Antioxidant Activity of Polysaccharides from Loaches
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摘要: 为研究泥鳅多糖的抗氧化作用，采用生化试验检测泥鳅多糖的体外抗氧化能力。结果表明，泥鳅多糖对羟自由基、超氧阴离子和过氧化氢均具有清除能力，其中对羟自由基和过氧化氢的清除能力较强，最高分别达到73.38%和88.22%。对超氧阴离子的清除能力也达到57.99%，总抗氧化能力达到8.42 U·mL-1，表明泥鳅多糖具有较强的抗氧化能力。Abstract: Polysaccharidesin loaches were extracted by an ultrasound-assisted enzymatic method to determine the antioxidant activityusing an in vitro biochemical assay. The results showed that the polysaccharides had strong scavenging capacities toward hydroxyl radicals, superoxide anions, and hydrogen peroxide.Theremoval rate of the extract onhydroxyl radicals reached as high as 73.38%, while 88.22% on hydrogen peroxide and 57.99% onsuperoxide anions.Atotal antioxidant capacity of 8.42 units·mL-1 of the loach polysaccharides was considered high and desirable.
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Keywords:
- loach /
- polysaccharides /
- antioxidant
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泥鳅Misgurnus anguillicaudatus，又名鳅，美味营养且药食同源，在《本草纲目》、《中药大辞典》等医书中均记载着泥鳅的药用功效，素有“水中人参”之美誉[1-2]。这与泥鳅富含生物活性物质密切相关。目前，泥鳅活性物质的研究主要集中于泥鳅多糖、活性多肽、蛋白酶、透明质酸、凝集素等[3]。其中，由于泥鳅多糖具有保护肝损伤、抗疲劳、抗氧化、抗衰老、抗炎、抗肿瘤等作用[4]，而成为泥鳅活性物质的研究热点之一。钦传光等对泥鳅多糖的分子结构、活性功效等已有较为深入的研究，从泥鳅表皮黏液中提取中性黏多糖，经高效液相分离发现该多糖由一个高聚糖(MAP，19.1%)和一个寡糖(MAO，80.9%)组成[5]；通过化学发光法和分光光度法，证实泥鳅多糖能够有效地清除O2-、H2O2、·OH等活性氧，对DNA链有一定的保护作用[6]；通过模型小鼠动物试验，证实泥鳅多糖可阻断肝损伤小鼠的肝细胞损伤，具有保肝护肝功效[7]；发现泥鳅多糖可抑制白细胞游走，具有显著的抗炎效果[8]；还证明泥鳅多糖可明显降低糖尿病模型小鼠的高血糖及高血脂症[9]。目前，研究较多的泥鳅多糖来源于泥鳅的表皮黏液，在泥鳅加工过程中，会产生内脏、边骨肉、鱼头等泥鳅加工副产物，从中提取泥鳅多糖，以提高泥鳅加工附加值的研究还并不多见。因此，本研究以泥鳅加工副产物为原料，提取泥鳅多糖，探讨泥鳅多糖的抗氧化功效，以期全面开发利用泥鳅生物资源，提高泥鳅附加值。
1. 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
1.1.1 材料与试剂
泥鳅加工副产物：福建漳州龙德食品有限公司。
葡萄糖、苯酚、浓硫酸、无水乙醇均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；中性蛋白酶(5×104U·g-1)：南宁庞博生物工程有限公司；羟自由基测定试剂盒、总抗氧化能力(T-AOC)测定试剂盒、抗超氧阴离子自由基测定试剂盒、过氧化氢(H2O2)测定试剂盒均来自南京建成生物工程研究所。
1.1.2 仪器
UV-3200扫描型紫外可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；KQ-500DE数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；真空冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司SHZ-D(Ш)；Infinite 200 Pro NanoQuant酶标仪，上海安景科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 泥鳅多糖制备
以泥鳅加工副产物为原料，低温干燥，粉碎，制成粉末状，采用超声波辅助蛋白酶法提取泥鳅多糖[10]，在粉末状原料中加入10倍质量体积的蒸馏水，置于100 W超声波中处理20 min，再加入5%原料质量的中性蛋白酶制剂，在50℃恒温条件下酶解6 h，最后高温灭酶，7 000 r·min-1离心10 min取溶液，溶液中加入乙醇醇沉，静置过夜，再离心取沉淀，经冷冻干燥，即获得泥鳅粗多糖样品。
1.2.2 羟自由基测定
配制质量浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg·mL-1的泥鳅多糖溶液和VC溶液，按照试剂盒说明书配制反应体系，以不加样加蒸馏水为对照，VC为阳性对照，在550 nm波长处测定吸光值，并计算羟自由基清除率，公式如下：
抑制率=(OD对照组−OD测定组+OD空白组)/对照组×100% 1.2.3 抗超氧阴离子自由基测定
配制质量浓度分别为1、3、5、7、9、10 mg·mL-1的泥鳅多糖溶液，以及质量浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg·mL-1的VC溶液，按照试剂盒说明书配制反应体系，以不加样加蒸馏水为对照，VC为阳性对照，在550 nm波长处测定吸光值，并计算超氧阴离子自由基清除率，公式如下：
抑制率=(OD对照组−OD测定组+OD空白组)/对照组×100% 1.2.4 H2O2测定
配制质量浓度分别为1、3、5、7、9、10 mg·mL-1的泥鳅多糖溶液，以及质量浓度分别为0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.0 mg·mL-1的VC溶液，按照试剂盒说明书配制反应体系，以不加样加蒸馏水为对照，VC为阳性对照，在405nm波长处测定吸光值，并计算过氧化氢的清除率，公式如下：
抑制率=(OD对照组−OD测定组+OD空白组)/对照组×100% 1.2.5 总抗氧化能力(T-AOC)测定
调整泥鳅多糖溶液质量浓度为1 mg·mL-1，根据试剂盒说明书进行总抗氧化能力测定，以不加样加蒸馏水为对照，维生素C为阳性对照，在520 nm波长下测定吸光值，并根据公式计算。
总抗氧化能力(U⋅mL−1)=(OD测定组−OD对照组)N⋅n0.01×30 公式中：OD测定组为测定管吸光值，OD对照组为对照管吸光值；N为反应体系稀释倍数(反应液总量/取样量)；n为样品测试前稀释倍数。
2. 结果与分析
2.1 泥鳅多糖的提取
以泥鳅加工副产物(泥鳅内脏、边骨肉、鱼头等)为原料，采用超声波辅助蛋白酶法提取的泥鳅多糖，为红褐色粉末状，有略微腥味，提取率为5.37%，多糖含量为85.5%。
2.2 对羟自由基清除能力
羟自由基(·OH)系活性氧的一种，是机体内化学性质最活泼的一种活性分子，几乎可以与细胞内的各类有机物发生反应，它能够杀死红细胞、降解DNA和细胞膜等，导致细胞组织受损，诱发各种疾病，加快生物体衰老，因此，清除羟自由基对机体有着重要的保护作用[11-12]。比较泥鳅多糖和维生素C对羟自由基的清除能力(图 1、2)，泥鳅多糖和Vc都随着质量的升高清除羟自由基的能力增强。当泥鳅多糖为1 mg·mL-1时对羟自由基的清除率达到73.38%，1 mg·mL-1的维生素C的羟自由基清除率为93.26%。
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图 1 泥鳅多糖对羟自由基清除能力Figure 1. Scavenging ability of loach polysaccharides on hydroxyl radicals2.2 对超氧阴离子清除能力的分析
超氧阴离子是机体内寿命最长的自由基，即是阴离子，又是自由基，具有很强的氧化性和还原性，即是氧化剂，又是还原剂，不发生化学变化时对人体无害，但与羟基(-OH)结合后的产物会导致细胞DNA损坏，破坏人类机体功能[13-14]。由图 3可以看出，泥鳅多糖具有清除超氧阴离子的能力，清除能力随着浓度的增大而增强，当泥鳅多糖含量为10 mg·mL-1时，对超氧阴离子的清除率为57.99%。Vc的超氧阴离子清除能力在0.1~0.3 mg·mL-1时提高较快，最大清除率可接近100%。
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图 3 泥鳅多糖对超氧阴离子的清除能力Figure 3. Scavenging ability of loach polysaccharides on superoxide anions2.3 对H2O2清除能力
过氧化氢是一种活性氧成分, 它虽然不是很活泼，但对细胞膜有很强的透入性，参与许多神经系统疾病的发病机制，常用作神经细胞氧化损伤的诱导剂，能使膜脂质过氧化, 降低细胞膜的流动性，改变细胞内蛋白质的成分和活性，使染色质浓缩，DNA断裂，最终导致细胞死亡[15]。通过比较泥鳅多糖和Vc清除过氧化氢的能力(图 5、6)，可以看出，泥鳅多糖和Vc对过氧化氢清除能力随着浓度的增加呈上升趋势，泥鳅多糖在10 mg·mL-1时H2O2清除率达到88.22%，Vc在1 mg·mL-1时H2O2清除率达到97.27%。
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图 5 泥鳅多糖对过氧化氢的清除能力Figure 5. Scavenging ability of loach polysaccharides on hydrogen peroxide2.4 总抗氧化能力(T-AOC)
抗氧化剂是通过自身的还原作用给出电子而清除自由基的，其还原力(总抗氧化力)越强，抗氧化活性越强，因此可以通过测定总抗氧化力来反映抗氧化活性的大小[15]。通过计算可得，泥鳅多糖质量浓度为1 mg·mL-1时的总抗氧化能力为8.42 U·mL-1。
3. 讨论
自由基含有一个未成对电子，因而具有顺磁性和很高的反应活性，是机体生化反应的中间代谢产物，在机体正常及病理过程中均存在[16]。根据自由基的生物医学理论，当机体内产生过量自由基时，活性氧的自由基可使生物体的脂肪、蛋白质、核酸等物质发生氧化破坏，继而导致衰老、癌症、心血管病等疾病[17-19]。本研究初步证实，从泥鳅加工副产物中提取的泥鳅多糖，具有较好的清除羟自由基、超氧阴离子以及过氧化氢的能力，类似于维生素C的清除效果。泥鳅多糖对自由基的清除活性能力说明其具有良好的抗氧化活性，可以延缓机体衰老，对高血压、糖尿病、老年痴呆症等疾病的治疗可以发挥积极的作用[20-21]，因此对泥鳅多糖的开发和利用具有极大的价值。
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图 1 泥鳅多糖对羟自由基清除能力
Figure 1. Scavenging ability of loach polysaccharides on hydroxyl radicals
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图 3 泥鳅多糖对超氧阴离子的清除能力
Figure 3. Scavenging ability of loach polysaccharides on superoxide anions
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图 5 泥鳅多糖对过氧化氢的清除能力
Figure 5. Scavenging ability of loach polysaccharides on hydrogen peroxide
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