Disease and Insect Resistance Genes in Premium Sterile Line Funong A
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摘要:目的
分析福农A中的抗病虫基因，为该不育系更好地应用于育种生产提供理论依据。
方法以福农A及亲本福稻B、华航丝苗为材料，利用抗稻瘟病基因分子标记检测各材料中抗稻瘟病基因情况，并应用高密度芯片检测抗白叶枯病、抗病毒及抗褐飞虱基因情况。PCR扩增获得福农A及亲本福稻B、华航丝苗中的抗稻瘟病基因，进行序列比对分析。植株培养至三叶一心期，喷雾接稻瘟病菌并取样，采用 SYBR Green I 荧光定量 PCR（qRT-PCR） 分析抗稻瘟病基因的表达模式。
结果福农A及亲本福稻B、华航丝苗中均含有稻瘟病抗性基因Pib、Pia、Pid3和Pid2，但均不含Pi9、Pi54、Pigm、Pit、Pi2；另外，福农A和华航丝苗中含有Pi5，而福稻B中含有Pita和Pi37。福农A及亲本福稻B和华航丝苗中均含有抗白叶枯病基因Xa21和抗黄色斑驳病毒病基因Rymv1；福农A及华航丝苗中含持久性抗水稻条叶枯病毒基因STV11；但它们中均不含抗褐飞虱基因Bph14、Bph15、Bph18、 Bph26、 Bph6、 Bph9。扩增获得的 Pi5、Pia、Pib、Pid3、Pid2基因序列长分别为5 672、2 597、5 532、2 865、
3847 bp；福农A与亲本华航丝苗中的Pi5基因序列完全一致；福农A和亲本华航丝苗、福稻B中的Pia、Pib基因序列均完全一致；福农A和华航丝苗中的Pid3和Pid2基因序列完全一致，而它们与福稻B的序列分别有2个和5个碱基差异。在福农A中，抗稻瘟病基因Pi5和Pib的表达明显受稻瘟病菌的诱导，接菌72 h时表达量最高；Pia和Pid3的表达随接菌时间的延长而逐渐升高，接菌96 h时表达量最高；Pid2的表达先升高后降低，且在接菌24 h时表达量最高。结论水稻三系不育系福农A中含有稻瘟病抗性基因Pi5、Pib、Pia、Pid3和Pid2，抗白叶枯病基因Xa21、抗黄色斑驳病毒病基因Rymv1及持久性抗水稻条叶枯病毒基因STV11。因此，该不育系有望应用于多抗基因的聚合育种研究。
Abstract:ObjectiveDisease and insect resistance genes in Funong A, a three-line indica cytoplasmic male sterile line, were analyzed for breeding applications.
MethodGenomic DNA of Funong A, Fudao B, and Huahangsimiao rice germplasms was extracted by CTAB method followed by detection of blast resistance genes with molecular markers. Resistance genes related to bacterial blight, viral diseases, and brown planthopper infestation were analyzed by high density chip detection method. Blast resistance genes of the lines were obtained by PCR and sequenced for comparison. Specimens were collected at 0, 24, 48, 72, and 96 h after a blast fungus inoculation for extraction of total RNA using Trizol method. Gene expression was determined by SYBR Green I qRT-PCR.
ResultFunong A, Fudao B, and Huahangsimiao were found to contain the blast resistance genes Pib, Pia, Pid3, Pid2, bacterial blight resistance gene Xa21, and yellow mottle virus resistance gene Rymv1. Furthermore, Funong A and Huahangsimiao had the blast resistance gene Pi5 and the stripe virus resistance gene STV11, while Fudao B consisted of the blast resistance genes Pita and Pi37. However, no brown planthopper resistance genes were detected in them. The fragments of Pi5, Pia, Pib, Pid3, and Pid2 were 5 672 bp, 2 597 bp, 5 532 bp, 2 865 bp, and 3 847 bp in length, respectively. The sequences of Pi5, Pid3, and Pid2 in Funong A were similar to those in Huahangsimiao, but 2 bases differed from Pid3 and 5 from Pid2 of Fudao B. In Funong A, the expressions of rice blast resistance genes Pi5 and Pib were significantly induced by the blast fungus with a peak occurred 72 h after inoculation. The expressions of Pia and Pid3 increased gradually with time after inoculation to peak in 96 h. The expression of Pid2 rose initially to a maximum in 24 h and then declined.
ConclusionThe three-line indica cytoplasmic male sterile line Funong A carried the blast resistance genes Pi5, Pib, Pia, Pid3, and Pid2, which were significantly induced by the blast fungus. The line also contained the bacterial blight resistance gene Xa21, yellow mottle virus resistance gene Rymv1, and stripe virus resistance gene STV11 but none of the insect resistance genes.
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Keywords:
- Funong A /
- blast resistance gene /
- sequential analysis /
- gene expression
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0. 引言
【研究意义】水稻是重要的粮食作物，在保障我国的粮食安全方面具有重要的地位。在水稻三系杂交育种中，具有优良目标性状的亲本是获得优良性状集中的杂交组合的重要前提[1]。稻米品质优、抗病性强、农艺性状优良、异交习性好、配合力强的三系不育系在生产上有较好的应用前景[2]。不育系是育成优良杂交稻组合的关键亲本之一。多年来，高产、优质、多抗一直是水稻育种的主题[3]。因此，研究分析不育系中的抗病虫基因及其特性对于不育系的应用和培育多抗水稻新品种具有重要的意义。【前人研究进展】福农A是以高抗稻瘟病且优质的水稻品种华航丝苗作为供体亲本与综合农艺性状优良但米质欠佳的籼稻三系保持系福稻B进行杂交，并通过测交选育出的三系不育系，其对应的保持系为福农B[4]。福农A的午前开花率达85%，不育株率为100%，花粉不育度为99.99%，柱头外露率为57.12%；福农A的茎秆倒三节直径较大，茎秆壁较厚，且茎秆中半纤维素和硅的含量较高。福农B的米质符合三等食用籼稻品种品质规定要求，其加工品质和外观品质明显优于亲本福稻B；室内苗期稻瘟病抗性鉴定显示福农A抗菌株率为81.82%，成株期稻瘟病圃鉴定显示福农A表现为中抗稻瘟病，在福建省内的不同种植区福农A表现为中抗或抗稻瘟病[4]。前期研究通过芯片技术分析了福农A中抗稻瘟病基因Pi5、Pid2、Pia和Pid3的情况，发现福农A中含有Pi5、Pid2和Pid3[4]。以福农A为母本，配组选育出了具丰产、中抗稻瘟病及米质较优等特点的杂交水稻新组合福农优039，并通过国家审定[5]。另外，利用福农A配组育成的福农优华珍、福农优676、福农优
9802 [6]、福农优404[7]、福农优156、福农优101[8]和福农优163均已通过国家或福建省审定，其中福农优676是获农业农村部确认的超级稻品种。【本研究切入点】籼型三系不育系福农A已通过福建省品种审定委员会审定，是具有较强开发潜力的不育系。但目前只分析了福农A中4个抗稻瘟病基因Pi5、Pid2、Pia和Pid3的情况，尚缺乏有关该不育系中抗病虫基因较全面的研究分析。【拟解决的关键问题】以不育系福农A及亲本福稻B和华航丝苗为材料，分析其中的抗稻瘟病基因及其他抗病虫基因情况，分析稻瘟病抗性基因序列及表达模式，为籼型三系不育系福农A的进一步推广和应用提供理论参考。1. 材料与方法
1.1 试验材料
福农A、福稻B和华航丝苗种子由福建省农业科学院水稻研究所保存。
1.2 试验试剂
BamH I限制性内切酶、Marker1000 bp和Marker2000 bp购自TaKaRa公司；总RNA提取试剂Trizol购自全式金生物技术有限公司；cDNA链反转试剂盒购自东洋纺（上海）生物科技有限公司；2 × Taq Plus Master Mix（Dye Plus）和荧光定量试剂购自南京诺维赞生物科技股份有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 PCR扩增及酶切分析
采用CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）法提取福农A、福稻B和华航丝苗植株的基因组DNA。 以DNA为模板进行PCR扩增，以鉴定含有的稻瘟病抗性基因情况，所用稻瘟病抗性基因相关分子标记见表1。PCR反应体系：2 × Taq Plus Master Mix（Dye Plus） 5 µL，上游引物和下游引物 （10 μmol·L−1）各 0.4 µL，DNA模板0.5 µL，ddH2O补足至10 µL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30个循环；72 ℃延伸7 min。反应完成后取PCR产物3 µL进行电泳检测。 取引物Pid3F/Pid3R的PCR产物，进一步采用BamH I进行酶切分析，反应体系：PCR产物3 µL，10×K buffer 1 µL，BamH 0.5 µL，ddH2O补足至10 µL，30 ℃ 酶切3 h；再取5 μL 酶切产物进行电泳检测。
表 1 PCR及qRT-PCR引物Table 1. Primers for PCR and qRT-PCR引物
Primers引物序列（5′-3′）
Primer sequence（5′-3′）片段大小（抗/感）
Fragment size（Resistance/Susceptibility）/bp参考文献
ReferencePibdom F：GAACAATGCCCAAACTTGAGA 365 (R) /无 (S) [9] R：GGGTCCACATGTCAGTGAGC Pi9 F：GCTGTGCTCCAAATGAGGAT 291 (R) / 397 (S) [10] R：GCGATCTCACATCCTTTGCT Pi5 F：ATAGATCATGCGCCCTCTTG 206 (R)/307 (S) [10] R：TCATACCCCATTCGGTCATT Pi54 F：CAATCTCCAAAGTTTTCAGG 216 (R)/359 (S) [11] R：GCTTCAATCACTGCTAGACC Pita F：CTCCCTTGTTCGGTCAAAAA 467 (R)/850 (S) [10] YL155：AGCAGGTTATAAGCTAGGCC R：CCACATTGATGAAGCCCATA Pia F：GCGACTGACACTTTCAATAGC 175 (R)/206 (S) [12] R：CGGTAGAGCAATTTAGAAGCAG Pigm F：CAGAGCAGTAACAAACCCTA 750 (R)/ 1800 (S)[13] R：TCCGCAAGATCAACATTC Pit F：ATGATAACCTCATCCTCAATAAGT 733(R)/无 (S) [14] R：GTTGGAGCTACGGTTGTTCAG Pid3 F：TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC Bam H I, 148 (R)/ 178 (S) [15] R：AGCACTTCTTGACTACTGTCTGCCT Pi2 F：CAGCGATGGTATGAGCACAA 450 (R)/ 282 (S) [10] R：CGTTCCTATACTGCCACATCG Pi37 F：TCTTGAGGGTCCCAGTGTAC 1149 (R)/无(S)[16] R：CGAACAGTGGCTGGTATCTC Pid2 F：GCGTCGAAGATGTCCTGAAGCTCA 629(R)/无 (S) [17] R：GGCAGTCGTATTGCTGTGAA Pi5-DNA F: CCTTCTCTCTTCTCGTTCTCCTATTTCACA 5672 R: CAGTTGGTTTCTTGTAGGATTACAGGTCAGT Pia-DNA F：ACATTTTAGTCAACTCGCCTGTTCTTTT 2597 R：CAATCAGAAAGCAACAGGTCCAAATAAC Pib-DNA F：ACAAAATCCATTCAAAAATAGAACAGAGCA 5532 R：CACAGCCCCTCGGGTCCACAT Pid3-DNA F：AAGCGAGAAGGAAGTAACACCCAAGG 2865 R：AAGAATGAATGTCCTGACTGAAACCAACT Pid2-DNA F：CTGGGTTTGAAGAAAAGAATAAAGGGAGTG 3847 R：TGAAAATGATACTGAAAGGTCTGATGAAAA Pi5-qPCR F：TTCTGCTCGCTATCCAATCCAATG 173 R：TTTCTGTATGATGTTGTTTGCTTCTCCTC Pia-qPCR F：CCAGCCACTTGCTCTTGTTACCATAG 134 R：GCCGCATCCTTTCAAGTGTTTTATCA Pib-qPCR F：GGACAAGTGTTGGTGCTTCGGAG 176 R：CCTTGGGCTTTGATAAACACCGCT Pid3-qPCR F：AAGCAGTGGAGGTCGCCAAGTC 138 R：CGTCCTTGAACCGCTCGGCT Pid2-qPCR F：ACTAACTTCTTCCCTCCTGCGGCT 175 R：AAGATGCGAAACGAGTTGTATTCCC Actin150 F：AGTGTCTGGATTGGAGGAT 147 R：TCTTGGCTTAGCATTCTTG 1.3.2 芯片分析
取福农A、福稻B和华航丝苗的叶片，液氮速冻，并送往武汉双绿源创芯科技研究院有限公司进行高密度芯片检测，分析各材料中抗白叶枯病、抗病毒及抗褐飞虱基因情况。采用的高密度水稻基因芯片包含了丰富的多态性标记、重要农艺性状的功能基因标记和单倍型标记等；包含 44 263个SNP位点，来源于全世界各地的
4726 份栽培稻品种的重测序结果，覆盖范围较广。每个材料3次重复。1.3.3 稻瘟病抗性基因DNA序列分析
分别下载稻瘟病抗性基因的参考序列Pi5（GenBank: EU869185.1）、Pia（LOC_Os11g11790）、Pib（GenBank: AB013448.1）、Pid3（GenBank: FJ745364.1）、Pid2（GenBank: FJ915121.1），设计特异性引物（表1）。以福农A、福稻B和华航丝苗的基因组DNA为模板进行PCR扩增，PCR体系和程序参考1.2.1，获得相应的稻瘟病抗性基因（均包含完整的编码区）。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳检测，并将PCR产物送公司测序，进行序列比对分析。
1.3.4 荧光定量PCR
为了进一步了解福农A及亲本华航丝苗、福稻B中受稻瘟病菌诱导后抗稻瘟病基因的表达情况，采用qPCR分析抗稻瘟病基因的表达模式。福农A、福稻B和华航丝苗种植于室内培养室，三叶一心期喷雾接稻瘟病菌（福建生理小种SM17020-7，由福建省农业科学院植物保护研究所保存），孢子浓度为100×视野中30～50个孢子。黑暗培养24 h后恢复正常光照（光照和黑暗各12 h），温度28 ℃、湿度90%继续培养，并分别于接菌0、24、48、72、96 h取样，液氮速冻并保存于−80 ℃，备用。采用Trizol法提取植株总RNA；按照反转录试剂盒的操作说明书，反转录合成cDNA第一链，并稀释20倍用于后续试验。进行SYBR Green I荧光定量PCR（qRT-PCR），以水稻Actin150作为内参，反应体系：ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix 10 µL，上下游引物（10 µmol·L−1）各 0.6 µL，cDNA 2 µL，ddH2O补足至20 µL。采用Thermo实时荧光定量PCR仪（QuantStudioTM 7 Flex System），每个反应4次重复；反应程序：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s， 40个循环，反应结束后进行溶解曲线分析；采用2−ΔΔCT法计算基因相对表达量。所用引物见表1。
1.3.5 数据分析
采用单因素方差分析对qPCR相关数据进行统计分析，P值＜0.05为差异显著；采用 Microsoft Excel 2019进行统计分析及作图。
2. 结果与分析
2.1 福农A及亲本的表型特征
籼型三系不育系福农A亲本来源为福稻B和华航丝苗。福稻B是福建省农业科学院水稻研究所自主选育的籼型三系保持系，具株叶形态好、穗大粒多、秆粗且抗倒伏、香型等优点，但米质欠佳。华航丝苗是华南农业大学植物航天育种研究中心选育的常规稻，该品种米质较优且抗稻瘟病，但植株较高，剑叶长、宽、披，茎秆较细。以福稻B作母本与华航丝苗杂交，通过聚合两亲本优良性状，再用谷丰A作为质供体，通过多年连续回交，育成野败型不育系福农A，该不育系育性稳定、开花习性好、抗稻瘟病、株叶形态好、茎秆粗壮（图1）。
2.2 稻瘟病抗性基因检测
结果（图2）显示，福农A及亲本福稻B和华航丝苗中均含有稻瘟病抗性基因Pib、Pia和Pid3、Pid2，但均不含Pi9、Pi54、Pigm、Pit、Pi2；福农A和华航丝苗中含有Pi5，福稻B中不含该基因；福稻B中含有Pita和Pi37，但福农A和华航丝苗中均不含这两个基因。
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图 2 稻瘟病抗性基因分析M为Marker 1 000 bp/2 000 bp，CK1为阳性对照，CK2为阴性对照，HH为华航丝苗，FD为福稻B，FN为福农A。Figure 2. Analysis on rice blast resistance genesM: Marker 1 000 bp/2 000 bp; CK1: positive control; CK2: negative control; HH: Huahangsimiao; FD: Fudao B; FN: Funong A.2.3 抗病虫基因分析
如表2所示，福农A及亲本福稻B和华航丝苗中均含有抗白叶枯病基因Xa21，但均不含xa13、Xa23、xa5、Xa7基因。福农A及亲本福稻B和华航丝苗中均含有抗黄色斑驳病毒病基因Rymv1；福农A及华航丝苗中含持久性抗水稻条叶枯病毒基因STV11，福稻B中不含该基因。福农A及亲本福稻B和华航丝苗中均不含抗褐飞虱基因Bph14、Bph15、Bph18、 Bph26、 Bph6、 Bph9。
表 2 抗病虫基因分析结果Table 2. Analysis on disease and insect resistance genes基因名称
Genes染色体
Chromosome表型
Phenotype探针类型
Probe type福农A
FunongA福稻B
FudaoB华航丝苗
Huahangsimiaoxa13 8 白叶枯抗性 单倍型 0.08 0.08 0.22 Xa21 11 白叶枯抗性 单倍型 1.00 1.00 1.00 Xa23 11 白叶枯抗性 单倍型 0.07 0.10 0.07 xa5 5 白叶枯抗性 单倍型 0.35 0.31 0.35 Xa7 6 白叶枯抗性 单倍型 0.11 0.44 0.11 Rymv1 4 抗黄色斑驳病毒病 SNP √ √ √ STV11 11 持久性抗水稻条叶枯病毒 SNP √ √ Bph14 3 褐飞虱抗性 单倍型 0.48 0.55 0.34 Bph15 4 褐飞虱抗性 单倍型 0.16 0.16 0.16 Bph18 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.69 0.59 0.69 Bph26 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.52 0.43 0.52 Bph6 4 褐飞虱抗性 单倍型 0.62 0.62 0.62 Bph9 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.40 0.28 0.40 表格中探针类型为“SNP”的基因，样品编号下方的“√”表示与代表品种基因型一致，空格表示未检测到相关基因；表格中探针类型为“单倍型”的基因，样品编号下方的数字表示与标准样对比的相似度，“1.00”表示与标准样相似度达100%，样品中存在该基因。
For genes with probe type "SNP", a "√" sign under the code indicates a genotype consistent with reference, while without a sign, no related gene detected. For genes with probe type "haplotype"，number represented similarity to reference sequence, and "1.00" indicates a 100% similarity to reference as gene existed in the sample.2.4 稻瘟病抗性基因序列分析
结果显示，扩增出的Pi5、Pia、Pib、Pid3、Pid2基因序列长度分别为5 672、2 597、5 532、2 865、3 847 bp（图3）。序列比对分析结果显示，福农A与亲本华航丝苗中的Pi5基因序列完全一致；福农A和亲本华航丝苗、福稻B中的Pia、Pib基因序列均完全一致；福农A和华航丝苗中的Pid3和Pid2基因序列完全一致，而福农A和华航丝苗的Pid3序列与福稻B中的序列有2个碱基差异，福农A和华航丝苗的Pid2序列与福稻B中的序列有5个碱基差异（图4）。
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图 3 稻瘟病抗性基因的PCR扩增M为Mark10000 bp，FN为福农A， HH为华航丝苗，FD为福稻B。Figure 3. Amplification of rice blast resistance genes by PCRM: Mark10000 bp, FN: FunongA , HH: Huahangsimiao, FD: FudaoB.![]()
图 4 稻瘟病抗性基因Pid3和Pid2的序列比对方框内为碱基差异位置。Figure 4. Sequence alignment of blast resistance genes Pid3 and Pid2Position of base difference showed in box.2.5 抗稻瘟病基因的表达分析
抗稻瘟病基因Pi5的表达分析表明，在福农A和华航丝苗中Pi5的表达均受到稻瘟病菌的诱导（图5A）。在福农A中，Pi5的表达先随接菌时间的延长而升高，接菌72 h时表达量最高（约为0 h时的4.5倍），而接菌96 h时表达稍下调。在华航丝苗中，接菌24 h时Pi5的表达明显上调，48 h时稍下调，而后又明显上调，接菌 72 h和96 h时表达水平相当（约为0 h时的3.8倍）。
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图 5 稻瘟病抗性基因的表达分析*表示差异显著（P≤0.05）, **表示差异较显著（P≤0.01）, ***表示差异极显著（P≤0.001）。Figure 5. Expressions of rice blast resistance genes*: Significant difference ( P≤0.05); **: extremely significant difference ( P≤0.01); ***: very extremely significant difference (P≤0.001).抗稻瘟病基因Pib在福农A中的表达模式与Pi5的类似，接菌72 h时表达量最高，约为0 h时的6.8倍。在华航丝苗中，Pib的表达在接菌24 h时明显上调，48 h时稍下调，而后又明显上调，接菌96 h时表达量最高（约为0 h时的5.7倍）。在福稻B中，Pib的表达在接菌24 h时明显上调，48 h时稍下调，接菌72 h时表达量最高（约为0 h时的11倍），而96 h时表达又下调（图5B）。
抗稻瘟病基因Pia在福农A中的表达随接菌时间的延长而逐渐升高，接菌96 h时表达量最高，约为0 h时的3.8倍。在华航丝苗中，Pia的表达在接菌24 h时上调，48 h与24 h时表达水平相当，而后表达又上调，接菌 72 h和96 h时表达水平相当（约为0 h时的3.8倍）。在福稻B中，接菌后Pia的表达明显上调，接菌48 h时表达量最高，约为0 h时的3.4倍；而后其表达又逐渐下调，接菌96 h时的表达量约为0 h时的2.2倍（图5C）。
抗稻瘟病基因Pid3在福农A 中的表达随接菌时间的延长而逐渐升高，接菌96 h时表达量最高，约为0 h时的12.5倍。类似地，Pid3在华航丝苗中的表达在接菌96 h时最高，约为0 h时的6.6倍。在福稻B中，接菌后Pid3的表达上调，接菌72 h时表达量最高，约为0 h时的4.6倍，而后表达又稍下调。同时，与两个亲本相比，接稻瘟病菌后Pid3在福农A 中的表达上调幅度最大（图5D）。
抗稻瘟病基因Pid2在福农A及亲本华航丝苗、福稻B中的表达均先升高后降低，且均在接菌24 h时表达量最高，为0 h时的3～5倍。接菌24 h后，Pid2的表达有所下降，且与两个亲本相比，Pid2在福农A 中的表达下调幅度较小（图5E）。
3. 讨论
三系不育系福农A具有开花习性好、育性稳定、优质、抗稻瘟病、株叶形态好、茎秆粗壮等优点。利用福农A育成的品种包括福农优
9802 、福农优404、福农优101和福农优163等对稻瘟病的抗性均达到了中抗水平。本研究结合分子标记和基因序列测序表明福农A和华航丝苗中含有Pia基因，而先前的芯片检测结果显示福农A和华航丝苗中含有Pi5、Pid2和Pid3但不含有Pia基因[4]，这很可能与芯片检测中所用的Pia探针存在序列差异有关。关于福农A中稻瘟病抗性基因的来源方面，本研究中福农A和华航丝苗中的Pid3和Pid2基因序列完全一致，但与福稻B中的序列有碱基差异，表明福农A中的Pid3和Pid2基因均来自华航丝苗。进一步分析发现，Pid3中的2个碱基差异在外显子上且会引起所编码的氨基酸的改变，表明华航丝苗中的Pid3和福稻B中的Pid3是等位基因，其在抗稻瘟病的功能方面是否有所差异，有待进一步的研究分析。虽然福农A、华航丝苗中的Pid2基因序列和福稻B中的序列有5个碱基差异且其中3个碱基差异在外显子上，但不会引起所编码氨基酸的改变，即属于同义突变。
稻瘟病是由子囊真菌引起的最严重的水稻病害之一，会引起水稻大幅减产甚至颗粒无收[18]；而白叶枯病是由革兰氏阴性黄单胞菌稻致病变种引起的细菌性病害，在中国南方稻区常年发生[19]。利用抗性基因培育多抗水稻新品种，能有效减少农药的使用量，在提高产量的同时保障稻米品质[20]。相关研究结合分子标记辅助选择，改良获得了兼抗稻瘟病与白叶枯病的稳定光温敏核不育系[含抗白叶枯病基因Xa23和抗稻瘟病基因Pi9(t)]及优良三系不育系荣 3A（含抗稻瘟病基因Pi1、Pi2及抗白叶枯病基因Xa23）[21,22]。本研究表明不育系福农A中含多个抗稻瘟病基因包括Pi5、Pib、Pia、Pid3、Pid2，与含单个相应抗稻瘟病基因的不育系相比，在育种应用中更具优势。同时，福农A中还含有抗白叶枯病基因Xa21。因此，不育系福农A在兼抗稻瘟病与白叶枯病及聚合多抗基因的育种应用方面具有较大潜力。
4. 结论
本研究表明籼型三系不育系福农A中含有5个稻瘟病抗性基因（Pi5、Pib、Pia、Pid3、Pid2）、抗白叶枯病基因Xa21、抗黄色斑驳病毒病基因Rymv1及持久性抗水稻条叶枯病毒基因STV11；序列分析表明福农A中的稻瘟病抗性基因Pi5、Pid3和Pid2来自亲本华航丝苗；并获得了受稻瘟病诱导后相关稻瘟病抗性基因的表达模式。
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图 2 稻瘟病抗性基因分析
M为Marker 1 000 bp/2 000 bp，CK1为阳性对照，CK2为阴性对照，HH为华航丝苗，FD为福稻B，FN为福农A。
Figure 2. Analysis on rice blast resistance genes
M: Marker 1 000 bp/2 000 bp; CK1: positive control; CK2: negative control; HH: Huahangsimiao; FD: Fudao B; FN: Funong A.
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图 3 稻瘟病抗性基因的PCR扩增
M为Mark
10000 bp，FN为福农A， HH为华航丝苗，FD为福稻B。Figure 3. Amplification of rice blast resistance genes by PCR
M: Mark
10000 bp, FN: FunongA , HH: Huahangsimiao, FD: FudaoB.![]()
图 4 稻瘟病抗性基因Pid3和Pid2的序列比对
方框内为碱基差异位置。
Figure 4. Sequence alignment of blast resistance genes Pid3 and Pid2
Position of base difference showed in box.
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图 5 稻瘟病抗性基因的表达分析
*表示差异显著（P≤0.05）, **表示差异较显著（P≤0.01）, ***表示差异极显著（P≤0.001）。
Figure 5. Expressions of rice blast resistance genes
*: Significant difference ( P≤0.05); **: extremely significant difference ( P≤0.01); ***: very extremely significant difference (P≤0.001).
表 1 PCR及qRT-PCR引物
Table 1 Primers for PCR and qRT-PCR
引物
Primers引物序列（5′-3′）
Primer sequence（5′-3′）片段大小（抗/感）
Fragment size（Resistance/Susceptibility）/bp参考文献
ReferencePibdom F：GAACAATGCCCAAACTTGAGA 365 (R) /无 (S) [9] R：GGGTCCACATGTCAGTGAGC Pi9 F：GCTGTGCTCCAAATGAGGAT 291 (R) / 397 (S) [10] R：GCGATCTCACATCCTTTGCT Pi5 F：ATAGATCATGCGCCCTCTTG 206 (R)/307 (S) [10] R：TCATACCCCATTCGGTCATT Pi54 F：CAATCTCCAAAGTTTTCAGG 216 (R)/359 (S) [11] R：GCTTCAATCACTGCTAGACC Pita F：CTCCCTTGTTCGGTCAAAAA 467 (R)/850 (S) [10] YL155：AGCAGGTTATAAGCTAGGCC R：CCACATTGATGAAGCCCATA Pia F：GCGACTGACACTTTCAATAGC 175 (R)/206 (S) [12] R：CGGTAGAGCAATTTAGAAGCAG Pigm F：CAGAGCAGTAACAAACCCTA 750 (R)/ 1800 (S)[13] R：TCCGCAAGATCAACATTC Pit F：ATGATAACCTCATCCTCAATAAGT 733(R)/无 (S) [14] R：GTTGGAGCTACGGTTGTTCAG Pid3 F：TACTACTCATGGAAGCTAGTTCTC Bam H I, 148 (R)/ 178 (S) [15] R：AGCACTTCTTGACTACTGTCTGCCT Pi2 F：CAGCGATGGTATGAGCACAA 450 (R)/ 282 (S) [10] R：CGTTCCTATACTGCCACATCG Pi37 F：TCTTGAGGGTCCCAGTGTAC 1149 (R)/无(S)[16] R：CGAACAGTGGCTGGTATCTC Pid2 F：GCGTCGAAGATGTCCTGAAGCTCA 629(R)/无 (S) [17] R：GGCAGTCGTATTGCTGTGAA Pi5-DNA F: CCTTCTCTCTTCTCGTTCTCCTATTTCACA 5672 R: CAGTTGGTTTCTTGTAGGATTACAGGTCAGT Pia-DNA F：ACATTTTAGTCAACTCGCCTGTTCTTTT 2597 R：CAATCAGAAAGCAACAGGTCCAAATAAC Pib-DNA F：ACAAAATCCATTCAAAAATAGAACAGAGCA 5532 R：CACAGCCCCTCGGGTCCACAT Pid3-DNA F：AAGCGAGAAGGAAGTAACACCCAAGG 2865 R：AAGAATGAATGTCCTGACTGAAACCAACT Pid2-DNA F：CTGGGTTTGAAGAAAAGAATAAAGGGAGTG 3847 R：TGAAAATGATACTGAAAGGTCTGATGAAAA Pi5-qPCR F：TTCTGCTCGCTATCCAATCCAATG 173 R：TTTCTGTATGATGTTGTTTGCTTCTCCTC Pia-qPCR F：CCAGCCACTTGCTCTTGTTACCATAG 134 R：GCCGCATCCTTTCAAGTGTTTTATCA Pib-qPCR F：GGACAAGTGTTGGTGCTTCGGAG 176 R：CCTTGGGCTTTGATAAACACCGCT Pid3-qPCR F：AAGCAGTGGAGGTCGCCAAGTC 138 R：CGTCCTTGAACCGCTCGGCT Pid2-qPCR F：ACTAACTTCTTCCCTCCTGCGGCT 175 R：AAGATGCGAAACGAGTTGTATTCCC Actin150 F：AGTGTCTGGATTGGAGGAT 147 R：TCTTGGCTTAGCATTCTTG 
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表 2 抗病虫基因分析结果
Table 2 Analysis on disease and insect resistance genes
基因名称
Genes染色体
Chromosome表型
Phenotype探针类型
Probe type福农A
FunongA福稻B
FudaoB华航丝苗
Huahangsimiaoxa13 8 白叶枯抗性 单倍型 0.08 0.08 0.22 Xa21 11 白叶枯抗性 单倍型 1.00 1.00 1.00 Xa23 11 白叶枯抗性 单倍型 0.07 0.10 0.07 xa5 5 白叶枯抗性 单倍型 0.35 0.31 0.35 Xa7 6 白叶枯抗性 单倍型 0.11 0.44 0.11 Rymv1 4 抗黄色斑驳病毒病 SNP √ √ √ STV11 11 持久性抗水稻条叶枯病毒 SNP √ √ Bph14 3 褐飞虱抗性 单倍型 0.48 0.55 0.34 Bph15 4 褐飞虱抗性 单倍型 0.16 0.16 0.16 Bph18 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.69 0.59 0.69 Bph26 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.52 0.43 0.52 Bph6 4 褐飞虱抗性 单倍型 0.62 0.62 0.62 Bph9 12 褐飞虱抗性 单倍型 0.40 0.28 0.40 表格中探针类型为“SNP”的基因，样品编号下方的“√”表示与代表品种基因型一致，空格表示未检测到相关基因；表格中探针类型为“单倍型”的基因，样品编号下方的数字表示与标准样对比的相似度，“1.00”表示与标准样相似度达100%，样品中存在该基因。
For genes with probe type "SNP", a "√" sign under the code indicates a genotype consistent with reference, while without a sign, no related gene detected. For genes with probe type "haplotype"，number represented similarity to reference sequence, and "1.00" indicates a 100% similarity to reference as gene existed in the sample.
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