牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus，BVDV)是一种从表现腹泻或胃肠道溃疡的发病牛分离获得重要传染病病原，与猪瘟病毒(Classical swine fever virus, CSFV)、边界病毒(Border disease virus, BDV)同属于黄病毒科瘟病毒属成员^[1]。BVDV最早于1953年美国的发病牛，随后Fernelius等^[2]证实该病毒可自然感染猪。该病毒除了可感染牛和猪外，还可感染羊、骆驼、鹿及许多野生动物^[3]。世界各地均有BVDV自然感染猪的报道^[2-6]，我国最早由王新平等于1996年从疑似猪瘟病例中检测并分离获得该病毒^[8]，目前在我国吉林、辽宁、浙江、上海以及福建等地均有猪感染BVDV的报道^{[3, 7-10]}。猪感染BVDV常不表现出临床症状或仅表现为亚临床症状，出现类似于感染温和型猪瘟的临床症状和病理变化^[11]，使得临床上难以区别BVDV与猪瘟病毒感染，另外BVDV和猪瘟病毒在免疫学上还存在着广泛的交叉性，给该病及猪瘟的诊断和有效防制带来极大困难。本研究通过建立检测猪源BVDV的荧光RT-PCR方法对福州市屠宰猪感染BVDV进行病原学检测，以期为深入开展猪源BVDV的研究奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   细胞和病毒

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)参考株Oregon C₂₄V、猪瘟兔化弱毒株(HCLV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R株、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)HB08株由福州大北农生物技术有限公司提供；牛肾传代细胞(MDBK)由天津出入境检验检疫局提供。

1.2   主要试剂和仪器

MEM营养液购自GIBCO公司；裂解液Trizol购自Invitrogen公司；AMV反转录酶、RNA酶抑制剂、dNTP Mixture、Taq DNA聚合酶、Random primer购自宝生物工程(大连)有限公司；CFX96型荧光定量PCR仪购自BioRad公司。

1.3   检测样品来源

待检的359份屠宰猪血清样品，采自福州市周边屠宰场。

1.4   引物设计合成

根据GenBank中BVDV参考毒株及其登录号：Oregon C24V(AF091605)、NADL(M31182)、ZM-95(AF526381)、New York′93(AF502399)、SD1(M96751) 等核苷酸序列，选取5′-UTR高度保守且特异核苷酸区域，设计1对用于检测BVDV特异性引物和荧光探针，上游引物：5 ′-CCA TGC CCT TAG TAG GAC TAG CA-3′，下游引物：5′-AAC CAC TGA CGA CTA CCC TGT ACT-3′，荧光探针：5′-FAM-CCA TCC AAC GAA CTC ACC ACT GTT GC -3′(TAMRA)。

病毒5′-UTR序列扩增引物：上游引物BVDVF104: 5′-CAT GCC CTT AGT AGG ACT AGC A-3′，下游引物BVDVR390：CAA CTC CAT DTG CCA TGT ACA-3′，预期扩增产物大小为297 bp，以上引物和探针均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.5   样品处理与病毒RNA提取

1.5.1   样品处理

取2 mL屠宰猪血清，加5 mL预冷的PBS匀浆混匀，经4℃ 5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液备用。

1.5.2   参考病毒悬液和毒力测定

将BVDV参考毒株Oregon C₂₄V用MDBK细胞进行常规培养，收获病毒冻融3次，5 000 r·min^-1离心10 min，取上清液即为参考病毒悬液，置-70 ℃保存备用。

将参考病毒悬液用维持液作10^-1至10^-8倍比稀释，每个滴度加入96孔细胞培养板4个孔，每孔50 μL。将生长良好单层的细胞用细胞分散液消化后，用生长液配制成3×10⁵·mL^-1的细胞悬液加到细胞板各孔内，每孔100 μL。同时每板设4孔细胞对照。置37 ℃二氧化碳培养箱中培养观察至6 d，记录细胞病变，按Reed-muench方法计算细胞半数感染量(TCID₅₀/50 μL)。

1.5.3   病毒RNA提取

取样品上清液200 μL，加入600 μL Trizol，轻混1 min，室温静止10 min；再加入200 μL氯仿，轻混1 min，室温静止10 min；于4℃ 12 000 r·min^-1离心15 min，取离心上层液，加入1倍体积的异丙醇，于4℃ 12 000 r·min^-1离心10 min，弃上清，加入600 (L 75%乙醇，于4℃ 10 000 r·min^-1离心5 min，小心顷弃乙醇，置于超净台中晾干，用20 μL RNase-Free water溶解，立即进行反转录或者-75℃冻存待用；同时设立BVDV Oregon C24V毒株为阳性对照、MDBK细胞为阴性对照各1管。

1.6   荧光RT-PCR扩增

1.6.1   荧光RT-PCR反应条件

荧光RT-PCR反应体系25 μL，在0.2 mL PCR反应管中进行(表 1)。荧光RT-PCR扩增反应程序：42℃ 30 min(反转录)；92℃ 3 min(预变性)；92℃ 10 s，45℃ 30 s，72℃ 1 min，5个循环；92℃ 10 s，60℃ 30 s(荧光收集)，35个循环。

表  1  荧光RT-PCR反应体系

Table  1.  The reaction system of Fluorescence RT-PCR

成分	用量/μL
10×RT-PCR buffer solution	2.5
MgCl2(25 mmol·L-1)	5.0
dNTP(10 mmol·L-1)	2.5
RNasin(40 U·μL-1)	0.5
AMV reverse transcriptase (5 U·μL-1)	0.5
Taq DNA polymerase(5 U·μL-1)	0.5
upstream primers(10 μmol·L-1)	0.5
downstream primers(10 μmol·L-1)	0.5
TaqMan probe(5 μmol·L-1)	0.5
RNA	5.0
RNase-Free water	7.0

下载: 导出CSV 

| 显示表格

1.6.2   敏感性试验

参考病毒悬液10倍倍比稀释，分别取稀释病毒提取总RNA，按1.6.1中的反应体系及方法在相同条件下进行荧光RT-PCR检测，判断所能扩增的最大稀释度，以测定其敏感性。

1.6.3   特异性试验

按1.5.2中方法制备HCLV毒株、PRRS毒株、TGEV毒株的RNA模板各1管，设立MDBK细胞为阴性对照，以进行特异性试验。

1.6.4   重复性试验

将BVDV参考病毒悬液单一样品在相同条件下进行5次重复检测以确定组内重复性，单一样品分别经5次提取RNA进行重复检测以确定组间重复性。

1.6.5   荧光RT-PCR的应用检测

利用建立的荧光RT-PCR方法对359份屠宰猪血清样品进行应用性检测。

1.6.6   结果判定

(1) 质控标准：阴性对照无Ct值并且无扩增曲线；且阳性对照的Ct值应≤28，并出现特定的扩增曲线，则实验成立。如阴性对照和阳性对照条件不满足以上条件，则实验无效。

(2) 结果判定：无Ct值或Ct＞35，表明血清样品提取物中无BVDV核酸，结果为阴性。Ct≤30且出现特定的扩增曲线，表示血清样品提取物中存在BVDV核酸，结果为阳性。

(3) 测序与分析：将13份BVDV阳性猪血清荧光RT-PCR扩增产物进行测序，并分析。

2.   结果与分析

2.1   荧光RT-PCR检测及鉴定结果

对BVDV参考毒株进行荧光RT-PCR检测，结果呈现典型的扩增曲线，与预期一致，而阴性对照则没有扩增曲线，见图 1。

图  1  BVDV实时荧光定量RT-PCR扩增结果

注：P为阳性对照；N为阴性对照。

Figure  1.  Real-time quantitative RT-PCR amplification of BVDV

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   荧光RT-PCR敏感性试验结果

参考病毒悬液毒力测定结果，按Reed-muench方法计算细胞半数感染量10^5.2TCID₅₀/50 μL，10倍倍比稀释病毒即10³、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹，使病毒毒力依次为1×10^2.2、1×10^1.2、1×10^0.2、1×10^-0.8、1×10^-1.8、1×10^-2.8、1×10^-3.8TCID₅₀/50 μL，分别取各稀释病毒提取的RNA进行荧光RT-PCR检测，结果表明该方法最低检出限为1×10^-2.8 TCID₅₀/50 μL，结果见图 2。

图  2  BVDV敏感性实时荧光定量RT-PCR扩增结果

注：a~e为1×10^2.2~1×10^-3.8TCID₅₀/50 μL样品扩增曲线；g为阴性对照。

Figure  2.  Susceptibility of real-time quantitative RT-PCR amplification of BVDV

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   荧光RT-PCR特异性试验结果

应用同一对引物和探针进行的荧光RT-PCR特异性检测中，BVDV参考毒株呈现典型的扩增曲线，而HCLV毒株、PRRS毒株、TGEV毒株和MDBK细胞均无扩增曲线。

2.4   荧光RT-PCR重复性试验结果

将BVDV参考病毒单一样品在相同条件下进行5次荧光RT-PCR重复检测，结果均获得相同的扩增曲线，结果表明具有良好的组内重复性；将单一样品分别经5次提取RNA进行荧光RT-PCR重复检测，获得的一致的扩增曲线，结果表明该方法具有良好的组间重复性，见图 3。

图  3  BVDV组间重复性实时荧光定量RT-PCR扩增结果

注：a~e为组间重复样品扩增曲线；f为阴性对照。

Figure  3.  Inter-group repeatability of real-time quantitative RT-PCR amplification of BVDV

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.5   荧光RT-PCR的应用检测

经所建立荧光RT-PCR检测，359份屠宰猪血清中有52份BVDV阳性，屠宰猪血样中BVDV阳性率为14.5%；表明福州市周边屠宰猪存在BVDV感染，猪源BVDV实时荧光定量RT-PCR扩增结果见图 4。

图  4  BVDV实时荧光定量RT-PCR扩增结果

注：S1、S2为阳性样品扩增曲线；P为阳性对照；N为阴性对照。

Figure  4.  Real-time quantitative RT-PCR amplification of BVDV

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.6   序列分析

13份BVDV阳性血清中病毒5′-UTR序列分析表明，所检测的阳性样品5′-UTR序列同源性在96.2%~100%，与已发布的牛源BVDV分离株1672/99-90、SLO/2416/2002、1745/00-39及BJ1308等序列同源性在95.3%~99.7%，与Oregon C24V(AF091605)、NADL(M31182) 及SD1(M96751) 等BVDV参考毒株的序列同源性在87.5%~92.8%。

BVDV5′-UTR序列遗传进化分析表明(图 5)，13份样品中的BVDV均为基因1d型毒株，其中FJ1634ND-7、FJ1670NP-3、FJ1566NP-24和FJ1611ND-231与斯诺文尼亚早期分离株1672/99-90及SLO/2416/2002^[12]等处于同一进化分支，其余9份样品与我国2012-2013年北京分离毒株BJ1201及BJ1308^[13]等处于同一进化分支，所有13份样品中的BVDV均与Oregon C24V、NADL及SD1等BVDV参考毒株差异较大，处于不同进化分支。以上扩增产物测序工作在福州博尚生物技术有限公司进行。

图  5  BVDV 5′-UTR系统进化树

Figure  5.  Phylogenetic tree of BVDV 5′-UTR fragments

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论与结论

由于牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和猪瘟病毒(CSFV)存在着广泛的抗原交叉，这给BVDV的诊断带来了难度，而荧光RT-PCR方法作为一种先进的检测方法，相比传统方法具有较大的优点^[7]。通过对福州市周边屠宰猪的359份血清样品的检测结果，表明本研究以牛病毒性腹泻病毒参考株Oregon C₂₄V建立的检测猪源BVDV的荧光RT-PCR方法具有良好的特异性和重复性，且对13份BVDV阳性样品5`端UTR片段进行序列测定分析发现，与VEDEVAC进化谱系较为密切，均为基因Ⅰ型。这些表明所建立的猪源BVDV的荧光RT-PCR方法适用于猪感染BVDV的监测。

以建立的检测猪源BVDV的荧光RT-PCR方法对359份屠宰猪血清样品检出52份BVDV阳性，BVDV感染阳性率为14.5%，略高于已有研究报道的福建省猪群血清样品BVDV感染阳性率8.1%^[4]，但低于福州市周边猪群BVDV抗体阳性率34.7%^[2]，表明福州市屠宰猪和福建省养殖猪群均存在BVDV感染。

王新平等(1996) 在国内首次报道猪感染BVDV后^[9]，福建、河南、浙江、安徽、湖南、江西、广西和辽宁等地均有猪感染BVDV报道。这种可能适应猪体的BVDV感染后会引起猪群较严重的后果^[3]，猪感染BVDV后会出现类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化；母猪感染BVDV会导致繁殖障碍、产仔数下降和流产；先天性感染的仔猪出生后可产生BVDV抗体，会形成持续性感染和免疫耐受，可长期带毒、并且可将BVDV传播给易感的母猪，由于BVDV与猪瘟病毒的交叉反应性，BVDV还可降低猪瘟疫苗的免疫效果，猪群中BVDV的感染不但增加了BVD的防控难度，还使猪瘟的防控受到干扰^[8-10]。可见，我国不同猪群存在BVDV感染，引起类似慢性猪瘟的临床症状和病理变化，并给养猪业带来经济损失，因此应引起有关部门的高度重视。