瓶中，加50%乙醇至总体积10.0 mL，依次加入1.5%的AlCl3溶液8.0 mL和醋酸-醋酸钠的缓冲液(0.1 mol·L-1，pH5.5)4.0 mL，并用50%乙醇水溶液定容至25 mL，摇匀，静置30 min后，于415 nm比色测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，以显色液中的芦丁质量(mg)为横坐标，绘制标准曲线并计算线性回归方程。准确移取不同样品液1.0 mL于25 mL容量瓶中，其余步骤按照上述程序添加反应后，415 nm处比色测定。
1.2.7 还原力测定
采用普鲁士蓝法[13]，具体步骤有所改进，方法如下：取不同质量浓度(4、8、12、16、20 μg·mL-1)试验样品2.0 mL于试管中，其余步骤参照文献[11]依次加入0.2 mol·L-1磷酸盐缓冲液、1%铁氰化钾溶液、10%的三氯乙酸溶液和0.1%氯化铁溶液，静置反应后于700 nm检测吸光度值的变化。
1.2.8 DPPH自由基清除率测定[14]
取不同质量浓度样品液0.5 mL于试管中，添加无水乙醇至3.0 mL，使其最终质量浓度为4、8、12、16、20 μg·mL-1，然后再加入0.1 mmol·L-1的DPPH溶液3.0 mL，总体积为6.0 mL，混匀静置反应30 min，于517 nm处比色测定吸光值。其中，对照为3.0 mL无水乙醇与3.0 mL的DPPH溶液静置反应后的吸光度数值。DPPH自由基清除率计算公式为：
DPPH自由基清除率/%=[(A对照−A样品)/A对照]×100% 式中：A对照为未加样品的DPPH自由基吸光度；A样品为加入样品反应后的DPPH自由基吸光度。
1.3 数据分析
采用Origin 7.5和SPSS 19.0软件进行数据分析。试验结果描述为“平均值±标准偏差”。不同小写字母表示差异显著水平(P＜0.05)。
2. 结果与分析
2.1 茶多糖及其分离物组分分析
2种提取工艺粗茶叶多糖提取物的理化组成见表 1。结果表明，相较于先水提+后醇沉的提取方式，采用先醇洗+后水提制得的粗茶多糖TPs-水提中多糖含量显著提高，而先水提+后醇沉分离茶多糖，纯化富集效果并不明显。植物粗多糖中含有一定量的蛋白质，可影响改变多糖的结构和功效，故而脱除杂蛋白十分重要。采用2种提取方式制得的粗茶多糖TPs-水提和TPs-醇沉中，可溶性蛋白含量皆显著降低，尤以先醇洗+后水提效果更佳。综合来看，采用先醇洗+后水提制得粗茶多糖TPs-水提中多糖纯度高，且蛋白质杂质含量低，更易于粗多糖的后续纯化工作。
表 1 茶多糖及分离物的组分含量Table 1. Components of TPs and other constituents组分
/(μg·mL-1)先醇洗+后水提 先水提+后醇沉 TPs-水提 TPs-A TPs-醇沉 TPs-B TPs-C 茶多糖 329.55±1.92a 200.32±1.61b 252.95±4.18b 267.27±3.21b 275.45±4.50b 可溶性蛋白 65.58±1.43c 184.10±6.24a 154.17±1.79b 190.81±1.70a 202.00±1.61a 茶多酚 281.50±9.19b 546.15±1.36a 241.83±12.92b 554.81±4.08a 612.02±3.40a 总黄酮 38.82±0.71b 63.33±0.52a 34.65±0.35b 49.78±1.04b 50.51±0.52b 儿茶素总量 184.31±1.21c 383.32±5.74a 52.33±1.63d 280.43±3.76b 288.66±5.10b 表没食子儿茶素(ECG) 52.70±1.60c 118.40±9.72a 20.71±2.03d 78.26±1.25b 81.07±2.00b 儿茶素(C) 8.29±0.76c 2.90±0.42d 2.98±0.22d 10.04±0.37b 12.17±0.24a 表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG) 89.51±1.78c 199.96±3.59a 17.01±1.01d 141.18±2.28b 144.26±3.14b 表儿茶素(EC) 8.63±0.20c 17.42±0.19a 3.16±0.17d 13.82±0.94b 14.09±0.44b 表儿茶素没食子酸酯(ECG) 25.19±0.38c 44.64±0.65a 8.48±0.80d 37.13±0.50b 37.07±0.26b 咖啡碱 15.72±1.62d 89.25±1.82b 72.24±1.60c 98.20±2.92b 108.97±2.68a 注：儿茶素总量为EGC、C、EGCG、EC、ECG之和。 相较于TPs-A、TPs-B和TPs-C，粗茶多糖TPs-水提和TPs-醇沉中茶多酚/儿茶素类、总黄酮类、咖啡碱等物质含量显著降低。具体来看，粗茶多糖TPs-水提中可溶性蛋白和咖啡碱含量最低，而TPs-醇沉中茶多酚/儿茶素类和总黄酮类含量最低。茶多酚及咖啡碱以醇沉上清液TPs-C中含量最高，而儿茶素类及其单体和总黄酮类则是醇提茶叶TPs-A中含量最高，表明采用先65%醇洗+后水提的提取方式，有助于茶叶中小分子类物质如儿茶素类、总黄酮类、咖啡碱等物质的浸出富集。
2.2 抗氧化活性比较
2.2.1 粗茶多糖及其分离物的还原力表达
抗氧化剂的还原力分析结果(图 2)表明，等同剂量下，茶叶多糖及其分离样品的还原力变化趋势为TPs-C＞TPs-A＞TPs-B＞TPs-水提＞TPs-醇沉，表明抗氧化性依次减弱。研究结果来看，不同提取方式制备的粗茶多糖抗氧化活性不尽相同，采用先醇洗+后水提制备的粗茶多糖TPs-水提抗氧化活性较强。与其相应的分离物TPs-A、TPs-B和TPs-C比较来看，粗茶多糖抗氧化活性较弱。
2.2.2 粗茶多糖及其分离物的DPPH清除活性变化
DPPH自由基稳定，结构简单，已广泛用于各种植提物质的抗氧化活性评价。预试验表明，2种提取工艺制备的粗茶多糖TPs-水提和TPs-醇沉的DPPH清除率显著低于其分离物TPs-A、TPs-B和TPs-C(数据未在文中体现)，由此选取合适浓度来评价茶多糖及其分离物对DPPH的清除率变化，结果(图 3)可见，DPPH清除率变化趋势与茶多糖及其分离物的质量浓度呈剂量依赖效应，逐渐升高。不同质量浓度剂量处理时，可见线性良好的DPPH清除率变化曲线，其DPPH清除率IC50值分别为TPs-水提34.41 μg·mL-1、TPs-醇沉47.70 μg·mL-1、TPs-A 13.75 μg·mL-1、TPs-B 14.45 μg·mL-1和TPs-C 11.29 μg·mL-1。与还原力变化趋势类似，采用先65%醇洗+后水提制备的粗茶叶多糖TPs-水提DPPH清除活性高于水提醇沉法制备的粗多糖TPs-醇沉，然而两者的DPPH清除活性皆低于TPs-A、TPs-B和TPs-C。
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图 3 茶多糖及分离物对DPPH的清除率变化Figure 3. Effects of TPs and other constituents on DPPH scavenging capacity2.3 相关性分析
粗茶多糖及其分离物的还原力变化和DPPH清除活性表达，与其含有的抗氧化组分密切相关。结果(表 2)表明，茶多糖、茶多酚、总黄酮类、咖啡碱等组分与其DPPH清除活性和还原力变化呈正向相关，尤以茶多酚/儿茶素呈显著性相关(P＜0.05)。综合来看，2种粗茶多糖及其分离物的抗氧化活性表达的主要活性成分为茶多酚，而又以儿茶素类的酯型儿茶素作用活性强。而茶多糖、总黄酮类及咖啡碱具有一定的抗氧化作用，然而抗氧化活性弱于茶多酚。
表 2 抗氧化成分与DPPH清除活性及还原力变化的相关分析Table 2. Effects of antioxidants on DPPH scavenging capacity and reducing power项目 Pearson相关性 茶多糖 茶多酚 儿茶素类 EGC C EGCG EC ECG 咖啡因 总黄酮 DPPH清除率 0.599 0.991* 0.856* 0.813 0.520 0.857* 0.890* 0.878* 0.751 0.821 还原力 0.625 0.893* 0.900* 0.852 0.569 0.893* 0.914* 0.926* 0.447 0.858* 注：*表示显著相关。 3. 讨论与结论
乙醇可用于植物多糖的分级纯化，成本低廉，易于实现规模化生产[15-18]。研究表明，50%乙醇浸提茶叶各品质成分的浸出率较常规水提显著提高，尤其是茶多酚、氨基酸等小分子物质[19]，这可能与乙醇水溶液的介电常数的高低变化相关。高浓度乙醇时，水溶液介电常数变低，蛋白质、鞣质、多糖、色素等大分子物质反而不易浸出。由此，乙醇可用于沉淀多糖、蛋白质等大分子物质。研究表明，不同用量乙醇对茶多糖及蛋白质具有不同的沉淀效应，80%乙醇为沉淀析出可溶性蛋白质的最佳浓度，而茶叶多糖在乙醇超过50%时即有较好的沉淀特性[20]。进一步通过单因素试验和正交试验研究发现，选取65%乙醇预处理茶叶时，茶多酚(尤其是其中的儿茶素类)、咖啡碱、总黄酮类等小分子物质和可溶性蛋白质的浸出量显著提高，而茶叶多糖仅低量浸出，因此茶叶物料经醇洗后再进行水提，茶叶多糖的纯度大大提高[10]。
本研究以清香乌龙茶为原料，通过中试规模生产分析比较“先65%醇洗+后水提”和“先水提+后65%醇沉”2种方式提取的茶叶粗多糖及其相应分离物质，并检测了其构成物质的含量变化情况。结果表明，相较于“水相提取”和“水提醇沉法”，采用“先65%醇洗+后水提”工艺制备的粗茶多糖(即TPs-水提)中茶多糖含量最高，可溶性蛋白含量最低。其他组分来看，醇洗茶叶物TPs-A中儿茶素类、总黄酮类等小分子物质含量最高，分析认为与其易于小分子物质浸出有关。醇沉分离多糖时，粗茶多糖TPs-醇沉中茶多酚/儿茶素类、总黄酮类、咖啡碱等物质含量较低，推测可能与乙醇浓度或添加顺序(本研究中乙醇添加于多糖浓缩液中)相关，具体机制有待进一步研究。
茶多糖尤以抗氧化和降血糖活性最为突出，能清除多种自由基[21-23]。然而针对其抗氧化活性的研究结论不一致，有研究分析比较了粗茶多糖和纯化茶多糖的抗氧化活性，发现纯茶多糖片段的DPPH自由基清除率极低，且基本无变化[24]。王黎明等[25]的研究也发现，茶多糖纯度越高对羟基自由基和氧自由基清除能力越弱。本研究结果表明，粗茶多糖TPs-水提和TPs-醇沉的还原力和DPPH清除活性皆显著弱于分离产物，TPs-醇沉活性最弱。茶叶富含有多种可清除自由基活性的物质[26-27]。相关性分析表明，各抗氧化组分与粗茶多糖及其分离产物抗氧化活性表达之间Pearson系数呈正相关，茶多酚/儿茶素类呈显著正相关。进一步研究发现，酯型儿茶素EGCG和ECG与其抗氧化活性表达之间呈显著相关，揭示粗茶多糖及其分离产物中抗氧化活性表达主要影响因素为茶多酚，尤其是儿茶素类中酯型儿茶素活性，而茶多糖、总黄酮类、咖啡碱等物质的抗氧化活性弱于茶多酚。这一定程度上印证了Wang Y L[24]、王黎明等[25]的研究结论。
综上所述，采用先65%醇洗+后水提的浸提方式，可实现茶叶多糖的富集，且可溶性蛋白含量低，该工艺制得的粗茶多糖可视为醇洗茶叶产物的副产品，由此可实现茶叶的综合提取分离，使得粗茶多糖的工业化生产简单可行，成本低廉。同时，茶叶多糖具有一定的抗氧化活性，然而活性弱于茶叶多酚类。粗茶叶多糖的抗氧化活性表达的主要活性成分为茶多酚，尤其是儿茶素类中的酯型儿茶素，而茶多糖的抗氧化活性则弱于茶多酚。
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图 2 FJ1605 VP1基因核苷酸序列与其他鸭肝炎病毒的同源性
Figure 2. Homology of VP1 gene nucleotides of FJ1605 and other duck hepatitis virus strains
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图 3 FJ1605毒株VP1基因遗传进化分析
Figure 3. Phylogenetic analysis on VP1 gene isolated from FJ1605
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图 4 DHAV-1a VP1蛋白的亲水性、抗原指数及表面展示概率分析
Figure 4. Analyses on hydrophilicity, antigenic index and surface display probability of VP1 protein
表 1 参考毒株相关信息
Table 1 Information on reference viruses
登录号 名称 基因型 分离地 分离时间 KF924552 MPZJ1206 DHAV-1a 中国 2012 KC904272 FJ1220 DHAV-1a 中国 2012 KX507161 JX1405 DHAV-1a 中国 2014 KX507163 FJ1513 DHAV-1a 中国 2015 JQ804521 Du/CH/LGD/111238 DHAV-1a 中国 2011 DQ249299 03D DHAV-1 中国 2005* JX390984 FZ99 DHAV-1 中国 1999 GU9446771 MY DHAV-1 中国 2006 JQ316452 X DHAV-1 中国 2011* DQ864514 C80 DHAV-1 中国 2006* JX390983 FZ05 DHAV-1 中国 2005 DQ226541 R85952 DHAV-1 美国 2005* DQ219396 DRL62 DHAV-1 韩国 2005* JX390982 FZ86 DHAV-1 中国 1986 EF427899 CL DHAV-1 中国 2007* EF067924 90D DHAV-2 中国 2007* JF828996 Du/CH/LJS/090905 DHAV-3 中国 2009 EU755009 G DHAV-3 中国 1999 DQ812093 AP-04114 DHAV-3 韩国 2003 注：*表示基因序列提交时间。 
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8. 袁勇，尹钟，谭月萍，周重旺. 茶多糖的提取分离及生物活性研究进展. 茶叶通讯. 2018(03): 8-12 . 百度学术
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