Effects of Mushroom Discards and Foliar Fertilizer on Growth and Kinsenoside Content in Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl.
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摘要: 通过正交试验设计，分析菌糠有机肥、SODm叶面肥及两者的施用时间对福建金线莲生长指标（株高、叶片数、气生根数、全株鲜重和产量）和金线莲苷含量的影响。结果表明：适时施用菌糠有机肥及SODm叶面肥可促进金线莲的生长，提高其产量，平均增产比达12.38%；三因素对金线莲苷的含量有明显的提高作用，影响顺序为：菌糠有机肥>施用时间> SODm叶面肥倍数。建立了福建金线莲林下仿野生的最优方案，即：定植后第150 d，施用菌糠有机肥（2.0 kg·m-2）和SODm叶面肥（150倍），可同时获得较高的产量和金线莲苷含量。Abstract: An orthogonal experiment was conducted to explore the effects of addition of mushroom discards in soil at varied rates, spraying of SODm (a foliar fertilizer) on leaves, and fertilization time on the growth indices (i.e., plant height, leaf count, aerial root number, plant fresh weight, and product yield) and kinsenoside content in Anoectochilus roxburghii (Wall.) Lindl. The results indicated that timely application of mushroom discards in soil and SODm spraying on leaves promoted the growth of A. roxburghii and increased the harvest by 12.38%on average. The factors that significantly increased the kinsenoside content in the plants were in the order of mushroom discards > application time > SODm dilution rate. The optimal fertilization under a cultivation test with simulated wilderness conditions was determined to consist of the addition of 2.0 kg mushroom discards per m2, foliar feeding with 150x dilution of SODm, and harvesting the plants 150 days after the treatments.
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在规模化畜禽养殖过程中，由于植物性饲料中Cu、Zn的含量较低，不能满足动物的营养需求，通常在饲料中需添加富含Cu、Zn元素的矿物质添加剂以提高饲料利用率[1-2]，然而畜禽对这些重金属的消化吸收利用率低，研究表明75%~99%的重金属未被利用而随畜禽粪便排出体外[3-4]，使得猪粪中重金属含量提高。据Cang调查研究发现，猪粪中Cu、Zn含量高达1 726.3、1 505.6 mg·kg-1[5]。另有学者研究发现长期施用沼液或直接排入水体、土壤或水体中铜、锌含量明显升高，会严重污染环境，甚至还会破坏生态系统[6]。因此，亟待开展对规模化养猪场沼液Cu、Zn等重金属污染治理的研究。
重金属不易被生物降解，且处理工艺复杂、费用高，是污水处理中的难题[7-8]。近年来众多研究者利用水生植物的根茎叶可以吸附和富集水中的重金属离子[9]，或降低污染物中的重金属毒性等特点[10]，将其作为重金属污染治理的研究手段加以广泛应用。一般而言，因沉水植物更多地依赖其茎叶从水中吸收重金属，相比漂浮植物和挺水植物对水体重金属有更好的吸附与富集效果[11-13]。目前沉水植物去除重金属的研究较多局限于室内模拟阶段的静态试验，对于沉水植物持续性的吸附重金属研究较少，单独针对沼液中Cu、Zn重金属吸附研究更为罕见。本研究利用多年生沉水植物狐尾藻，具有较强适应性、耐污能力及对重金属吸收积累能力等特点[14-15]，开展在半动态进出水量条件下，探讨不同水力停留时间狐尾藻对生猪养殖场沼液Cu、Zn重金属的富集能力差异，旨在为沼液处理的工程应用提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
狐尾藻取自福清市某人工湿地，其主要成分含量指标如表 1所示。供试沼液来源于福建省福清市某生猪养殖场，其主要污染物含量见表 2。
表 1 狐尾藻主要成分含量指标Table 1. Chemical composition of M. spicatum含水率/% 有机质/% 全氮/% 全磷/% 全钾/% Cu/(mg·kg-1) Zn/(mg·kg-1) 90 69.23 3.95 0.82 1.53 3.12 66.42 表 2 供试沼液的特性Table 2. Characteristics of biogas slurry used for experiment沼液水质指标 COD/(mg·L-1) DO/(mg·L-1) NH4+-N/(mg·L-1) TP/(mg·L-1) Cu/(mg·kg-1) Zn/(mg·kg-1) pH 含量 4165 3.15 983.75 18.98 52.44 250.08 7.42 1.2 试验方法
选取福清市某人工湿地长势良好的狐尾藻植株，截取顶枝(10 cm，外形基本一致)，清洗干净放入试验培养箱。培养箱选用直径36 cm、高为50 cm的塑料圆桶。水培试验设置处理组(Z0、Z1、Z2)用5%沼液水培，每个培养箱加受试液40 L，设置水力停留时间分别为Z2(20 d)、Z1(40 d)和Z0(60 d)3个处理，其对应每日进出沼液量为2.0、1.0、0.5 L，CK为对照，除了补充蒸发量，不进行进出水处理，其他处理同处理组，每个处理设3次重复。
上述每日进出水，皆为沼液原液。每隔3 d用蒸馏水补充由蒸腾损失的水分，每7 d测定1次水样，并记录其生长状况，植物在各水力停留时间结束后收获整株植物，用去离子水清洗、晾干。将植物在105℃下杀青30 min，再在70℃下烘干至恒重，测量干重，并粉碎过筛，供分析测定用。
1.3 各项生理指标的测定方法
(1) 狐尾藻生物量用鲜重表示，用吸水纸快速吸干植株表面水分，采用称重法测定；(2)狐尾藻干物质中的养分N、P、K含量测定：全氮用凯氏定氮法，全磷用氢氧化钠熔融-钼锑抗比色法测定，全钾用氢氧化钠熔融-火焰光度法测定；(3)将烘干植物样品在研钵中研碎，经HNO3-HClO4法消煮，用原子吸收分光光度计测定植株Cu、Zn的含量；(4)受试液检测出水水质相关参数(包括CODCr、pH、NH4+-N和总磷)。CODCr采用重铬酸钾滴定法(GB11914-89)测定；NH4+-N用纳氏试剂光度法测定；pH值用雷诺pH计现场测定；总磷利用钼酸铵分光光度法(GB11893-89)。
1.4 数据处理与统计分析
试验数据应用origin 8.0软件和SPSS 19.0统计软件进行统计分析。
生物量统计，按照试验每桶生物量统计分析。
有机质、氮、磷、钾增长率计算公式如下：
η=C1−C0C0×100% 式中，C1为试验结束植株体内有机质、氮、磷、钾含量/%；C0为试验前植株体内有机质、氮、磷、钾含量/%；η为植株试验前后体内有机质、氮、磷、钾增长率/%。
2. 结果与分析
2.1 不同处理狐尾藻生长状况
2.1.1 不同处理狐尾藻生物量
植株的生物量是反应植株生长情况的有效指标[16]。一方面，由于沼液中富含丰富的氮、磷、钾和促进植物生长的维生素、氨基酸等营养物质[17]，能够为植株提供养分，植株在沼液中生长可能受到促进作用；另一方面，沼液中CODcr、氨氮、总磷等有机污染物含量较高，且狐尾藻对Cu、Zn含量耐受能力有限，氨氮含量和重金属含量对植株的叶绿素、一些酶(抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等)有不同程度的胁迫作用[18-20]，植株在沼液中的生长也可能受到抑制影响。图 1为不同水力停留时间下，对照和处理组狐尾藻生物量的变化情况。
Z0和Z1处理狐尾藻的各阶段尤其是试验中后期，其生物量显著高于CK和Z2处理。Z0、Z1和Z2处理试验期间，可达到的最高生物量依次为：1 475.00、415.00、233.33 g，分别是CK处理最大生物量199.17 g的7.40、2.08、1.17倍。
2.1.2 不同处理狐尾藻有机质及养分含量变化
植株体内有机质及养分(氮磷钾)含量，是表征植株对环境中肥效成分吸收效果的重要指标，其中氮、磷、钾是植物需要量和收获时带走量较多的营养元素。图 2表明，各处理中有机质含量增长率大小顺序为：Z1>Z0>Z2>CK，处理组各有机质含量增长率都大于对照，其中增长率最大的为Z1处理，达17.62%；各处理中全氮含量增长率大小顺序为：Z1>Z2>Z0>CK，处理组全氮含量与对照存在显著差异，Z1和Z2处理全氮含量增长率相近，分别为94.68%和93.92%，这可能是受沼液氨氮含量影响；各处理中全钾含量增长率大小顺序为：Z0>Z1>Z2>CK，处理组与对照间存在显著差异，全钾含量增长率最大的是Z0处理，可达23.55%；各处理中全磷含量增长率大小顺序为：Z2>Z1>Z0>CK，处理组全磷含量皆高于对照，最高的为Z2处理(17.07%)，全磷含量增长率相比有机质、全氮和全钾偏低，可能源于沼液中磷含量相比氮含量较少，及狐尾藻对沼液磷的吸收能力有限。处理组狐尾藻体内有机质和氮磷钾含量都有所提高，只是增长率各有差异。其中，各处理全氮含量增长率最大。
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2.2 不同处理狐尾藻对沼液Cu、Zn的富集效果
Tomsett等[21]认为，植株对重金属的抗性是指在某一特定含量较高的重金属环境中植株不会出现生长率下降甚至死亡的毒害症状。植株可以通过耐性和避性获得对重金属的抗性。避性是指一些植株通过外部基质的保护作用，会吸收环境中含量高的重金属，进而不受毒害。植株在避性作用下，对重金属富集效果较差。相反，耐性是指植株具有某种特定的生理基质，可使植株在高浓度的重金属环境中正常生长，不受毒害，植株体内也具有较高的重金属含量[12, 22]。
2.2.1 不同处理狐尾藻对沼液Cu的富集效果
Cu是植株生长的必需微量元素之一，既是多种氧化酶的成分也是光合作用的电子传递体系，适量有利于植株氧化还原与光合作用，但当环境中Cu含量超过某一临界值时，则会引起植株体内的新陈代谢过程紊乱，抑制其生长发育，甚至导致植株死亡。图 3为不同水力停留时间下，狐尾藻对沼液Cu的积累量和沼液中Cu的去除率。各处理对Cu积累量大小顺序为：Z0>Z2>Z1>CK，Z0处理与其他处理存在显著差异，对Cu积累量最大，达7.66 mg·kg-1，其对沼液水体的去除率也最大，达14.61%，其次是Z1和Z2处理，Cu积累量分别为7.04、6.97 mg·kg-1，这两者对Cu的富集能力差异不显著。结合狐尾藻生物量的变化可得出，当水体环境中的Cu含量为超过26.22 mg·kg-1时，狐尾藻叶片出现不同程度脱落现象，新根生长速度明显减缓，甚至引起部分处理狐尾藻生物量降低。
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图 3 不同处理狐尾藻对Cu积累量与去除率注：图中狐尾藻对Cu重金属积累量均扣除空白重金属含量。Figure 3. Accumulation and removal rate on Cu by M. spicatum in treatments2.2.2 不同处理狐尾藻对沼液Zn的富集效果
Zn在植株的生长过程中，不仅可以增强植株的光合作用、促进和加强碳水化合物积累，还具有促进吲哚乙酸等植物生长素的形成、植株氮素代谢及增强植株抗逆性等作用[12]。图 4为不用处理狐尾藻对Zn积累量及沼液Zn去除率。由图可知狐尾藻对Zn的富集能力远高于对Cu的富集，这与李巧云等的研究结果相似[23]。各处理对Zn的积累量大小关系为：Z0>Z1>Z2>CK，Z0处理对Zn吸附量最大，达64.18 mg·kg-1，去除率可达25.66%；其次是Z1和Z2处理，分别为39.10、13.61 mg·kg-1。各处理对沼液Zn的吸附效果优于对Cu的，一是因为沼液中Zn含量远高于Cu的含量；二可能是狐尾藻对Zn的耐受值高于Cu，Zn对狐尾藻的胁迫作用小于Cu。
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图 4 不同处理狐尾藻对Zn积累量与去除率注：图中狐尾藻对Zn重金属积累量均扣除空白重金属含量。Figure 4. Accumulation and removal rate on Zn by M. spicatum in treatments2.3 不同处理狐尾藻对沼液净化效果
图 5为不同处理狐尾藻对沼液的净化效果，在各处理试验结束后，对沼液都具有一定的净化效果，表现为对水体CODCr、氨氮和总磷的去除能力。由图 5可知，Z1处理对沼液的净化效果最好，CODCr、氨氮和总磷去除率分别可达92.40%、92.03%、74.39%，最终出水水质CODCr、氨氮和总磷依次为316.67、78.44、4.86 mg·L-1，达到GB18596-2001《畜禽养殖业污染物排放标准》的排放标准，而其他处理均未能达到标准排放，还需进一步研究。
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图 5 不同处理狐尾藻对沼液的净化效果Figure 5. Biogas slurry purification by M. spicatum with treatments2.4 不同处理水体pH值变化
图 6为试验周期各处理水体pH值变化，处理组的pH值波动幅度小于对照组，各组pH值大小顺序为：Z0 < Z1 < Z2 < CK。再结合图 1不同处理狐尾藻的生长量进行说明，CK处理水体pH值整体高于处理组，波动范围为7.32~9.56，而其生物量低于试验周期内各处理组；Z0处理水体pH值最小，波动范围为7.09~7.32，其生物量也是所有处理中最大的，由此也可以说明狐尾藻对pH值的适应范围较大，但是随着pH值的不断增加，会影响狐尾藻的生物量的积累，这与任南、李恒等的研究结果一致[24-25]。其主要原因来自于两方面：一是水体pH值变化会影响植株体内酶的活性，进而影响光合作用，随着pH值升高，其光合作用强度会降低[26]；二是pH值是影响重金属植株吸附的关键因素之一，且对大多数吸附过程而言，水体环境pH值是影响植株吸附量的决定因素[27]。pH值会影响植株吸附功能团的解离、重金属溶液的水解、有机无机配位体的络合、沉淀等反应及植株吸附的特异性和有效性[28]。对于适量的Cu、Zn含量是植株的生长必需微量元素，对植株的生长发育起着重要作用，pH值影响植株对Cu、Zn等重金属元素的吸收，间接影响植株生物量的变化。
2.5 狐尾藻安全性分析
试验结束收获的狐尾藻，含水率为91.06%~95.53%；有机质、氮、磷、钾含量分别为：72.34%~81.43%、4.54%~7.69%、0.85%~0.96%、1.56%~1.89%；狐尾藻体内Cu、Zn重金属含量分别为：6.76~10.78、77.63~130.60 mg·kg-1、铜锌含量符合GB26419-2010[29]和我国农业行业标准NY929-2005[30]的标准，因此狐尾藻收割后可以作为青饲料加以利用，以避免二次污染。
3. 讨论与结论
(1) 从植株生物量指标可以看出，各处理随着试验进行，生物量呈现先增后减趋势，其中Z0处理的增长速率明显高于其他处理。主要是随着周期加长，每日进出水，狐尾藻水培环境中沼液含量越来越高，沼液供给狐尾藻的营养和沼液中的高含量污染物对狐尾藻的影响两者间的作用不平衡，沼液浓度较低时，狐尾藻不断吸收沼液中的营养，促进生长，生物量增加；沼液含量不断增加时，逐渐超过狐尾藻的耐受能力，沼液对狐尾藻的损害作用加大，导致狐尾藻叶黄叶落、根枯根腐，引起狐尾藻生物量的降低。由此也表明，不同水力停留时间，对狐尾藻的生长影响不一，合适含量沼液有利于狐尾藻生物量的增加。
(2) 在不同水力停留时间，狐尾藻对沼液中Cu、Zn吸附积累量不同。不同的停留时间(每日进出水量不同)下，随着试验进行，沼液含量从一样到不同，水体中Cu、Zn的含量亦是如此，狐尾藻对其积累量也存在差异。其中处理组狐尾藻体内Cu、Zn含量均高于对照，处理组生物量也高于对照，说明不同水力停留时间下，狐尾藻对沼Cu、Zn具有一定的耐性，其中对Zn的吸附能力大于Cu。当水力停留时间为60 d，即Z0处理对沼液Cu、Zn积累量最大，分别为7.66、64.18 mg·kg-1。其次是水力停留时间分别为40、20 d的Z1、Z2处理。狐尾藻体内Cu、Zn含量符合GB26419-2010[29]和我国农业行业标准NY929-2005[30]，因此狐尾藻收割后可以作为青饲料加以利用，以避免二次污染。
(3) 狐尾藻对沼液具有较好的净化能力，植株通过吸收水培环境中的有机质、氮、磷、钾等转化合成营养物质，供自身生长需要，由此沼液中的COD、有机物、氮、磷等物质得到降解，达到净化沼液作用。当水力停留时间为40 d(Z1处理)时，对沼液的净化效果最好，CODCr、氨氮和总磷去除率分别可达92.4%、92.03%、74.39%，最终出水水质CODCr、氨氮和总磷依次为316.67、78.44、4.86 mg·L-1，达到GB18596-2001《畜禽养殖业污染物排放标准》的排放标准，而其他处理均未能达到标准排放，还需要进一步研究。
(4) 因而在养殖场以沼液净化为主时，可以选择水力停留时间为40 d的Z1处理，在保证一定生物量同时，对沼液CODcr、氨氮及总磷的去除效果最好，且对沼液Cu、Zn吸附效果较好。
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表 1 三因素三水平正交试验设计
Table 1 Three factors and three levels of orthogonal design
处理 因素 A B C 1 1 1 1 2 1 2 2 3 1 3 3 4 2 1 2 5 2 2 3 6 2 3 1 7 3 1 3 8 3 2 1 9 3 3 2 
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表 2 栽培措施对金线莲生长的影响
Table 2 Effect of cultivation factors on growth of A. roxburghii
处理 株高/cm 叶片数 气生根数 全株鲜重/g 产量/g 1 6.93±0.55* 4.33±0.58 3.67±0.58 0.98±0.07* 767.27±61.51* 2 6.27±1.16 3.67±1.53 3.67±0.58 0.76±0.05 593.95±30.27 3 6.33±0.35 4.00±1.00 3.67±0.58 0.77±0.05 607.04±28.07 4 6.53±0.38 4.00±1.00 4.00±1.00 0.74±0.04 583.68±29.94 5 6.30±0.44 4.00±1.00 4.00±1.00 0.72±0.07 568.17±60.06 6 7.20±0.26* 3.67±0.58 4.33±0.58 0.75±0.03 591.74±28.88 7 6.47±0.50 3.67±0.58 4.00±1.00 0.78±0.02 609.82±9.51 8 8.10±0.56* 3.67±0.58 4.67±0.58 0.93±0.07* 732.93±52.09* 9 5.57±0.15 3.33±0.58 3.67±0.58 0.71±0.05 560.39±43.48 CK 5.93±0.51 3.33±0.58 3.67±0.58 0.71±0.05 555.17±44.28
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表 3 不同因素对金线莲生长的影响
Table 3 Effect of various factors on growth of A. roxburghii
类别 株高/cm 叶片数 气生根数 全株鲜重/g 产量/g A B C* A B C A B C A B C A B C K1 6.51 6.64 7.41 4.00 4.00 3.89 3.67 3.89 4.22 0.84 0.83 0.89 656.09 653.59 697.31 K2 6.68 6.89 6.12 3.89 3.78 3.67 4.11 4.11 3.78 0.74 0.80 0.74 581.20 631.68 579.34 K3 6.71 6.37 6.37 3.56 3.67 3.89 4.11 3.89 3.89 0.81 0.74 0.76 634.38 586.39 595.01 R 0.20 0.52 1.29 0.44 0.33 0.22 0.44 0.22 0.44 0.10 0.09 0.15 74.89 67.20 117.97 影响顺序 C>B>A A>B>C A=C>B C>A>B C>A>B 最佳组合 A1B2C1 A1B1C1或A1B1C3 A2B2C1或A3B2C1 A1B1C1 A1B1C1
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表 4 正交试验直观分析结果
Table 4 Intuitive analysis of data on kinsenoside content in orthogonal experiment
处理 A施用时间/d B菌糠有机肥用量/(kg·m-2) C SODm叶面肥倍数 金线莲苷含量/% Ⅰ Ⅱ Ⅲ 均值 1 1(第120) 1(2.0) 1(150) 5.37 6.03 5.97 5.79 2 1(第120) 2(3.5) 2(200) 3.00 2.86 3.23 3.03 3 1(第120) 3(5.0) 3(250) 3.11 3.57 3.34 3.34 4 2(第150) 1(2.0) 2(200) 6.09 5.89 6.17 6.05 5 2(第150) 2(3.5) 3(250) 4.74 4.09 4.82 4.55 6 2(第150) 3(5.0) 1(150) 4.07 4.34 4.76 4.39 7 3(第180) 1(2.0) 3(250) 5.94 5.72 5.98 5.88 8 3(第180) 2(3.5) 1(150) 4.52 4.80 3.97 4.43 9 3(第180) 3(5.0) 2(200) 3.63 3.09 3.39 3.37 K1 4.05 5.91 4.87 - - - - K2 5.00 4.00 4.15 - - - - K3 4.56 3.70 4.59 - - - - R 0.95 2.21 0.72 - - - -
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表 5 方差分析结果
Table 5 Variance analysis of data on kinsenoside content in orthogonal experiment
方差来源 离差平方和(SS) 自由度(df) 均方(MS) F值 P值 显著性 因素A 1.337 2 0.669 26.710 0.036 * 因素B 8.584 2 4.292 171.453 0.006 ** 因素C 0.790 2 0.395 15.787 0.060 误差 0.050 2 0.025 - - 总和 10.762 8 - - -
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