磷素作为植物核酸和细胞膜磷脂层的重要组成元素，在维持生物体内新陈代谢、参与动植物体组织修复、调节酸碱平衡方面发挥重要作用，是动植物体赖以生存的重要矿物元素。众多研究表明：自然环境的有效磷含量是限制植物生长的重要因子^[1-4]。因此，如何揭示磷素在地球生态系统形态、转换与迁移，提高环境磷素的有效性，满足植物对环境磷素的利用具有重要意义。由于传统的环境磷研究主要是利用消煮方法，在消煮过程中要破坏磷素形态，难以真正了解磷素的化学结构和形态，极大地限制了对环境磷素的全面了解^[5-7]。

近年来，核磁共振(NMR)作为一个新兴的诊断技术，突破了物理学的瓶颈，在化学、医学、生物、地质、食品检测以及材料学等领域的研究中发挥着举足轻重的作用，成为研究环境化合物形态结构的有力工具。NMR技术是基于原子核自旋产生磁矩，利用所产生核磁共振信号对物质进行检测的一种手段^[8-9]。与传统技术相比，NMR技术的应用具有明显优势^[10]，一方面，可在不破坏样品内部结构情况下进行无损检测，样品处理方法简便，可解析不同物资的具体形态结构，另一方面，测试结果具有高的分辨率和灵敏度。³¹P的自然丰度为100，利用³¹P-NMR对环境领域中的磷素形态进行实时检测，可直观了解环境中磷素的形态、转化和迁移规律，突破了传统环境磷素研究的瓶颈，拓展了环境磷素迁移研究的新途径，能更深入地揭示环境磷素变化的内在机制。因此，近年来，NMR技术在环境科学领域得到广泛的应用，国内外在这方面进行大量的研究，取得了一些研究成果。

本文在综合国内外研究资料基础上，从NMR技术在环境水体、土壤和植物研究的应用方面，综述了NMR技术在环境科学研究中的应用进展，分析NMR技术在磷素形态及其迁移转化等研究中的优势，指出NMR技术在环境领域研究中的存在问题，并提出今后研究的发展方向，为深入揭示环境的磷素变化机制提供科学依据。

1.   NMR技术

1946年哈佛大学的Purcell和斯坦福大学的Bloch各自独立观测到核磁共振现象后，1950年虞福春和Proctor发现了化学结构和核磁共振间相关关系，并逐渐发展成为化学家们鉴定化合物结构的工具^[11]。

根据待检测样品的形态，可以把核磁共振磷谱分为固相核磁共振磷谱和液相核磁共振磷谱。固相核磁共振磷谱样品处理十分简便，只需要进行干燥和磨碎即可上机进行检测，但固相核磁共振磷谱谱图中谱线过宽，不容易进行图谱解析分辨各种形态的磷化合物。液相核磁共振磷谱待检测样品需要呈液态，需要进行复杂的样品前处理，以除去样品中高含量的有机磷和无机磷避免造成信号干扰，生成清晰简单的谱图^[12]。因此，液相核磁共振磷谱能鉴定出样品中的正磷酸盐、无机焦磷酸盐、单酯类、磷脂类化合物。

在液相核磁共振磷谱研究中，含磷化合物化学位移一般在25~-25 ppm(图 1)，其中，包括含C-P的磷酸盐，化学位移在7~20 ppm；正磷酸盐，化学位移在5~7 ppm；磷酸单酯，化学位移在3~6 ppm；磷酸二酯，化学位移在2.5~-1 ppm；焦磷酸盐，化学位移在-3~-5 ppm；多聚磷酸盐，化学位移则在-5~-20 ppm^[13]。

图  1  液相核磁共振磷谱不同含磷化学物图谱

Figure  1.  Liquid 31P-NMR spectra of phosphorus-containing chemical profiles

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2.   NMR技术在水环境中磷形态研究的应用

2.1   水环境中磷源的分析

磷是水生生态系统中生物生存的基本要素，水中磷素过高或过低均可导致严重的生态问题，特别是水体富营养化现象^[14-15]。水体中的磷由无机磷和有机磷组成，有机磷对水生生态系统的磷循环具有重要的作用，某些有机磷可以通过水生生物的活化作用转化为活性磷，提高利用能力^[16]。因此如何通过对水体中磷素的形态分析，寻找磷活性最高的磷素形态，探讨磷素形态与分布状况对水体环境的影响显得极为重要。但传统的水体磷素分析方法在进行磷素形态与分布分析时存在测定瓶颈，而³¹P-NMR技术作为可分析水环境中磷素不同组分的有效手段，以其高灵敏度、高精度的优点在水环境磷素形态和迁移转化规律研究中被广泛应用，为磷素在沉积物-水体系统中的转化研究提供了有效手段。有机磷作为沉积物磷的重要组成部分，占湖泊沉积物总磷的10%~70%^[17]，沉积物磷作为水体富营养及有机污染的源头^[18]，其释放是造成湖泊水体发生富营养化的重要因素^[19]。伴随湖泊微生物氧化还原反应，沉积物磷可通过吸附-释放的再循环方式改变湖泊的营养富集程度^[20-21]。张文强等^[22]通过对巢湖沉积物的液相核磁共振分析发现：巢湖表层沉积物主要包含6种磷形态，其中磷酸单酯为主要成分，且东、西部湖区沉积物磷含量存在明显差异。Ahlgren等^[23]利用NMR技术分析瑞典Hrken湖底泥中磷的形态后发现各种磷化合物均随深度增加而递减。白秀玲等^[24]研究发现太湖沉积物中的焦磷酸盐会迅速转化为正磷酸盐并释放，而磷酸单酯和二酯则长期稳定存在。

藻类和水生植物死亡分解后产物也是湖泊内源磷素的重要来源。冯伟莹等^[25]利用液相核磁共振分析方法对湖泊水生植物和藻类进行研究发现：水生植物和藻类中磷均由正磷酸盐、单酯磷、二酯磷及焦磷酸盐组成，其中有机磷分别占总磷的34.21%~53.36%和31.27%~72.96%，单酯磷是水生植物和藻类有机磷的主要组成部分，其平均含量占有机磷的92%和83%；藻类体内的焦磷酸盐是水生植物的35倍。大量研究表明：利用NMR技术优化提取方法和磷谱测试参数，分析水生植物和藻类体内磷素形态结构，有望为水环境中磷循环及其机理研究提供重要技术支撑。

2.2   水环境磷污染修复研究中的应用

富磷污水的处理及水体富营养化修复是目前热门的生态环境修复课题^[14]。BAI X L等^[26]利用核磁共振技术研究太湖水体溶解态和颗粒态磷的形态、比例及其空间分布，发现污染源对溶解态正磷酸盐具有显著影响，其他形态的磷素与生物转化过程密切相关。由于生物除磷具有易于回收利用的优势，得到了广泛重视，水生生物及微生物在其生命周期内的磷素循环过程对于水体中磷素成分及含量存在显著影响^[20-21]。张志超等^[27]利用NMR技术测定3种污泥：具备除磷能力污泥工艺(A/A/O)和(A/A/O-MBR)、不具备除磷能力普通活性污泥工艺(CAS)，发现生物除磷污泥的胞外多聚物(EPS)中磷的形态有磷酸盐、磷单脂、DNA磷、聚磷末端、焦磷酸盐和聚磷等6种。具有除磷能力的A/A/O和A/A/O-MBR污泥EPS中主要含聚磷，证明EPS含磷不仅是依靠吸附磷酸盐或生物聚磷过程磷酸盐的滞留，而且EPS本身可能也参与了生物聚磷过程，从而造成了EPS污泥中聚磷的积累。Lemos等^[28]应用¹³C和³¹P技术研究了在生物除磷过程中活性污泥对[3-13c]-丙酸的代谢，探讨了在微生物法富集磷的过程中碳代谢与磷代谢的关系，为进一步优化污水处理系统提供了技术参考。羟基亚乙基二磷酸是一种常用的水处理剂之一，杜成堂等^[29]通过NMR技术对羟基亚乙基二磷酸合成反应过程进行实时监测，并在此基础上优化了反应条件，对原料三氯化磷中的杂质进行合理分析和排除，最终在优化工艺的同时提高产品质量。

3.   NMR技术在土壤环境中磷形态研究的应用

3.1   土壤磷形态的分析

对土壤有机磷结构划分的传统测定方法多是利用有机磷在不同化学浸提剂中的溶解度差异来进行分级，这种分级办法过于简单，使得人们对有机磷的认知程度与有机磷在环境磷循环中的重要性不匹配。而利用核磁共振技术进行研究可得到多种磷化合物，包括正磷酸盐、正磷酸单酯、正磷酸二酯和焦磷酸盐等，是一种有效的揭示土壤磷形态的方法，有广泛的应用前景。

Makarov等^[30]采用核磁共振技术测定土壤浸提液中有机磷形态，发现土壤中有机磷的主要形态是单酯态磷，占有机磷总量的64%~88%。Amelung等^[31]采用核磁共振技术进行俄国草原地带性土壤中有机磷的形态研究，发现地带性草原土壤的有机磷构成相对于单酯和二酯磷的比例不同，二酯磷的积累主要发生在黏土层。国内学者在利用核磁共振技术进行土壤磷素形态研究方面有不少报道。李洁等^[32]利用SMT分级方法和液相核磁共振技术，研究发现湿地土壤有机质含量直接影响有机磷的含量；在土壤磷的6类化合物中，以正磷酸盐为主，其中有机磷主要组分为磷酸单酯。张广娜等^[33]通过核磁共振技术对东北3种类型土壤-棕壤、黑土和褐土中磷组成分测定发现：棕壤和黑土中正磷酸盐和磷酸单酯各自约占土壤全磷的50%，且其中焦磷酸盐含量较高；褐土中磷主要成分为正磷酸盐，磷酸单酯约占全磷的18%，并未检测出焦磷酸盐；3种土壤中均检测出了植酸盐，但植酸盐种类各不相同。可见，通过对核磁共振技术不断改进，能更深入地揭示土壤有机磷的含量和形态结构，增加对土壤有机磷的认识，为探究土壤磷素综合转运及循环利用过程提供科学依据。

3.2   土壤磷形态转化与迁移的分析

我国南方土壤中普遍存在缺磷现象，严重制约了农林业的产量。而施肥又容易引起土壤磷素过多，导致水体富营养化等一系列生态问题。因此如何在改善土壤缺磷状况的同时，确保土壤环境磷的生态平衡，是目前农林业研究的重点。有机肥料本身也是一种磷素污染源，科学制定施肥配方有利于提高土壤资源养分利用率。因此，利用核磁共振技术分析不同有机肥及不同施用方式土壤磷素形态变化，可为合理控制磷污染提供技术支撑。马瑞等^[34]利用核磁共振技术研究不同有机肥和不同施用方式对土壤磷的影响，发现施入不同肥料后土壤磷含量显著增加，而且丰富了土壤有机磷形态；施用污泥增加土壤磷酸酶的活性，增加了土壤磷的有效性。彭喜玲等^[35]利用核磁共振技术研究污泥施入3种土壤后磷的形态变化，磷形态的变化主要集中在施用后的14 d内，随后基本稳定；污泥施加到土壤中后有机磷很快转化为无机磷，更利于植物的吸收利用，但也易在土壤中发生迁移，对水体富营养化的潜在危害加大。邢璐等^[36]采用NaOH-EDTA浸提与核磁共振技术分析比较了鸡粪、牛粪中磷含量对土壤磷形态转化及有效性的影响，发现粪肥磷主要以无机态形式存在，2种粪肥的有机磷形态及含量有明显不同，肌醇六磷酸在鸡粪中的含量明显高于牛粪。粪肥施加到潮土后丰富了土壤有机磷的形态，随时间延长，有效磷土壤级微生物的固定，牛粪处理土壤有效磷含量逐渐降低，而鸡粪处理由于矿化所得无机磷可能先进入活性磷库，则表现出相反的趋势。鉴于核磁共振技术在测定土壤样品磷化合物方面特点，对研究有机肥施用过程中土壤环境磷素形态变化具有明显优势，可更为直观地研究不同养分输入对磷素迁移转化的影响。

4.   NMR技术在植物体内磷形态研究的应用

木素与磷脂作为植物体内天然高分子产物，其结构复杂，组成多样，传统的分析方法存在试验处理过程繁杂、测定成本高等不足。但利用核磁共振技术进行研究，不仅能定性地分析木素与磷脂结构单元，定量检测其含量，而且试验处理简单，磷谱便于辨认，使得近年来核磁共振技术在木素及磷脂的研究上取得了突破性的进展。

木素在植物体内含量丰富，不仅增加植物机械强度，而且具有抵抗微生物侵蚀的能力，是植物中仅次于纤维素的天然高分子化合物，但其结构复杂程度却是纤维素无法比拟。目前对木素的检测主要是通过对木素分子所含官能团及其结构单元间的连接完成，而定量核磁共振技术就是分析木素样品中官能团的有效方法^[37]。王少光等^[38]用定量核磁共振磷谱分析了木素的化学结构，并用热重分析法评价了分离木素的热解特性。董立斌^[39]利用核磁共振技术对3种木素结构中的各官能团进行定量分析，得到核磁共振磷谱图，确定了木素中各功能基的种类。根据木素和内标物用量计算各羟基以及羧基的含量，研究证明羟基主要有缩合酚羟基、紫丁香基酚羟基、脂肪族羟基、愈创木基和脱甲基酚羟基、对-酚羟基5种。袁同琦^[40]利用定量磷谱(³¹P)分析发现：轻度球磨提取得到的MWL组分主要来自细胞壁的胞间层，该组分结构保持相对完整，降解程度较低，且含有较多的线性半纤维素、非共轭羰基及酚羟基。刘玉等^[41]将经过衍生化后的原料木素，通过核磁共振技术测定出原料木素结构谱图，对原料木素结构中脂肪羟基、总酚羟基和羧基以及总酚羟基中各酚羟基等功能基团进行定量分析对比，对三倍体毛白杨原料木素结构进行了更为深入的研究。应用核磁共振技术研究木素结构，并确定了功能基的结构及含量，从而为木素后期的加工利用奠定基础，也为核磁共振技术在植物磷素研究领域的扩展起到重要推动作用。

磷脂是一种存在于植物组织中具有生物活性的磷脂混合物天然产物，其成分主要包括卵磷脂、脑磷脂、肌醇磷脂、磷脂酸以及丝氨酸磷脂等。由于其易氧化变性的特点，分析研究困难，无法对其进行可靠的定性定量分析。而核磁共振技术能够在不同化学环境下表现不同的化学位移，简化了分析操作，提高了研究准确性。肖朝萍等^[42]应用核磁共振技术并结合分光光度法快速对磷脂的摩尔百分比进行定性定量测定，摆脱了对标样需求，大大节约了成本和时间。崔常乐等^[43]对核磁共振内标法进行设计、优化，选取了最优测试条件，得出磷脂酰胆碱的含量。Yao等^[44]使用核磁共振技术分析萃取大豆乳液，发现核磁共振的专一性强，不同磷脂成分在³¹P-NMR谱上存在不同的化学位移。NMR技术作为一种对样品无损伤、结果准确的物质化学结构测定方法，在磷脂测定方面具有巨大的应用价值。

5.   问题与展望

随着核磁共振技术应用范围的不断拓展，核磁共振技术的¹H-NMR、¹³C-NMR应用趋于成熟，在环境水体、土壤和植物等研究领域取得了较多研究成果，特别在生态系统磷的存在形式、空间分布状况等方面研究进一步深入。但目前有关核磁共振技术应用还存在一些问题。首先，³¹P-NMR的应用研究相对较少，目前主要集中于水体、土壤磷素形态及迁移转化方面的研究，在植物木素及磷脂方面有了一定进展，但对植物生长发育过程中体内磷素的转化方面的研究十分匮乏。其次，目前有关液相核磁共振技术还未形成统一的技术流程，使用的提取剂对部分磷素具有水解作用，而且存在测试价格昂贵、扫描时间长等不足，限制了该技术的进一步应用。因而，为拓展核磁共振技术在环境磷研究的应用，今后应加强以下方面的研究：首先，要制定液相核磁共振试验流程标准，加强试验规范性，完善试验预处理技术，发现新型提取剂。其次，开发低成本、高灵敏度、高测试速度的核磁共振仪器。加强核磁共振技术在植物生理生态中研究中的应用，特别是在植物体内磷素形态转化方面的研究，更深入地探究植物发育过程中磷素形态、迁移及循环过程，更好地指导农林业生产。