0.   引言

【研究意义】烟草黑胫病(Tobacco Black Shank)是由烟草疫霉菌(Phytophthora nicotianae )引起的真菌性土传病害^[1]。其病原菌为卵菌门（Oomycota），游动孢子从茎基部侵入烟株，然后扩散至维管束，导致烟株茎基部坏死甚至烟株死亡^[2-3]。黑胫病在烟株各个生育期均能发生^[4]，一旦爆发流行，往往造成烟株大面积死亡，对烟草生产造成巨大经济损失，是严重制约烟草产业健康持续发展的严重病害^[5]。土壤微生物是土壤生态系统的重要组成部分^[6]，参与植株与土壤环境之间养分循环，能量交换。黑胫病作为土传性真菌病害，烟株感染后势必会影响烟株根际土壤微生物群落的变化。【前人研究进展】近年来，随着土壤微生物研究的不断深入，根际土壤微生物与植物病害之间关系的研究亦引起了高度重视。烟株感病后，根际微生态细菌群落的功能会受到破坏，不利于维持种群平衡，易导致土传病害的发生^[7]，同时病原菌在易感病烟田中的相对丰度较高，不同发病程度烟株根际主要环境因子差异中，土壤酶活性受到不同程度抑制，细菌群落组成发生改变，土壤微生物多样性降低^[8]。前人的研究着重于土壤理化性质、微生物数量的变化以及各种防治措施对烟草土传病害的影响^[9]，而通过调节烟田根际土壤微生态环境来抑制烟田土传病害的发生已成为研究的热点。【本研究切入点】健康与感染黑胫病烟株根际土壤细菌群落结构与多样性有待深入探讨。【拟解决的关键问题】通过Illumina MiSeq高通量测序技术分析健康烟株和感染黑胫病烟株根际土壤的细菌群落结构差异，探究黑胫病对烟株根际土壤细菌群落结构的影响，探讨根际土壤细菌对黑胫病的生态作用机理，以期为烟草黑胫病的生物防治提供理论基础。

1.   材料与方法

1.1   样品采集

2019年7月于云南省曲靖市宣威热水关营试验地进行样品采集，品种为云烟100。在烟株旺长期随机选取3株烟草黑胫病发病严重的烟株和3株健康烟株，去除烟株周围地表土壤，将烟株连根拔起，去除烟株根系主土壤，收集根须2 mm范围土壤根际土。健康烟株根际土（ZCTY）编号为H1、H2、H3；感染黑胫病烟株根际土（HJTY）编号为P1、P2、P3。去除根系及其他杂物，分装于50 mL离心管中带回实验室，置于−80 ℃中冷冻保存，待用。

1.2   样品DNA提取

参照PowerSoil^® DNA土壤基因组DNA提取试剂盒，对健康烟株和感黑胫病烟株根际土壤进行DNA的提取，用1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA的质量。用无菌水将DNA稀释至1 ng·μL⁻¹作为模板，选用特异性引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)扩增16S rRNA基因的V3~V4可变区，扩增程序为：预变性，95 ℃ 3 min；变性，95 ℃ 30 s，36个循环（退火，55 ℃ 30 s；延伸，72 ℃ 45 s）再延伸72 ℃ 10 min。扩增体系为 20 μL：4 μL 5×FastPfu 缓冲液；2 μL 2.5 mmol·L⁻¹ dNTPs；0.8 μL Forward Primer (5 μmol·L⁻¹)；0.8 μL Reverse Primer (5 μmol·L⁻¹)；0.4 μL FastPfu 聚合酶；0.2 μL BSA；10 ng DNA 模板；加 ddH₂O 至 20 μL。使用 2%琼脂糖凝胶回收 PCR 产物，利用 AxyPrep DNA Gel Extraction Kit (Axygen, USA) 试剂盒进一步纯化回收后，送上海美吉生物医药科技有限公司进行 MiSeq 测序。

1.3   下机数据的质控与分析

剔除下机数据中的标签及引物序列，进行序列拼接得到原始数据；使用Usearch 软件(Version 7.0)进行过滤、去嵌合体序列得到有效序列；利用Mothur软件(version v.1.30.1)绘制稀释度曲线，计算文库覆盖率、Chao1、ACE、Shannon、Simpson指数，对根际土壤微生物群落中的物种多样性和丰富度进行评价；利用Uparse软件在97%相似性水平上进行OTUs聚类分析；利用RDP classifier软件和SILVA数据库进行物种注释，使用Qiime软件进行主成分分析，并利用R语言进行绘图。

1.4   数据处理

采用Excel软件进行数据处理；采用SPSS 22.0数据处理系统进行统计分析，Duncan’s新复极差法进行数据的多重比较和分析。

2.   结果与分析

2.1   测序深度分析

稀释曲线（Rarefaction curve）既反映了不同测序数据量下各样品中的物种丰度，又可以表示测序深度是否覆盖了一个环境样品中的所有测序对象。由图1稀释曲线可知本次测序样品的曲线斜率逐渐变小，但最终未进入到平台期，表明随着序列数的不断增加，不会产生过多新的OTU数。说明此次测序结果能够较全面地反映根际土壤样品细菌群落与结构的真实情况。

图  1  细菌物种丰富度稀释曲线

Figure  1.  Dilution curve of bacterial species richness

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2.2   细菌的OTU丰度与Alpha多样性

由图2可见，健康烟株根际土壤样本（ZCTY）与感染黑胫病烟株根际土壤样本（HJTY）共有和特有OTU所占比例。健康烟株根际土样和感染黑胫病烟株根际土样两组土壤样本中，共有OTUs数3182个。其中，健康烟株根际土样中特有OTU有1518个，占总OTU数的24.59%；感染黑胫病烟株根际土样中特有OTU有1471个，占总OTU数的23.84%；健康烟株根际土样中特有OTU丰度高于感染黑胫病烟株根际土样3%。

图  2  细菌OTU分布venn图

Figure  2.  Venn diagram on fungi identified

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由表1可知ZCTY和HJTY的coverage值均在96%以上，说明样本序列的检测概率较高，能够较全面地反映样本土壤细菌群落的真实分布情况。在Alpha丰富度指标中ACE、Chao1数值越大说明生物丰度越高，HJTY的ACE、Chao1数值低于ZCTY数值21.29%、15.23%，表明感染黑胫病烟株的根际土壤细菌丰度低于健康烟株根际土壤。在Alpha多样性指标中Shannon数值越高，Simpson数值越低，表明样本生物多样性指数越高。ZCTY的Shannon数值高于HJTY数值3.05%，ZCTY的Simpson数值低于HJTY数值9.09%。表明健康烟株的根际土壤细菌多样性高于感染黑胫病的烟株。Alpha多样性指标表明感染黑胫病烟株根际土壤细菌丰度及多样性均低于健康烟株根际土壤。

表  1  健康与感染黑胫病烟株根际土壤微细菌多样性指数

Table  1.  Microbial diversity indices of rhizosphere soils at tobacco lots infected with black shank disease

处理 Treatment	丰富度指数 Richness index			多样性指数 Diversity index		覆盖率 Coverage/%
	ACE	Chao1		Shannon	Simpson
HJTY	3741.63	3792.47		6.36	0.0048	97.14
ZCTY	4753.59	4473.79		6.56	0.0044	96.53

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2.3   健康与感染黑胫病烟株根际土壤细菌组成分析

门水平样品菌落相对丰度堆积图（图3）表明：ZCTY中相对丰度大于1.00%的优势细菌门分类数量为9个：放线菌门(Actinobacteria，35.57%) ＞变形菌门(Proteobacteria，20.14%)＞绿弯菌门(Chloroflflexi，15.40%)＞酸杆菌门(Acidobacteria，11.72%)＞芽单胞菌门(Gemmatimonadetes，5.77%)＞粘球菌门（Myxococcota，2.65%）＞厚壁菌门(Firmicutes，2.40%)＞拟杆菌门(Bacteroidota，2.08%)＞硝化螺旋菌门(Nitrospirae，1.14%)；与HJTY优势细菌门分类组成比例存在一定差异，其中，绿弯菌门（Chloroflflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、厚壁菌门（Firmicutes）、Methylomirabilota相对丰度有所增加，分别增加了6.04%、7.79%、34.17%、117.19%。HJTY中放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、酸杆菌门（Acidobacteria）、粘球菌门（Myxococcota）、拟杆菌门（Bacteroidota）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）相对丰度分别减少0.73%、5.76%、3.50%、20.38%、59.13%、16.67%。

图  3  门水平上细菌群落结构

Figure  3.  Structure of bacterial community at phylum level

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由图4可知，健康烟株土壤样本中，相对丰度大于4%优势菌属有Nocardioides （4.99%）、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales（4.50%）；感染黑胫病烟株根际土壤样本中相对丰度大于4%优势菌属有norank_f__norank_o__Gaiellales（5.39%）、norank_f__norank_o__Vicinamibacterales（4.71%）、norank_f__Gemmatimonadaceae（4.31） ；而在健康烟株根际土壤中为优势菌属的类诺卡氏菌属（Nocardioides, 4.99%），在感染黑胫病烟株中并未检测到。在感染黑胫病烟株根际土壤中Gaiella、节杆菌属（Arthrobacter）相对丰度分别下降5.52%、23.05%，且此二种菌属皆为放线菌纲。

图  4  属水平上细菌群落结构

Figure  4.  Structure of bacterial community at genus level

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图5热图上部样本层级聚类树表明，健康烟株根际土与感染黑胫病烟株根际土壤细菌群落结构与多样性存在差异。根据热图所示：P1、H1、H2聚为一类，H3、P2、P3聚为一类。其中发病烟株根际土样P1与其余样本间差异最大，与P2、P3的差异主要集中在类诺卡氏菌属（Nocardioides）、芽单胞菌属（Gemmatimonas）、norank_f__Xanthobacteraceae、慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、天蓝色链霉菌属（Streptomyces）5个属。

图  5  属水平上细菌群落分布热图

Figure  5.  Heat map of bacterial community distribution at genus level

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在OTU水平上对健康烟株土壤样本和感染黑胫病烟株土壤样本进行PCoA 分析。结果如图6所示，PC1、PC2对样品差异的解释度分别为63.43%和17.73%，两者总计可解释全部土壤样品的71.16%，其中PC1是两处理产生差异的主要因素，从图中可以看出PC2能够将ZCTY和HJTY区分开，其中ZCTY样品主要分布在PC2的正值区域，而HJTY主要分布在负值区域，阐明ZCTY与HJTY微生物群落组成存在较大差异。

图  6  细菌OTU水平样品PCoA分析

Figure  6.  PCoA analysis on bacterial OTU levels

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3.   讨论

高通量测序技术能够揭示土壤微生物群落结构的相关信息^[10]，而土壤微生物群落组成在一定程度上反映了土壤健康状况，当土壤中病原微生物大量生长，有益微生物数量减少时，常引起作物病害的发生^[11]。土壤微生物群落变化是影响植物土传病害中最重要的因子^[12,13]，在控制植物土传病害中的重要性已经得到了研究人员的广泛认可。部分土壤微生物具有拮抗土壤病原菌的功能^[14]，对抑制病原体入侵或在根部组织间的二次传播具有重要作用。土壤细菌不仅能够快速、高效地分解与转化营养物质^[15]、影响植物对养分的获取和土壤肥力，而且细菌群落结构的差异和变化规律能反映土壤现状及变化趋势，可用来指示土壤生态功能^[16]。

测序结果表明，感染黑胫病烟株烟株根际土壤的Shannon、ACE和Chao1指数分别较健康植株降低了3.05%、21.29%、15.23%。烟株感染黑胫病后根际土壤中细菌群落的多样性及丰富度均有显著下降。在门水平上，感染黑胫病烟株与健康烟株根际土壤共同优势菌门为放线菌门、变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门，此结果与向立刚等^[17]健康与感染黑胫病烟株根际土壤与茎秆细菌群落结构与多样性，以及王秋君等^[18]通过调节土壤细菌群落结构控制辣椒疫病与土壤细菌群落结构的研究结果相一致。其中放线菌门在健康与感染黑胫病烟株根际土壤中的相对丰度无明显差异。与健康烟株根际土壤相比，感染黑胫病烟株根际土壤中变形菌门和酸杆菌门相对丰度分别下降5.76%、3.50%；变形菌门和酸杆菌门对土壤生态系统的构建具有重要作用，二者均属于化能异养细菌^[19]，以土壤中的有机物质作为碳源和能源，其相对丰度的变化通常与土壤肥力水平的变化呈正相关^[20,21]。绿弯菌门和芽单胞菌门相对丰度分别增长6.04%、7.79%，而绿弯菌门和芽单胞菌门都有很强的能力支持基本的生物过程，对于恶劣的环境的抗性较强，且绿弯菌门在酸化土壤中的相对丰度较高^[22]。拟杆菌门、硝化螺旋菌门相对丰度从大于1%下降至1%以下。结果表明，烟株感染黑胫病后根际土壤细菌群落结构发生改变，暗示在生境恶劣的情况下寡营养细菌将代替部分富营养细菌维持土壤细菌的基本生态功能^[23]。

属水平上，节杆菌属、Gaiella属在感染黑胫病土样中相对丰度均有所降低，而且此二种属均属于放线菌纲。本次研究与前人研究结果一致，但也存在差异，健康与感染黑胫病烟株根际土壤中属水平的差异还体现在类诺卡氏菌属、慢生根瘤菌属、天蓝色链霉菌属。类诺卡氏属在感染黑胫病烟株根际土壤中未检出，其在降解有机污染物在污染区域的生物修复中发挥重要作用，进一步说明烟株感染黑胫病会导致其根际土壤生态失衡，但类诺卡氏属对烟草疫霉是否存在相互作用及其作用机理有待进一步研究。

4.   结论

本研究通过高通量测序分析阐明了健康及感染黑胫病烟株根际土壤细菌群落结构及多样性的变化，为烟草黑胫病生物防治提供理论基础。此外，本研究为烟株感染黑胫病旺长期的调查分析，尚缺乏对烟株其他生育期细菌多样性的分析，有待进一步探讨。