Cardiogenol C(C₁₃H₁₆N₄O₂，CAS号：671225-39-1) 是一种二胺嘧啶类化合物，其化学名为Ethanol 2-{[2-[(4-methoxyphenyl)amino]-4-pyrimidinyl]amino}^[1]。Cardiogenol C在嘧啶环C₂的位置上有一个p-甲氧基苯胺的取代，它的结构类似物有Cardiogenol A、Cardiogenol B和Cardiogenol D。Cardiogenol A-D最早是由Xu等^[2]从100 000种杂环化合物中筛选得到的，能够特异性诱导鼠胚胎干细胞向心肌细胞分化的小分子药物，其中以Cardiogenol C的效果最佳，其诱导小鼠胚胎干细胞向心肌细胞转化的EC₅₀为0.1 μmol·L^-1，远高于传统的EB病毒(一种疱疹病毒)诱导的效率，且毒性较低，仅在浓度高达到25 μmol·L^-1以上才显现出明显的细胞毒性。Cardiogenol C主要来源是通过化学合成，未见在芽胞杆菌等微生物中发现Cardiogenol C的研究报道。

芽胞杆菌是最重要的生产应用工程菌之一，在食品、农林业、工业、生物技术、医学、冶金、环保、军事等领域具有广泛应用^[3]。芽胞杆菌代谢产物丰富，如与抗菌活性相关的抗菌肽，大环内酯类, 酚类物质, 多烯类物质等，与杀虫活性相关的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白等，是优良的功能性药物筛选的出发菌株^[4]。本研究试图通过高通量筛选，发现产Cardiogenol C的芽胞杆菌。

本研究以51株芽胞杆菌为筛选对象，菌株包括了解硫胺素硫胺素芽胞杆菌FJAT-14856 Aneurinibacillus aneurinilyticus、奇异虚构芽胞杆菌FJAT-10042 Fictibacillus barbaricus、酸快生芽胞杆菌FJAT-14221 Bacillus acidiceler、嗜碱芽胞杆菌FJAT-10014 Bacillus alcalophilus、食丁酸芽胞杆菌FJAT-14236 Bacillus butanolivorans、强壮芽胞杆菌FJAT-10033 Bacillus fortis、凝结芽胞杆菌FJAT-520 Bacillus coagulaus、解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934 Bacillus amyloliquefaciens等，利用LC-MS技术高通量筛选产Cardiogenol C芽胞杆菌，并对其结构和含量进行分析检测，以期能推进Cardiogenol C研究和应用。

1.   材料与方法

1.1   材料

供试菌株:芽胞杆菌菌株51株由福建省农业科学院农业生物资源研究所提供(表 1)。菌株种子培养基:淀粉1.0%, 牛肉膏0.5%, 蛋白胨0.3%, 蔗糖1.0%, 酵母粉0.5%, CaCl₂ 0.5%, pH 7.0。菌株发酵培养基: TSB。

表  1  供试芽胞杆菌菌株

Table  1.  Bacillus-like strains for testing

下载: 导出CSV 

| 显示表格

试验仪器:液相四级杆飞行时间质谱联用仪Agilent 1260/6520(美国安捷伦科技公司); 电子天平Mettler Toledo AL104(瑞士梅特勒·托利多仪器有限公司); 恒温培养震荡器智城ZHWY-2102C(上海智城分析仪器有限公司); pH计Sartorius PB-10(德国赛托利斯公司)。

试验试剂: TSB培养基(美国BD公司), 色谱纯乙腈(美国JT Baker公司), 色谱纯乙酸铵(CNW, 上海安谱科学仪器有限公司)。

1.2   方法

发酵液制备:用LB培养基平板将芽胞杆菌菌株划线活化培养24 h。取活化菌株接入20 mL LB种子培养基中, 37℃、200 r·min^-1振荡培养12 h, 成为种子液。取种子液1%接种量接入预先装入50 mL的TSB液体培养基中, 37℃、200 r·min^-1振荡培养48 h。将发酵液密封, 置于4℃冰箱中备用。样品制备方法:取50 mL芽胞杆菌发酵液, 离心取上清液, 过0.25 μm微孔滤膜后, 加入GC小瓶。置于4℃冰箱保存, 等待进样。

色谱质谱条件:色谱柱为Agilent ZORBAX Extend C₁₈ (2.1 mm× 50 mm, 1.8 Micron); 柱温: 35℃; 进样量: 2 μL; 流动相: A=10 mmol·L^-1乙酸铵+水, B=乙腈; 流速: 0.2 mL·min^-1; 梯度洗脱程序: B=90%(0~3 min); B=50%(3~25 min); B=90%(25~35 min); MS运行条件:负离子模式; 干燥气温度: 300℃, 干燥气流速: 5 L·min^-1; 雾化器压力: 30 psig; 毛细管电压: 3 500 V; 裂解电压: 175 V; Skimmer: 65.0 V; 质量范围: 150~1 000 m·z^-1。

2.   结果与分析

2.1   产Cardiogenol C芽胞杆菌的筛选

利用LC-MS的技术高通量的对51株芽胞杆菌的发酵液组分进行鉴定，筛选到1株解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934产Cardiogenol C，含量为1.02%，保留时间为3.651 7 min，精确分子量为260.127 9。

2.2   芽胞杆菌源的Cardiogenol C分析

筛选得到的解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中Cardiogenol C离子提取色谱图(图 1)，Cardiogenol C的保留时间为3.651 7 min，离子响应度为0.7×10⁵。

图 2为筛选得到的解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中Cardiogenol C的质谱特征，本试验采用负离子模式电离, 负离子模式下产生的不同的分子离子, 如[M-H]^-、[M+X]^-(X为所有溶剂或缓冲剂阴离子)等，在m·z^-1为259.120 7的位置处可观察到明显的主峰，此为Cardiogenol C的特征峰。

图  1  解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934 Cardiogenol C离子提取色谱

Figure  1.  Extracted ion chromatogram of cardiogenol C in Bacillus amylolique faciens FJAT-17934

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  2  解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中Cardiogenol C扫描质谱

Figure  2.  Scan spectrum of cardiogenol C in Bacillus amylolique faciens FJAT-17934

下载: 全尺寸图片 幻灯片

提取解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中Cardiogenol C的分子特征谱图如图 3所示，主峰的[M-H]^-为259.120 7，同位素峰的[M-H]^-为260.123 1、261.122 3。这与ChemDraw测定的Cardiogenol C同位素特征一致(主峰[M-H]^-为259.120 0，同位素峰的[M-H]^-为260.123 4)，分子式为C₁₃H₁₆N₄O₂，质量数为260.127 9，其分子结构见图 3的右上角所示。

图  3  解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中Cardiogenol C分子特征提取

Figure  3.  Molecular feature extraction spectrum of cardiogenol C in Bacillus amylolique faciens FJAT-17934

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论与结论

本研究采用LC-MS技术首次发现了解淀粉芽胞杆菌来源的Cardiogenol C，在分析样本中的含量为1.02%，匹配度92.08%，质子化分子离子[M-H]^-质荷比为259.120 7，分子式为C₁₃H₁₆N₄O₂，分子量为260.127 9。

Cardiogenol C为二胺嘧啶类化合物，能特异性地诱导胚胎干细胞向心肌细胞的分化，与传统的EB诱导相比，诱导效率是其10倍以上，且毒性较低，仅在浓度达到25 μmol·L^-1以上才显现出明显的细胞毒性^[2]。Mike等发现Cardiogenol C不仅能诱导胚胎干细胞向心肌细胞的分化，而且对谱系定向的祖细胞具有一定的可塑性。若先用Cardiogenol C处理成体细胞或谱系定向祖细胞有利于细胞移植治疗^[5]。Yau等^[6]发现Cardiogenol C还能诱导老鼠触须毛发膨胀区域的CD34⁺/K15⁺毛发膨胀祖细胞分化为心肌细胞。因此，Cardiogenol C^[7]在治疗心脏疾病，特别是配合干细胞植入治疗终末期心脏病具有重要的意义。但目前Cardiogenol C还是以有机合成为主，产量有限，制约着产品的应用。微生物发酵是药物高效生产的一种方式，挖掘Cardiogenol C的产生菌对提高Cardiogenol C的产量，扩大Cardiogenol C的应用具有重要的意义。

解淀粉芽胞杆菌是一种与枯草芽胞杆菌亲缘性很高的芽胞杆菌属的细菌，能产生多种抑制真菌和细菌活性的代谢物，如抑菌蛋白，脂肽类抗生素，大环内酯、聚酮化合物等小分子代谢物^[8]。Aunpad等^[9]发现解淀粉芽胞杆菌产生的活性肽对金黄色葡萄球菌具有抑制效果。吕利群等^[10]研究解淀粉芽胞杆菌能抑制淡水鱼水霉病的水霉菌，动物安全性实验也表明解淀粉芽胞杆菌对草鱼的生长没有任何不良影响。Halimi等^[11]发现解淀粉芽胞杆菌产生的细菌素amylolysin能降低真空包装中低温冷藏食物中的单核细胞增生李斯特菌的活菌数。李超等^[12]分离的解淀粉芽胞杆菌能有效地去除鱼腥草。谭文捷等^[13]的研究发现解淀粉芽胞杆菌对水中丁草胺的降解效果良好。在生物安全性方面，曹海鹏等^[14]研究了在水产养殖领域应用的解淀粉芽胞杆菌胶囊实际无毒，对环境的影响也控制在水产养殖动物的安全浓度范围内。沈勇涛等^[15]对妊娠及产后哺乳期母猪饲喂解淀粉芽胞杆菌能显著提高仔猪生长性能，增加短链脂肪酸的产生。Mallo等^[16]将解淀粉芽胞杆菌CECT5940制剂添加到肉鸡饲料中可降低产气荚膜梭菌、大肠杆菌、鼠杆菌等致病菌的数量，增加饲料中粗蛋白、粗脂肪及淀粉的消化率。解淀粉芽胞杆菌这些功能与Cardiogenol C的作用是否存在着相互关系，将有待于进一步的研究。

本研究首次在解淀粉芽胞杆菌FJAT-17934中发现Cardiogenol C，其理化特性、产生条件、生理功能等研究将另文报道。解淀粉芽胞杆菌Cardiogenol C的发现为微生物源的Cardiogenol C的研发与应用奠定了理论基础。