七叶一枝花Paris polyphylla Smith var.chinensis (Franch.)Hara.属百合科重楼属植物，与云南重楼Paris polyphylla Smith var. Yunnanensis (Franch.)Hand.Mazz.并列为《中国药典》2015年收载的重楼药材基原植物^[1]，主要以干燥根茎入药，是云南白药、季德胜蛇药片等著名中成药的主要原料之一^[2]。近来七叶一枝花价格一路攀升，加上野生资源面临枯竭，七叶一枝花人工种植得到了高度重视，但七叶一枝花种子存在二次休眠，自然情况下种子休眠期长，发芽率低^[3-5]，目前其种苗繁殖技术仍未成熟，市场供不应求，七叶一枝花的种子繁殖研究仍处于起步阶段，种子休眠解除、萌发、出苗过程中生理生化指标方面系统研究还较少。

种子休眠解除、萌发、出苗过程中需要将种子内贮藏物质转化成可利用的养料和能量^[7-8]，种子萌发主要经历异氧和自氧的过程，在这个过程中胚乳中储存的大分子物质降解，并经过呼吸代谢，构成可利用物质和能量输送到生长部位^[9]。参与种子物质分解和转化的主要酶类有α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶和β-淀粉酶以不同形式水解淀粉^[10-12]，有研究^[13-14]表明种子在萌发过程中α-淀粉酶起主导酶作用，β-淀粉酶不仅参与种子淀粉的分解，而且与淀粉糖化力关系密切^[15]，在谷物籽粒中研究发现β-淀粉酶参与淀粉的降解和转运，为萌发提供能量，β-淀粉酶活性是水稻发芽势和活力的可靠指标^[16]。七叶一枝花种子相关贮藏物质和淀粉酶活性相关研究报道不多，本研究通过对层积处理后同期七叶一枝花种子萌发不同阶段中贮藏物质和淀粉酶活性差异分析，以期从贮藏物质代谢转化淀粉酶活性变化方面进一步揭示七叶一枝花种子萌发机制，为深入研究和生产上提高七叶一枝花种子繁殖技术提供理论支撑。

1.   材料与方法

1.1   材料

供试材料为2015年采自福建省南平市光泽县福建承天药业重楼规范化栽培基地[2014年当地野生采集后移植到基地，经中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定为七叶一枝花Paris polyphylla var. chinensis(Franch.)Hara]，自花授粉果实自然成熟的种子。

1.2   方法

1.2.1   种子萌动处理

将自然成熟、新鲜的七叶一枝花种子洗去红色外种皮，阴干，置冷藏，随后保温沙藏，大田播种，处理时间为150 d，种子即将出苗前，根据种子萌发形态同时取未萌动阶段(Ⅰ)、已萌动胚根刚突破种皮阶段(Ⅱ)、上胚轴未伸长阶段(Ⅲ)、上胚轴已伸长但果皮未透明阶段(Ⅳ)、即将出苗前阶段(Ⅴ)，各10 g种子，观察不同萌发阶段种子显微结构、测定可溶性糖、淀粉含量和淀粉酶活性。

1.2.2   种子显微结构观察

电镜型号：日本电子JSM-6380LV。先将种子从中间切开，5%的戍二醛固定样品4 h，磷酸缓冲液清洗样品，1%锇酸固定4 h，蒸馏水清洗，酒精逐级脱水，叔丁醇置换，冷冻干燥仪干燥，上台，喷金，上机观察、拍照。

1.2.3   测定方法

淀粉含量参考双波长法测定；可溶性糖含量采用蒽酮比色法测定；淀粉酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶活性测定采用3, 5-二硝基水杨酸法^[17]。

1.3   数据处理

每个试验处理重复3次，采用SPSS 13.0进行试验数据的分析处理。

2.   结果与分析

2.1   七叶一枝花种子萌发不同阶段外观及显微结构

通过显微镜观察七叶一枝花不同萌发阶段种子纵切胚发育及胚乳细胞内贮藏物质的变化(图 1)，第Ⅰ阶段种子未萌动，显微镜未观察到分化的胚；细胞排列紧凑，细胞内物质多，黏质液状，淀粉等物质黏成团状。第Ⅱ阶段胚根突破种皮，电镜观察到胚根分化形成，细胞排列紧凑，细胞内淀粉等物质已分离成颗粒状，淀粉粒等物质充满整个细胞，量多。第Ⅲ阶段胚根突破种皮后胚膨大，但未形成根系，细胞排列较疏散，胚乳营养开始被吸收，细胞内淀粉等物质减少。第Ⅳ阶段根系形成，电镜观察到子叶进一步生长，胚乳营养已被吸收1/3，细胞排列疏散，胚乳营养进一步被吸收，细胞内淀粉等物质减少。第Ⅴ阶段子叶发育完全，占据整个种子，胚乳萎缩，细胞内淀粉等物质减少至接近0，一些细胞中只有残留的物质，是子叶最后脱离种皮伸展出来前夕^[18]。

图  1  七叶一枝花种子萌发不同阶段外观和显微形态

注：A为未萌动阶段，B为已萌动胚根刚突破种皮阶段，C、F为上胚轴未伸长阶段，D为上胚轴已伸长但果皮未透明阶段，E为即将出苗前阶段。

Figure  1.  Morphology of P. polyphylla seed at different stages of germination

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七叶一枝花种子胚乳在萌动之后，细胞内主要的贮藏物质为淀粉，淀粉颗粒呈类圆球形、椭圆形、卵圆形，大小不一，直径1~12 μm，排列紧凑至疏散^[19]，图 1-A~E为1 000倍下细胞内贮藏物质情况，图 1-F为4 000倍下细胞内淀粉粒结构。

2.2   七叶一枝花种子不同萌发阶段淀粉含量变化

种子萌发不同阶段淀粉含量呈下降的趋势(图 2)，七叶一枝花种子萌发前淀粉含量较高(25.2 mg·g^-1)，种子萌动后胚休眠解除前，种子淀粉含量上升后又逐渐降低，差异未达到显著水平，出苗前阶段，种子淀粉含量急剧下降，呈极显著差异(P＜0.01)。

图  2  七叶一枝花种子萌发阶段淀粉含量变化

Figure  2.  Changes on starch content in P. polyphylla seeds during germination

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2.3   七叶一枝花种子不同萌发阶段可溶性糖含量变化

七叶一枝花种子萌发前可溶性糖含量较低(5.4 mg·g^-1)，种子萌动时(Ⅱ阶段)可溶性糖含量迅速上升(20.6 mg·g^-1)，呈极显著差异(P＜0.01)，随着种子萌发阶段加强呈降低趋势，即将出苗前(Ⅴ)可溶性糖含量最低(0.2 mg·g^-1)，见图 3。

图  3  七叶一枝花种子萌发阶段可溶性糖含量变化

Figure  3.  Changes on soluble sugar content in P. polyphylla seeds during germination

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2.4   七叶一枝花种子不同萌发阶段淀粉酶活性变化

(1)α-淀粉酶活性变化：α-淀粉酶活性在种子休眠未解除时较低，为1.1 mg·g^-1·min^-1，种子萌动阶段，活性上升，种子胚轴休眠时，α-淀粉酶活性又下降，根系生长阶段，种子α-淀粉酶活性最高，为6.7 mg·g^-1·min^-1，种子即将出苗阶段，活性又降到最低，为0.1 mg·g^-1·min^-1，与种子萌动至根系生长阶段呈极显著差异(图 4)。

图  4  七叶一枝花种子萌发阶段淀粉酶活性变化

Figure  4.  Changes on amylase activity in P. polyphylla seeds during germination

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(2)β-淀粉酶活性变化：种子休眠未解除时β-淀粉酶活性较低，为4.1 mg·g^-1·min^-1，种子萌动时活性迅速上升，20.4 mg·g^-1·min^-1，差异达极显著水平，种子萌动至上胚轴生长阶段，种子β-淀粉酶活性均处于较高水平，差异不明显，种子即将出苗阶段，活性降到最低，为0.2 mg·g^-1·min^-1(图 4)。

(3) 总淀粉酶活性变化：种子萌动前活性较低，种子萌动至上胚轴生长阶段，种子总淀粉酶活性均处于较高水平，种子即将出苗阶段，活性降到最低(图 4)。

2.5   种子萌发过程贮藏物质与淀粉酶相关性分析

七叶一枝花种子萌发过程中种子的淀粉、可溶性糖含量与淀粉酶活性的相关性分析见表 1，α-淀粉酶活性与淀粉含量呈负相关，但不显著；淀粉酶活性与β-淀粉酶活性呈极显著正相关(P＜0.01)，同时与可溶性糖含量呈极显著正相关(P＜0.01)，说明淀粉酶活性与β-淀粉酶活性变化规律相似，且与可溶性糖的转化关系密切。

表  1  贮藏物质与淀粉酶活性相关性

Table  1.  Correlation analysis on stored carbohydrate content and amylase activity

	淀粉 含量	可溶性 糖含量	淀粉酶 活性	α-淀粉 酶活性	β-淀粉 酶活性
淀粉含量	1.0000
可溶性糖含量	0.5796	1.0000
淀粉酶活性	0.4246	0.9449**	1.0000
α-淀粉酶活性	-0.1073	0.6006	0.8113*	1.0000
β-淀粉酶活性	0.6493	0.9522**	0.9150**	0.6092	1.0000
注：*、**分别表示0.05和0.01的显著水平。

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3.   讨论与结论

七叶一枝花种子萌动前，种子细胞内物质多，黏质成团状，随着种子萌发、出苗，细胞内物质逐渐减少，这与前人在玉米、大麦、小麦、莲、水稻、假色槭等^[8-15]种子萌发过程研究结果类似，种子贮藏物质在休眠解除后经过关键酶分解后，转化成可利用能量输送到种胚中去，促进胚的生长发育^[9]。七叶一枝花种子淀粉和可溶性糖含量都为种子萌动前较低，种子萌动阶段迅速上升，出苗前阶段，两者含量所剩无几，这与朱建华等^[9-15]在作物上研究结果一致，种子在萌发过程中，贮藏物质被转化和降解为供应种子萌发各种生理活动所需要的养料和能量。本研究中七叶一枝花种子的胚乳贮藏物质消耗完后，细胞仍由原有的细胞壁维持，与莲种子特性相似^[20]，而小麦种子萌发时，胚乳细胞壁首先发生降解，随后胚乳中间部分降解，细胞壁先消失，淀粉粒直接暴露于酶作用^[21]。

种子休眠解除、萌发、出苗过程中，储藏物质的代谢需要大量的酶参与，淀粉酶为最主要的酶之一^[8]。本研究中，七叶一枝花种子休眠阶段α-淀粉酶活性都比较低，而解除后都明显增强，说明α-淀粉酶活力与七叶一枝花种子休眠解除关系密切，种子萌动阶段，α-淀粉酶活力迅速升高，这与玉米^[15]种子萌发中淀粉酶活性变化趋势相似；可能与α-淀粉酶是催化淀粉水解，为种子芽鞘的伸长生长提供能量有关^[8-12]，七叶一枝花种子萌动后β-淀粉酶活性不断增强，出苗前阶段降低，七叶一枝花种子萌动至出苗过程中分解淀粉的酶主要是β-淀粉酶，淀粉酶活性与β-淀粉酶活性呈极显著正相关，因此，β-淀粉酶活性变化规律反映了总淀粉酶活性变化规律，这与板栗萌芽过程类似^[21]，β-淀粉酶活性与可溶性糖含量呈极显著正相关，说明β-淀粉酶活性与促进淀粉转变为糖类物质有关，而且在种子发芽过程随着β-淀粉酶被不断消耗而呈现出活性下降的趋势，与前人在其他作物研究结果类似^{[8, 10]}。

对七叶一枝花种子萌发不同阶段贮藏物质和酶活性变化的研究中发现，种子生理休眠解除后，淀粉酶被激活、淀粉被水解，淀粉酶活性不断下降，种子内贮存的淀粉、可溶性糖含量也逐渐减少，α-淀粉酶活性对七叶一枝花种子两次休眠的解除起着重要的作用，β-淀粉酶促进可溶性糖转化，本研究仅对同期处理不同萌发阶段七叶一枝花种子内含物质可溶性糖、淀粉以及α-淀粉酶、β-淀粉酶、总淀粉酶活性的变化规律进行了初步研究，种子物质代谢与休眠解除及相关酶、激素变化等问题尚待进一步深入研究。