西瓜Citrullus lanatus属于葫芦科西瓜属，是一种夏季消暑降温的常见水果。夏季多数消费者有将剩余的西瓜覆盖保鲜膜后，放在冰箱保鲜层(4℃)冷藏，隔天再取出继续食用的习惯。然而2014年一则“隔夜西瓜放倒一家三口，实验证明隔夜西瓜细菌数量以亿计算”的新闻和央视财经节目《第一时间》的真相报告均得出隔夜西瓜菌落总数超标，不能继续食用的结论。由于普通消费者缺乏基本的微生物学常识，对上述新闻报道难以进行理性的甄别和判断，极易使普通消费者产生隔夜西瓜存在因菌落总数超标而不能继续食用的想法。

随着大众生活水平的提高，消费者对食品安全的关注度越来越高。对于隔夜西瓜食用安全性问题，上述两则新闻报道中，虽然对隔夜西瓜菌落总数进行了检测，却未对隔夜西瓜菌落总数平板内的细菌种类和致病性强弱进行分析，同时检测时本身缺乏科学的试验设计和标准的检测方法，所取得的检测结果很难对隔夜西瓜食用安全性做出客观和准确判断^[1-2]。因此，本研究采用国标GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》方法^[3]，对福州市市售3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数进行分析，从而揭示隔夜冷藏后西瓜切面菌落总数的变化趋势，明确隔夜冷藏后西瓜切面菌落总数是否存在超标情况；同时采用基于细菌16S rRNA基因序列分析方法^[4-5]，对3种不同品种西瓜切面菌落总数平板内不同形态细菌进行测序及同源性分析，初步明确西瓜切面菌落总数平板内不同形态细菌的种类和致病性强弱。研究结果将为有效应对隔夜西瓜的网络舆情，引导消费者理性评判隔夜西瓜的食用安全提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

1.1.1   样品来源

3种不同品种西瓜样品，包括麒麟瓜、黑美人、黑富士。分别于2017年8~9月采集自福州市大型超市和农贸市场。

1.1.2   试剂及仪器

平板计数琼脂培养基(PCA)(北京陆桥技术有限责任公司)，DL2000 Marker、dNTP、Ex Taq DNA polymerase(Takara公司)，琼脂糖(西班牙Biowest)，琼脂糖凝胶回收试剂盒(上海生工)，PCR仪(BIO-RAD^TM PTC 200)，凝胶成像系统(BIO-RAD^TM Gel Doc XR+)，电泳仪及电源(北京六一仪器厂)。

1.2   试验方法

1.2.1   样品采集和处理方法

按照国标GB/T 4789.1-2016《食品卫生微生物学检验总则》中规定的方法，分别采集福州市大型超市和农贸市场中麒麟瓜、黑美人、黑富士3种西瓜样品，装入无菌自封袋中，放入带有冰块的冷藏箱运回实验室备用。

1.2.2   西瓜切面菌落总数测定

按照国标GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》中规定的方法，分别对3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处菌落总数进行分析。模拟家庭西瓜消费习惯，3种不同品种西瓜均在实验室室内环境下切开后，置于无菌超净台中对西瓜切面的菌落总数进行分析。

(1) 新鲜切面：将3种不同品种西瓜表面用生活饮用水洗净，自然晾干后，在室内环境下用无菌解剖刀切开后，置无菌超净台中在平板计数琼脂培养基(PCA)上对3种不同品种西瓜新鲜切面的菌落总数进行分析。

(2) 隔夜冷藏后切面：3种不同品种西瓜在实验室室内环境中切开，在无菌超净台中新鲜切面覆盖无菌保鲜膜后，置4℃冰箱冷藏16 h后在平板计数琼脂培养基(PCA)上进行西瓜隔夜冷藏后切面菌落总数分析。

(3) 隔夜冷藏后切面表层下2 cm处：3种不同品种西瓜4℃冰箱冷藏16 h后，在超净台中用无菌解剖刀取隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品在平板计数琼脂培养基(PCA)上进行菌落总数分析。

1.2.3   菌落总数平板内不同形态细菌菌落16S rRNA测序分析

将3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面在平板计数琼脂培养基(PCA)上进行菌落总数分析后，使用无菌牙签挑取菌落总数平板内不同形态细菌菌落，转接在5 mL LB液体中，置37℃，200 r·min^-1温控摇床纯化培养后，提取细菌菌落DNA用于扩增16S rRNA全长，进行克隆测序分析。

(1) 细菌菌落DNA模版制备：取50 μL LB纯化培养的细菌菌落菌液于1.5 mL的无菌离心管中，在台式离心机上12 000 r·min^-1离心3 min后。弃上清液，菌体沉淀用100 μL 1×TE(pH 8.0)均匀悬浮，100℃加热煮沸10 min，12 000 r·min^-1离心5 min后，小心吸取上清液，备用。

(2) 细菌菌落16S rRNA全长的扩增：使用细菌16S rRNA全长通用引物27f (5′-AGA GTT GAT CCT GGC TCA G-3′)和1492R (5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)^[6]从细菌菌落DNA中扩增16S rRNA全长基因片段。PCR反应体系总体积50 μL，各反应组分终浓度为：5.0 μL 10×buffer(Mg²⁺ free)，1.5 mmol·L^-1 MgCl₂，0.2 mmol·L^-1 dNTP，0.8 μmol·L^-1上下游引物，20 ng模板DNA，2.0 U Ex-Taq酶(Takara公司)，不足部分由无菌超纯水补足。在PTC-200型PCR仪上(Bio-Rad公司)按以下循环条件扩增：94℃，3 min；94℃，30 s，55℃，30 s，72℃，2 min，30个循环；72℃，10 min。反应结束后，取5.0 μL PCR产物于1%琼脂糖凝胶上，5 V·cm^-1电压电泳30 min后分析拍照，其余置4℃保存备用。

(3) 细菌菌落16S rRNA全长片段的回收及克隆：使用琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化16S rRNA全长片段，连接到PMD-18T载体(Takara公司)，转化E.coli JM109感受态细胞，在含有X-gal(20 μg·mL^-1)、IPTG(24 μg·mL^-1)和氨苄青霉素(50 μg·mL^-1)的LB培养基上挑取白色的菌落。采用通用M13上下游引物进行菌落PCR，PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测为阳性克隆后，送上海生工生物公司进行双向测序后拼接。

1.3   数据处理与分析

3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处细菌菌落总数计数结果，采用统计分析软件SPSS 15.0进行单因素方差分析(ANOVA)，显著性水平设为α=0.05。测序获得的细菌菌落16S rRNA全长序列与Blast比对(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)，获得与每条序列相似性最高的序列。使用CLUSTALX 1.81工具进行多序列排列比对，应用MEGA 4.0^[7]软件的邻位相接法建立系统进化树，进化树的支持率是进行1 000次重复运算得到的结果。

2.   结果与分析

2.1   西瓜切面菌落总数检测结果

西瓜切面菌落总数检测结果(图 1)可知，3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数出现了一定的差异变化。麒麟瓜新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数在13.33~16.67 CFU·g^-1，黑美人新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数在16.70~23.33 CFU·g^-1，黑富士新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数在122.67~143.33 CFU·g^-1。同一品种西瓜在新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数均无显著性差异(P＞0.05)。

图  1  3种不同品种西瓜切面菌落总数变化趋势

注：①CK为新鲜切面，A为隔夜冷藏后切面，B为隔夜冷藏后切面表层下2 cm处；②同一品种西瓜数据上的相同字母表示在0.05水平上差异不显著(P < 0.05)。

Figure  1.  Plate counts of 3 watermelon cultivars

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2.2   不同形态细菌菌落16S rRNA全长PCR扩增结果

3种不同品种西瓜切面在平板计数琼脂培养基(PCA)上进行菌落总数分析后，使用无菌牙签随机挑取菌落总数平板内50个不同形态细菌菌落，纯化培养后提取细菌DNA。使用细菌16S rRNA全长引物27f/1492r进行PCR扩增，结果见图 2。从图 2可知，不同形态细菌菌落16S rRNA全长PCR扩增片段大小介于1 000~2 000 bp，片段大小无明显差异，约为1 500 bp。

图  2  细菌菌落16S rRNA全长PCR扩增结果

注：M为DL2000 DNA Marker；1~8为细菌菌落16S rRNA全长PCR扩增结果；9为阴性对照。

Figure  2.  PCR-amplified full-length 16S rRNA gene of bacteria

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2.3   不同形态细菌菌落16S rRNA序列同源性分析

细菌菌落16S rRNA全长片段经1%琼脂糖凝胶电泳分离、切胶回收，共得到50个16S rRNA全长条带，编号B1~B50，将上述条带进行克隆测序，所得序列大小在1 471 ~1 513 bp，序列结果在GenBank数据库中进行BLAST比对。结果显示，所有序列与数据库中的16S rRNA序列的相似性在98%~99%，获得的50条相似性序列与数据库中的参考序列构建系统进化树(图 3)，结果表明50条序列在属水平上归属于5个细菌类群：葡萄球菌属Staphylococcus、芽孢杆菌属Bacillus归属于肠杆菌科Enterobacteriaceae的肠杆菌属Enterobacter、埃希氏菌属Escherichia和欧文氏菌属Erwinia。其中肠杆菌属Enterobacter 25条序列中有15条与霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei相似，10条与阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae相似；埃希氏菌属Escherichia 8条序列中6条与赫氏埃希氏菌Escherichia hermannii相似，2条与一种埃希氏菌Escherichia sp.相似；欧文氏菌属Erwinia 2条序列与1种欧文氏菌Erwinia sp.相似；葡萄球菌属Staphylococcus 10条序列中7条与松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciur相似，3条与1种葡萄球菌Staphylococcus sp.相似；芽孢杆菌属Bacillus 5条序列中3条与巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium相似，2条与阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai相似。

图  3  基于细菌菌落16S rRNA全长基因的系统发育树

Figure  3.  Phylogenetic tree based on full-length 16S rRNA gene sequences of bacteria

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3.   讨论与结论

西瓜是夏季流行的防暑降温的水果，夏季大多数消费者都会选购食用。2014年两则“隔夜西瓜不能继续食用”的新闻，引发了大量消费者对隔夜西瓜食用安全性问题的担忧。本研究采用国标GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》方法，对福州市市售3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm样品的菌落总数进行分析，结果显示3种不同品种西瓜的菌落总数在13.33~143.33 CFU·g^-1，其菌落数甚至低于国标GB 4789.2-2016《食品微生物学检验菌落总数测定》中菌落数在30~300 CFU·g^-1的要求。单因素方差分析结果也显示同一品种西瓜在新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm处样品的菌落总数上均无显著性差异。表明低温冷藏能明显延缓或者抑制西瓜切面细菌的生长，隔夜西瓜不存在菌落总数超标导致的食用安全性问题。而通过对菌落总数平板内不同形态细菌菌落的16S rRNA全长基因的测序分析，结果发现上述不同形态细菌菌落主要来自于葡萄球菌属Staphylococcus、芽孢杆菌属Bacillus、肠杆菌属Enterobacter、埃希氏菌属Escherichia和欧文氏菌属Erwinia 5个属，包括松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciur、巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium、阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai、霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae、赫氏埃希氏菌Escherichia hermannii等种类，其中巨大芽胞杆菌Bacillus megaterium、阿耶波多氏芽孢杆菌Bacillus aryabhattai^[8]和同属肠杆菌科Enterobacteriaceae的霍氏肠杆菌Enterobacter hormaechei^[9]、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae^[10]、赫氏埃希氏菌Escherichia hermannii^[11]以及欧文氏菌Erwinia sp.^[5]均是土壤中的常见细菌类型^[12]，且上述肠杆菌科细菌均为致病性较弱的菌株，来源估计与西瓜栽培的土壤含有上述细菌有关。而松鼠葡萄球菌Staphylococcus sciur为葡萄球菌属Staphylococcus中致病性较弱的菌株，多来源于空气和水环境中^[13]。

综上所述，本研究对福州市3种不同品种西瓜的新鲜切面、隔夜冷藏后切面和隔夜冷藏后切面表层下2 cm样品的菌落总数分析结果表明，隔夜冷藏的西瓜不存在上述新闻报道中细菌大量繁殖、数量以亿为单位计算的情况，而且通过基于细菌16S rRNA基因序列分析方法，进一步明确了西瓜切面表层污染的细菌多来自于空气和土壤环境中，且为致病性较弱的菌株类型。因此，鲜切西瓜在隔夜冷藏后不存在因细菌大量增殖导致的食用安全性问题。