0.   引言

【研究意义】RNA干扰（RAN interference, RNAi）技术广泛应用于动物、植物和微生物等基因功能的研究。利用转基因技术在植物体表达dsRNA，当昆虫取食带有dsRNA的植物，dsRNA随食物进入到昆虫体内，使昆虫某些功能丧失造成损伤或者死亡，从而达到防治害虫的效果。利用RNAi防治害虫的设想已经在鳞翅目和鞘翅目昆虫上实现^[1-2]。西花蓟马Frankliniella occidentalis (Pergande)是一种危险的入侵害虫，对蔬菜和观赏性植物危害严重，并且其传播的番茄斑萎病毒对寄主植物造成重大损失^[3]。西花蓟马虫体小，隐蔽性强，目前常用的防治方法很难有效控制。因此，建立快速有效的西花蓟马RNA干扰技术，对研究西花蓟马的基因功能以及防治蓟马类害虫有重要意义。【前人研究进展】目前将外源dsRNA导入昆虫体内的方式有很多，如饲喂法、注射法、浸泡法、转基因植物表达后昆虫取食等，但是饲喂法和注射法是最常用的两种方法。对于有些昆虫，采用饲喂和注射两种方法都取得较好效果。如烟粉虱通过饲喂dsRNA和显微注射伪蛹和成虫都能有效抑制靶基因的表达^[4-5]；以Pxbursα部分序列的双链RNA(dsRNA)饲喂小菜蛾4龄末期幼虫，发现蛹期Pxbursα的表达受到了显著抑制，小菜蛾的发育停滞在蛹期而无法正常羽化，并最终死亡；利用合成的VgR siRNA注射小菜蛾雌蛹，结果显示16 h内VgR的表达受到明显抑制，证明RNAi对小菜蛾有效^[6-7]。饲喂法也在桔小实蝇^[8]、柑橘全爪螨^[9]、褐飞虱^[10]、白背飞虱^[11]等昆虫上成功应用，注射法在桔小实蝇^[12]、柞蚕^[13]、中华按蚊^[14]、豌豆长管蚜^[15]等昆虫上行之有效。但对有些昆虫饲喂法没有效果，如喂食黑腹果蝇表达dsRNA的酵母没有获得成功^[16]；饲喂法也不能有效沉默东亚飞蝗V-ATPase A/E、CHS1、Kr-h1和Verm基因的表达^[17]。应用RNAi抑制害虫靶基因表达在害虫防治中表现出巨大潜力，目前在刺吸式口器的同翅目昆虫蚜虫、叶蝉和粉虱防治上都已得到应用^[18]。【本研究切入点】国内外对西花蓟马RNAi的研究成熟经验很少^[19]，国内没有关于蓟马RNAi的研究。【拟解决的关键问题】本研究选用膜饲喂法和显微注射法干扰西花蓟马的Actin基因，明确蓟马RNA干扰的合适方法，为小型昆虫基因功能的研究和验证提供依据。

1.   材料与方法

1.1   供试昆虫

西花蓟马由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，用四季豆饲养于人工气候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。饲养条件为温度25℃，相对湿度60%～70%，光照L∶D = 14∶10 h。

1.2   西花蓟马Actin基因的扩增验证

根据NCBI西花蓟马Actin基因序列（GenBank登录号：XM_026432071.1）设计Actin引物（表1）。西花蓟马总RNA的提取采用Trizol（Ambion公司）法，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转成cDNA^[20]。再以西花蓟马cDNA为模板扩增Actin基因^[20]，PCR产物回收纯化（TransGen Biotech, catalog number: DP209）后连接到T载体上，挑选单菌落进行PCR鉴定，并送上海铂尚生物技术有限公司测序。

表  1  引物信息

Table  1.  Primers applied

引物名称 Primer name	序列（5′-3′） Sequence (5′-3′)
Actin/F	ATGTGTGACGACGATGTTGC
Actin/R	TTAGAAGCACTTGCGGTGGACG
T7Actin/F	TAATACGACTCACTATAGGGTTCGTGGGCATGGAATC TTGCGGTAT
T7Actin/R	TAATACGACTCACTATAGGGCGGACTCGTCGTACTCG TCCTTGGAGA
T7GFP/F	TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACC GG
T7GFP/R	TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG
q18S/F	TTTTATGGTGGTGTTGTTGTGG
q18S/R	CAAGGGCTTTGGGTAATGG
qActin /F	TGGTCGGTATGGGACAGAAGGA
qActin/R	TCGGTGAGCAGGACAGGGTG

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.3   dsRNA的合成

根据已扩增验证的西花蓟马Actin基因序列设计合成dsRNA引物，然后在引物的5'端加上T7启动子序列（表1）。用HiScribe^TM T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit（New England Biolabs，美国）先扩增5'端均含有T7启动子序列的DNA片段，随后以获得的DNA片段为模板，用T7转录酶进行体外转录以合成目的基因的dsRNA^[21]，用琼脂糖凝胶电泳检测dsRNA的质量、紫外分光光度计检测浓度，合成的dsRNA置于−80 ℃备用。

1.4   dsRNA稳定性的检测

为了保证dsRNA在膜饲喂和注射过程中的完整性，先将dsRNA分别置于室温12 h和24 h，然后通过凝胶电泳检测dsRNA的降解情况。

1.5   膜饲喂

首先将一块小Parafilm拉伸至很薄覆盖在直径约30 mm的饲喂装置上，Parafilm膜的厚薄程度要保证蓟马可以刺破取食液体。在第一层膜上添加饲喂液体50 µL（20%蜂蜜水∶dsRNA = 1∶1，dsRNA质量浓度为0.5 µg·µL^−1[11]），再覆盖上第二层膜以保护液体不挥发和不受污染，第二层膜上放上四季豆以吸引蓟马到膜附近取食。然后分别将100只蜕皮12 h的二龄西花蓟马若虫放置于膜饲喂装置，每隔24 h重新更换dsActin。同时对照组饲喂dsGFP。24、48 和72 h后各取20只活的西花蓟马检测dsRNA的沉默效果。试验重复3次。

1.6   显微注射

利用油压式手动微量注射仪（CellTramoil, Eppendorf）将质量浓度为0.5 µg·µL⁻¹的dsActin和dsGFP分别注射到200只蜕皮12 h的2龄西花蓟马若虫体腔。注射后24、48、72 h分别取出20只活虫检测dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12 h，取30只活虫，单头饲养于放置四季豆的饲养管中，每天观察存活情况和形态变化，共观察5 d，统计死亡率、体长和畸形率。同时，羽化后12 h在体视镜（型号DMSZ7）下测量体长。试验重复3次。

1.7   Real-time PCR检测dsRNA沉默效率

Trizol法提取西花蓟马的总RNA，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转录为cDNA。以西花蓟马18S rRNA（GenBank登录号：XM_026420069.1）作为内参基因，分别设计RT-qPCR引物（表1）。参照GoTaq® qPCR Master Mix (2X)试剂盒（Promega公司，美国）操作说明配制反应体系，每个样品设3个重复，在BIO-RAD CFX96实时定量PCR仪（Bio-Rad，美国）检测目标基因的表达量。获得的CT值利用2^−△△CT计算目的基因的相对表达水平^[11]。

1.8   数据分析

不同干扰时间dsRNA处理之间的多重比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA, Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差异显著性检验水平标准P＜0.05。

2.   结果与分析

2.1   西花蓟马Actin基因克隆验证

根据NCBI上西花蓟马的Actin序列（GenBank登录号：XM_026432071.1）设计引物，PCR扩增及测序结果表明，Actin基因完整的开放性阅读框长度为1 131 bp，编码376个氨基酸（图1-2），与已经报道的西花蓟马Actin基因序列一致。

图  1  西花蓟马Actin基因的RT-PCR产物

Figure  1.  RT-PCR products of Actin gene of F. occidentalis

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  2  西花蓟马Actin基因核酸序列和预测的氨基酸序列

Figure  2.  Nucleotide and predicted amino acid sequences of Actin genes of F. occidentalis

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   dsRNA稳定性

琼脂糖凝胶电泳检测结果表明，dsRNA放置24 h后仍然保持较好的完整性（图3）。因此膜饲喂进入蓟马体内的dsRNA是完整的。

图  3  dsRNA在饲喂过程中的稳定性

Figure  3.  Stability of dsRNA during membrane-feeding of F. occidentalis

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   膜饲喂和显微注射dsActin对西花蓟马Actin基因表达的影响

RT-qPCR检测结果表明，与对照组饲喂dsGFP相比，膜饲喂dsActin24 h、48 h和72 h后，Actin基因的相对表达量分别为对照组的97%、91%和98%，这表明通过膜饲喂dsActin对西花蓟马Actin基因表达抑制作用不显著（图4）。相反，通过显微注射将dsActin注入西花蓟马体腔，在注射后24、48和72 h，Actin基因的表达量分别为对照组的68%、56%和53%（图5），与对照组均有显著差异（P＜0.05）。

图  4  dsRNA对西花蓟马Actin相对表达量的影响

注：不同字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）。

Figure  4.  Repression of Actin by dsRNA treatment

Note：Different lowercase letters mean significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  dsRNA对西花蓟马死亡率及生长发育的影响

注：*或者不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）

Figure  5.  Effects of dsRNA on growth and mortality of F. occidentalis

Note：Asterisks or different lowercase letters mean significant difference (Tukey HSD test at P < 0.05).

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   注射dsActin对西花蓟马存活率和形态的影响

由2.3可知，显微注射质量浓度为0.5 µg·μL⁻¹的dsActin可显著抑制西花蓟马Actin基因的表达，观察发现，注射dsGFP的西花蓟马在第24-120 h后的死亡率为29%-52%，而注射dsActin基因的西花蓟马死亡率在第24-120 h达44%-98%（图5-A）；同时，注射dsActin的西花蓟马成虫翅膀或胸腹部畸形率为41%（图5-B~C），且个体体长只有注射dsGFP的对照组的90%左右（图5-D）。说明注射dsActin成功干扰了西花蓟马的Actin基因，并对其生长发育产生了影响。

3.   讨论与结论

RNA干扰是由双链RNA介导、引起目的基因mRNA序列特异性降解的基因沉默的一个过程。通过RNAi沉默靶标基因是当前研究昆虫基因功能的重要手段^[22]。饲喂法、注射法、浸泡法、直接取食转基因植物等是将外源dsRNA导入昆虫体内的常用方式^[11,22]。已有研究表明，饲喂dsRNA的干扰效率明显低于将其注射到昆虫体腔，如在棉铃虫的RNAi试验中，仅饲喂一次很难产生明显的RNAi效应，连续饲喂才与注射一次的RNAi效果相当^[23]。本研究通过比较膜饲喂和微针注射dsActin两种方式沉默西花蓟马Actin基因，结果表明，微针注射方式成功实现了对目的基因的干扰；尽管通过增加膜饲喂次数来增加摄入昆虫体内dsRNA的量，但是72 h后仍然不能有效沉默目的基因。因此，微针注射dsRNA是沉默西花蓟马目的基因的有效方式，该结果为后续西花蓟马及小型昆虫基因功能的研究提供了技术手段。

基于注射法的RNA干扰方法能减小昆虫表皮或者中肠障碍，使dsRNA快速进入体腔或者血淋巴，同时还能准确控制进入虫体的dsRNA剂量^[12]。本研究表明，显微注射方式虽然具有干扰效果好的优点，但是注射会对昆虫造成直接的物理损伤，增加昆虫死亡率。因此，在注射时要选择合适的针头、注射体积、注射位置，尽量避免损伤昆虫。此外，显微注射前较常用的麻醉方法有乙醚麻醉法、二氧化碳麻醉法和冰冻麻醉法等，选择合适的麻醉方法能降低昆虫死亡率。本研究发现在蓟马麻醉过程中，二氧化碳麻醉法具有速度快、损伤小的优点。

综上所述，显微注射dsRNA是沉默蓟马目的基因的有效方式，适于开展蓟马类小型昆虫基因功能分析，筛选防控靶标基因，同时在应用过程中，还需要综合考虑各种因素，从而提高RNA干扰效果。