肌肉生成抑制素(myostatin，MSTN)是一种负向调节骨骼肌的分泌型蛋白，决定肌肉纤维的最终数量^[1]。MSTN基因在牛^[2]、人^[3]以及鼠^{[1, 4]}中的试验表明，该基因的突变会引起肌肉异常发达。皮埃蒙特牛和比利时蓝牛的双肌现象正是MSTN突变导致的^[5]。MSTN作为肌肉生长的负调控因子，在家畜家禽中普遍存在，其活性的降低或丧失，会使得肌肉与其他组织的比例大大提高^[6-13]。家兔是节粮型草食动物，对我国畜牧业产业结构的调整起着重要的作用。家兔品种的优劣直接影响到养殖的效益，良种问题已成为家兔产业持续健康快速发展的重要因素。随着标记辅助选育的应用，对家兔肌肉生成抑制素基因的研究显得尤为重要。

福建白兔属福建省优良小型肉兔品种，具有耐粗饲、抗病力强、繁殖性能良好、肉质优异等优点，但其存在一个显著的缺点：体重小，生长速度慢，胴体瘦肉率低，影响养殖效益，严重制约其产业化发展。所以选育出既有地方优良特性，又生长速度快、胴体瘦肉率高的福建白兔，对产业的发展至关重要。目前对地方肉兔MSTN基因的研究未见报道。因此本研究以福建白兔肌肉总RNA为模板，用RT-PCR和RACE技术确定福建白兔MSTN基因全长cDNA序列，为进一步开展肉兔MSTN基因的结构、表达以及肉兔品种的繁育等相关研究提供基础数据。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

试验兔为武平县武东乡袁田村福建白兔保种场90日龄健康福建白兔。

T-Vector pMD^TM20，大肠杆菌感受态细胞JM109，TaKaRa Taq^TM酶，M-MLV RTase cDNA合成试剂盒，RACE试剂盒，均购自大连TaKaRa公司。Trizol试剂，购自Invitrogen公司。质粒提取试剂盒购自OMEGA公司。

1.2   试验方法

1.2.1   福建白兔肌肉总RNA的提取

无菌采取福建白兔肌肉组织，迅速置于液氮中，用Trizol试剂按说明书提取总RNA，并检测其纯度和完整性。

1.2.2   引物合成及测序

根据NCBI Genbank中已知的哺乳动物MSTN基因全长cDNA序列及RACE试验，使用Primer Premier 5.0软件设计引物(表 1)。

表  1  设计的引物

Table  1.  Primer sequence

名称	序列(5′-3′)	长度/(mers)
F1(已知序列)	GTTTATGCTGATCGTGGCTG	20
R1(已知序列)	CACCCACAGCGGTCTACTAC	20
F2(已知序列)	CTGTGTAATGCATGCACTTG	20
F3(3′RACE)	AGCAGGTCCTTGCTGTACTC	20
F4(3′RACE)	CCAATTACTGCTCTGGAGAC	20
F5(3′RACE)	GAGCACTCAACAGAATCACG	20
R4(5′RACE)	CTTCCAAAGAGCCATCACTG	20
R6(5′RACE)	CTGAACGTCGTACTGATC	18
YZF1(序列验证)	CTCAAGCTGTTCATGCAT	18
YZR1(序列验证)	CCAACCATTGCATGTATTC	19

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1.2.3   MSTN基因已知同源CDS序列扩增

以福建白兔肌肉cDNA为模板，用引物F1- R1，采用RT-PCR方法进行扩增。使用PrimeScript 1st Strand cDNA试剂盒合成cDNA。反应体系如下：总RNA 1 μL，Oligo dT引物(50 μmol·L^-1)1 μL，Random 6 mers(20 μmol·L^-1)1 μL，dNTP混合物(10 mmol·L^-1) 1 μL，3′RACE接头(5 μmol·L^-1)1 μL，DEPC处理水加至7.5 μL；反应条件为：56℃ 5 min，立即冰上放置2 min。PCR扩增，使用Tks Gflex DNA聚合酶进行PCR扩增。第一轮PCR反应体系：上述cDNA反应液1 μL, 2×Gflex PCR缓冲液(Mg²⁺, dNTP plus)25 μL，Tks Gflex DNA聚合酶(1.25 U·μL^-1)，F1(20 μmol·L^-1)1 μL, R1(20 μmol·L^-1)1 μL，加ddH₂O至50 μL。反应条件为：94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 15 s，68℃ 1 min，30个循环。第二轮反应体系：第一轮的PCR反应液1 μL，其他组分与第一轮一样。反应条件与第一轮相同。取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果。利用DNA胶回收试剂盒对PCR产物进行胶回收，使用引物F2、R1进行测序。

1.2.4   3′RACE

引物设计与合成见表 1中的F5、F4。按照3′-Full RACE Core Set with PrimeScript RTase试剂盒进行扩增。电泳，切胶回收，连接，转化，培养，提取质粒，用引物F3对质粒进行测序。

1.2.5   5′RACE

引物设计与合成见表 1中的R4、R6。5′RACE使用TaKaRa 5′-Full RACE Kit with TAP试剂盒进行。其他步骤同3′RACE。

1.2.6   Race序列验证

引物设计与合成见表 1中的YZF1、YZR1。PCR扩增使用Tks GflexTM DNA聚合酶进行PCR扩增。PCR反应体系：已知序列验证的cDNA反应液2 μL，2×Gflex PCR缓冲液(Mg²⁺, dNTP plus)25 μL，Tks Gflex DNA聚合酶(1.25 U·μL^-1) 1 μL, YZF1(20 μmol·L^-1)1 μL, YZR1(20 μmol·L^-1)1 μL，加ddH₂O至50 μL。反应条件为：94℃ 1 min；98℃ 10 s，55℃ 30 s，68℃ 2 min，35个循环。取5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳。

1.2.7   扩增片段的克隆、测序和序列分析

使用琼脂凝胶DNA提取试剂盒进行PCR产物的胶回收，使用DNA连接酶，将已纯化的3′和5′产物与T-Vector pMD^TM 20连接，热转化至大肠杆菌感受态细胞JM109中，培养，提取质粒测序。采用DNAStar和在线蛋白质分析软件对序列进行分析。

2.   结果与分析

2.1   总RNA

提取的总RNA经分光光度计检测的OD_{260 nm}/OD_{280 nm}值在1.8~2.0，说明总RNA无蛋白质和其他杂质污染，电泳检测结果显示有5S、18S和28S等3条清晰的条带(图 1-A)，表明总RNA完整无降解。

图  1  产物电泳

注：A为总RNA(M：DL2000 DNA Marker，1：总RNA)；B为MSTN的同源序列(M：DL2000 DNA Marker，1:PCR产物; 2:阴性对照)；C为MSTN的3′RACE(M：DL2000 DNA Marker，1:PCR产物，2:阴性对照)；D为MSTN的5′RACE(M：DL2000 DNA Marker，1：PCR产物)；E为RACE验证(M：DL2000 DNA Marker，1：阴性对照，2：PCR产物)。

Figure  1.  Products were detected by gel electrophoresis

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2.2   福建白兔MSTN基因RT-PCR扩增

以福建白兔肌肉cDNA为模板，用引物F1- R1，采用RT-PCR方法分别扩增出1条特异带，长度约为1 100 bp(图 1-B)，经测序为1 128bp。3′端未知序列为287 bp(图 1-C)；5′端未知序列为136 bp(图 1-D)；经PCR验证，得到的RACE序列是根据已知序列得到的，片段约为1 100 bp，与已知序列吻合(图 1-E)。

2.3   序列分析

福建白兔MSTN基因信息。通过对测序所得到的福建白兔MSTN基因全长cDNA序列(GenBank登录号：KX084386)进行分析发现，该基因的全长为1 551 bp，其中5′非翻译区136 bp，3′非翻译区287 bp，开放阅读框(ORF)1 128 bp，共编码375个氨基酸，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA。采用DNASTAR软件分析MSTN基因序列中的碱基含量，分别为A 33.16%、T 21.28%、G 25.53%、C 20.04%，G+C的含量(41.34%)低于A+T的含量(58.69%)(图 2)。

图  2  福建白兔MSTN cDNA序列及其预测的氨基酸序列

Figure  2.  Sequence of MSTN from Fujian white rabbit and its amino acid sequence

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通过在线SignalP 4.1软件预测MSTN蛋白在第20和21氨基酸之间存在信号肽的切割位点(D=0.492，D-cutoff=0.450)，整个蛋白包括20个氨基酸的信号肽和355个氨基酸的成熟肽(图 3)。

图  3  MSTN蛋白的信号肽预测

Figure  3.  Signal P prediction of MSTN protien

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利用NCBI数据库在线工具Conserved Domain Search Service软件分析发现，MSTN蛋白在第97~768核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β前肽超家族结构域，在第841~1 125核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β家族结构域(图 4)。

图  4  MSTN蛋白的结构域

Figure  4.  Domain of MSTN Protein

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2.4   福建白兔与其他动物MSTN核苷酸序列同源性分析与进化树构建

福建白兔与穴兔(NM_001109821.1)、人(NM_005259.2)、猪(HM241657.1)、家鼠(BC103677.1)、马(NM_001081817.1)、牛(NM_001001525.2)、绵羊(AM992883.1)、鹿(EF629535.1)、狒狒(AF019619.1)、猩猩(NM_001079919.1)、猴(NM_001080119.1)的MSTN核苷酸序列同源性分别为99.9%、92.8%、94.4%、86.9%、95.2%、89.1%、91.0%、90.3%、95.9%、96.4%、95.9%(图 5)。根据猪和人以及其他哺乳动物MSTN核苷酸序列绘制进化树，结果显示福建白兔与穴兔的同源性最高，其次为与人、狒狒、猩猩、猴的同源性(图 6)。

图  5  MSTN基因在哺乳动物核酸同源性比较

Figure  5.  Homology analysis of MSTN on mammal nucleotides

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图  6  MSTN的遗传进化树分析

Figure  6.  Phylogenetic tree analysis of MSTN

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3.   讨论与结论

随着对MSTN的作用机制及其调控机制的深入了解，MSTN基因得到遗传育种学家、医学家等的青睐，在医药界以及畜牧业具有很好的应用前景。McPherron等^[1]发现小鼠Myostatin cDNA序列编码376个氨基酸，具有TGF-β超家族的典型结构，由于与其他TGF-β家族成员的同源性很低(最高为45%)，所以另归新的一类并命名为GDF-8。猪MSTN基因的cDNA序列1 756 bp，编码375个氨基酸，猪MSTN基因核苷酸序列和氨基酸序列与人、马、黑猩猩、小鼠、狗等同源性较高，均在95%以上，最高达98%^[14]。西藏小型猪MSTN基因同样编码375个氨基酸，推导的氨基酸序列与其他物种相比同源性高，与版纳微型猪相似性高达99%^[15]。辽育白牛^[16]、天祝白牦牛^[17]、牦牛^[18]、山羊^[19]MSTN基因编码区全长为1 128 bp，共编码375个氨基酸，其蛋白与其他哺乳动物相比，同源性较高。在人、猪、马、牛和羊等哺乳动物中MSTN基因结构和编码区高度保守，绵羊和牛编码区基本相同，只有1~3个碱基的差别^[20]。MSTN基因利用RNAi技术进行干扰，在山羊的成纤维细胞^[21]和肌细胞^[22]、绵羊的胚胎^[23]、鸡胚胎成纤维细胞^[24]、转基因羊^[25]中均使得MSTN表达下调或被抑制，促进细胞分化、增殖，转基因羊体重和肌纤维直径增加加快。通过锌指核酶技术分别敲除五指山小型猪^[26]和鲁西黄牛^[27]MSTN基因的成功，说明敲减或敲除MSTN基因能够安全有效地促进家畜肌肉生长。这将成为培育高产肉量家畜品种的技术手段。同时MSTN基因的变化对人体健康也至关重要，在动物模型中已经有用抗MSTN的疗法治疗肌肉萎缩症的报道，MSTN基因对人类肌肉萎缩、老化、糖尿病及其他相关疾病甚至癌症方面也有较深入的研究^[28]。

家兔是节粮型草食动物，发展家兔养殖对我国畜牧业产业结构的调整起着重要的作用，家兔品种的优劣直接影响到养殖的效益，良种问题已成为家兔产业持续健康快速发展的重要因素。同时由于兔是研究人类疾病的动物模型，因此采用基因打靶的方法生产MSTN基因缺失兔，不但有助于在畜牧业生产上改良育种，提高胴体瘦肉率，也可以作为实验动物模型进行肌肉萎缩等相关疾病的研究。本研究利用RACE技术通过对福建白兔MSTN基因的cDNA序列进行克隆测序，结果发现该基因的全长为1 551 bp，其中5′非翻译区136 bp，3′非翻译区287 bp，1 128 bp的开放阅读框编码375个氨基酸，MSTN蛋白在第97~768核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β前肽超家族结构域，在第841~1 125核苷酸处编码的氨基酸存在1个TGF-β家族结构域。MSTN蛋白在第20和21氨基酸之间存在信号肽的切割位点，整个蛋白包括20个氨基酸的信号肽和355个氨基酸的成熟肽。与穴兔、人、猪、家鼠、马、牛、绵羊、鹿、狒狒、猩猩、猴的MSTN核苷酸序列同源性分别为99.9%、92.8%、94.4%、86.9%、95.2%、89.1%、91.0%、90.3%、95.9%、96.4%、95.9%，说明福建白兔的MSTN基因保守性较高，且与穴兔的同源性最高。

本研究初步掌握福建白兔MSTN基因的结构特点，为进一步开展家兔MSTN基因的结构、表达调控及其突变与肌肉等相关性状方面的研究奠定了理论基础。