广叶绣球菌Sparassis latifolia，具有很高的营养保健价值，其子实体中含有大量的β-葡聚糖，在提高免疫力及造血功能、抗癌等方面具有突出的应用价值^[1-5]。绣球菌子实体主要的功能性成分是真菌活性多糖。对于绣球菌的水提多糖的分子量大小的报道不尽相同，不同材料和不同方法提取的绣球菌多糖的分子量大小差异较大^[6-7]，笔者前期研究结果表明绣球菌原料的干制方法对绣球菌多糖的提取得率以及所得多糖的分子量分布均有较大的影响^[8]。现有研究亦表明绣球菌子实体不同部位的β-葡聚糖含量不同，廉添添等^[9]通过酶法测定β-葡聚糖含量，发现绣球菌子实体的柄部的β-葡聚糖含量显著高于瓣片，但对绣球菌瓣片与基部可溶性多糖的分子量分布构成差异未见相关研究报道。因此，本研究以新鲜绣球菌子实体为材料，采用相对温和的冷冻干燥和热水提取法提取绣球菌子实体的瓣片和基部可溶性多糖，并对它们的分子量分布差异进行比较分析。

1.   材料与方法

1.1   材料与仪器、试剂

绣球菌子实体鲜品购于福建天益菌业有限公司。试剂：葡聚糖Dextran T20、T40、T70、T500、T1000、T2000(Pharmcia公司)，其余试剂均为国产分析纯、色谱纯；试验用水为超纯水。仪器：SP8800色谱泵(美国物理光谱公司)；UM 5000蒸发光检测仪(北京通微分析仪器有限公司)；TSKgel GMPxl色谱柱(日本东曹株式会社)；Centrifuge 5804 R离心机)；超纯水器Milli-Q plus(Millipore公司)。

1.2   试验方法

1.2.1   绣球菌原料处理

2016年8月24日福建省尤溪县天益菌业有限公司提供绣球菌样品一批，样品为带菌袋的未采鲜品，鲜品采收后分为绣球菌瓣片和基部2部分，分别进行干制。绣球菌鲜菇置于冷冻盘上，-35℃预冻24 h，开真空冷冻干燥机进行干燥，干燥条件:冷阱温度-60℃，搁板温度30℃，干燥时间30 h。

粉碎：获得的绣球菌干品用高速粉碎机粉碎后过60目筛，备用。

1.2.2   绣球菌多糖提取

热水提取：准确称取绣球菌样品粉末50 g，料液比1:15，100℃水浴搅拌提取2 h, 提取完成后，提取液8 000 r·min^-1离心10 min取上清，上清液减压浓缩至原体积的1/2，在浓缩液中加入4倍体积95%的乙醇醇沉过夜，8 000 r·min^-1离心20 min，取沉淀置于真空干燥箱中去除残余乙醇，即得绣球菌粗多糖。绣球菌粗多糖用蒸馏水复溶后，8 000 r·min^-1离心10 min取上清液，用蒸馏水溶解配制成质量浓度为15 mg·mL^-1的溶液备用。

脱蛋白：采用三氯乙酸法^[10]，样品质量浓度15 mg·mL^-1, 加入样品体积的1/10的40%TCA溶液，混匀后静置30 min，8 000 r·min^-1离心20 min，取上清。重复2次后，上清液加入4倍体积乙醇沉淀，再用丙酮洗涤沉淀2次，沉淀真空干燥后，得到绣球菌多糖。

1.2.3   绣球菌基部多糖的β葡聚糖酶酶解样品制备

绣球菌基部多糖用蒸馏水复溶为1 mg·mL^-1，加入多糖质量0.5%的β-葡聚糖酶(β-1, 3-1, 4葡聚糖酶)，自然pH下50℃水浴酶解3 h，酶解后向酶解液中加入4倍体积95%的乙醇醇沉过夜，8 000 r·min^-1离心20 min取沉淀置于真空干燥箱去除残余乙醇，用蒸馏水溶解定容至原体积，即得绣球菌基部多糖酶解样品。

1.2.4   绣球菌多糖样品的分子量分布测定

多糖分子量分布测定采用凝胶渗透色谱法^[11]。色谱条件：TSKgel GMPxl色谱柱(7.5 mm× 300 mm)；流动相0.05 mol·L^-1乙酸铵, 流速0.6 mL·min^-1；柱温30℃；进样量20 μL; ELSD检测器：载气为空气；载气压力4.5 bar; 漂移管温度60℃；数据分析系统为Chrommanger 5.8 GPC专用版。

标准品和待测样品的制备：称取绣球菌瓣片多糖样品和葡聚糖对照品适量, 用0.05 mol·L^-1乙酸铵溶液溶解为约4 mg·mL^-1, 作为待测溶液，绣球菌基部多糖和基部多糖酶解液由于黏度大，配制为1 mg·mL^-1作为待测溶液。

2.   结果与分析

2.1   绣球菌耳基和耳片多糖的分子量分布

试验中将未采收的鲜品绣球菌菌袋按图择选为瓣片和基部2部分分别进行干燥、提取和检测。在绣球菌基部多糖的提取过程中，基部多糖提取液性状明显不同于瓣片的提取液，呈胶质黏稠液体，处理困难，色谱检测时只能降低至1 mg·mL^-1进行检测。

图  1  绣球菌部位

Figure  1.  Schematic diagram of S.latifolia parts

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取重均分子量分别为2.0×10⁶、1.0×10⁶、5.0×10⁵、7.0×10⁴、4.0×10⁴、2.0×10⁴ Da的葡聚糖分子量对照品溶液进样测定，记录峰值保留时间(表 1)，标定色谱柱以保留时间对分子量的对数作线性回归, 得回归方程:lg(MW)=-0.4066+10.9773t_R, MW为重均分子量, t_R为保留时间(min)，相关系数为r=0.994 1。

表  1  葡聚糖分子量标准对照品保留时间及其对数值

Table  1.  Retention time and logarithmic Mw of dextran standard

项目	分子量/Da
	2.0×104	4.0×104	7.0×104	5.0×105	1.0×106	2.0×106
保留时间/min	16.26	15.817	15.057	12.830	12.613	11.323
lg(MW)	4.30	4.602	4.845	5.699	6.000	6.301

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由表 2可知绣球菌子实体瓣片多糖其总体的重均分子量为3.88×10⁵Da，在凝胶渗透色谱图上呈现2个主要色谱峰分布(图 2)。2个色谱峰的重均分子量分别为4.30×10⁵Da和1.78×10⁴Da；相对含量分别为89.94%和10.06%。瓣片多糖的2个色谱峰的多分散性系数都在1.2左右，呈现出较好的均一性。

表  2  绣球菌瓣片多糖的分子量分布

Table  2.  Polysaccharide Mw distribution in flabella of S.latifolia

组分	tR /min	Mw /Da	Mn /Da	Mz /Da	Mw/Mn	Mz/Mn	Ratio /%
总和	-	3.88×105	9.86×104	5.21×105	3.93	5.28	100
色谱峰1	13.323	4.3×105	3.5×105	5.23×105	1.23	1.49	89.94
色谱峰2	16.398	1.78×104	1.48×104	2.04×104	1.2	1.37	10.06
注:tR为峰保留时间；Mw为重均分子量；Mn为数均分子量；Mz为Z平均分子量；Mw/Mn为多分散系数；Mz/Mn为多分散指数；Ratio为相对含量。表 3同。

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表  3  绣球菌基部多糖的分子量分布

Table  3.  Polysaccharide Mw distribution in roots of S.latifolia

组分	tR /min	Mw /Da	Mn /Da	Mz /Da	Mw/Mn	Mz/Mn	Ratio /%
总和	-	1.43×106	5.66×104	3.96×106	25.28	69.97	100
色谱峰1	10.798	3.93×106	3.42×106	4.49×106	1.15	1.31	34.38
色谱峰2	12.789	4.95×105	4.07×105	5.89×105	1.22	1.45	13.26
色谱峰3	16.032	2.8×104	2.49×104	3.08×104	1.13	1.24	52.36

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图  2  绣球菌瓣片多糖的凝胶色谱

Figure  2.  Chromatogram of polysaccharides in flabellae of S.latifolia

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由表 3可知绣球菌子实体基部多糖其总体的重均分子量为1.43×10⁶Da，属于超大分子量成分，这与其溶液呈现的凝胶状性状相吻合。通过图 3可见绣球菌基部多糖由3个色谱峰构成，其中第1个色谱峰的分子量已超过标准曲线范围，软件给出的重均分子量为3.93×10⁶Da，相对含量为34.38%。另外2个色谱峰的重均分子量分别为4.95×10⁵Da和2.85×10⁴Da，相对含量分别为13.26%和52.36%。从分散性系数上看基部多糖的3个色谱峰均具有较好的均一性。

图  3  绣球菌基部多糖的凝胶色谱

Figure  3.  Chromatogram of polysaccharides in roots of S.latifolia

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通过对比可以发现，绣球菌子实体的瓣片多糖和基部多糖所呈现出的重均分子量以及分子量分布是有显著不同的。基部多糖的重均分子量显著高于瓣片多糖，这与多糖溶液呈现出的物理性状是相一致的。同时，绣球菌瓣片多糖的均一性也优于基部多糖，其主峰含量接近90%，易于进一步纯化得到均一的绣球菌多糖组分。从分子量分布上看，绣球菌瓣片多糖主要由重均分子量在43万Da左右的部分构成，而绣球菌基部多糖则主要由2.8万Da的小分子量部分和分子量大于200万Da的大分子量部分构成。绣球菌瓣片多糖和基部多糖中均包含有重均分子量为40万~50万Da的部分，且二者的分散系数相近，但含量上却有显著的不同，在瓣片多糖中该部分含量为89.94%而在基部多糖中该部分含量仅占13.26%。

2.2   绣球菌耳基多糖及其酶解液的分子量分布比较

绣球菌基部多糖经过β葡聚糖酶酶解后，图 4-A中分子量49万Da，相对含量为13.256%的色谱峰基本消失，同时第三个分子量较小色谱峰的含量也出现了明显的下降，相对含量由53.369%(图 4-A)下降至24.738%(图 4-B)，可见这2个色谱峰的成分均可全部和部分被β葡聚糖酶降解，其构成中均含有β-葡聚糖。但是，β-葡聚糖酶对绣球菌基部多糖中的分子量大于200万Da部分却没有表现出降解作用，处理之后其保留时间也没有明显变化，相对含量从34.384%(图 4-A)提高到75.262%(图 4-B)。

图  4  绣球菌基部多糖凝胶色谱图对比

注：A为原液；B为β葡聚糖酶酶解液。

Figure  4.  Chromatograms of polysaccharides in roots of S.latifolia

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3.   讨论与结论

通过高效凝胶渗透色谱对比分析绣球菌瓣片多糖和基部多糖的分子量分布，结果显示二者的重均分子量和分子量分布均有较大差异。绣球菌瓣片多糖的总体的重均分子量为3.88×10⁵Da，其主要成分为重均分子量约43万Da，而基部多糖重均分子量为1.43×10⁶Da，其主要由2.8万Da小分子量部分和分子量大于200万Da的大分子量部分构成。同时，通过对比绣球菌基部β-葡聚糖酶酶解前后的分子量分布情况，发现基部多糖中分子量大于200万Da的色谱峰无法被β-1, 3-1, 4-葡聚糖酶降解，另外2个色谱峰均可不同程度地被酶解，其中分子量为49万Da的色谱峰基本可完全酶解，而2.8万Da的色谱峰可被部分酶解。

一般认为多糖的有序结构(三股螺旋)对免疫调节活性至关重要，只有分子质量大于9万Da多糖的分子才能形成三股螺旋^[12]。Huang等^[13]在研究香菇多糖分子量与三螺旋构象关系时发现分子量在50万~150万Da的香菇多糖比分子量很小或者很大的都易于形成三螺旋链构象。绣球菌瓣片多糖和基部多糖中均包含有重均分子量为40万~50万Da的部分，且酶解试验结果表明该部主要成分为β-葡聚糖，在瓣片多糖中该部分含量为89.94%，而在基部多糖中该部分含量仅占13.26%，这种含量上的差异是否带来免疫调节活性上的差异还有待进一步研究。

分析绣球菌瓣片多糖的分子量分布发现其由分子量为43万Da和1.78万Da的一大一小两部分构成，这与洪小君^[14]的研究结果基本一致，其从冻干绣球菌多糖分离出SC1-1和SC2-2分子2个量一大一小的组分，SC1-1和SC2-2组分均为杂多聚糖，含有α-型葡聚糖和β-型葡聚糖，但以β-型葡聚糖为主。因此，推测绣球菌基部多糖中的小分子量的色谱峰构成中应包含有较多的α-葡聚糖，而中间的分子量约49万Da的色谱峰则以β-葡聚糖为主。

廉添添等^[9]通过酶法测定β葡聚糖含量时发现绣球菌子实体的柄部的β-葡聚糖含量可达菌体干重的56%。但在本研究中通过酶解分析发现绣球菌基部多糖中可被β-葡聚糖酶降解的部分含量并不高，这有可能是由于分析对象不同所致，酶法测定的是菌体总β葡聚糖含量，而本文分析的仅为可溶性部分。此外，基部多糖中分子量大于200万Da部分完全无法酶解，究竟是由于多糖组成结构不同，还是大分子葡聚糖的高级构象间的聚集作用所致，这有待进一步的分离鉴定。