ISSR Fingerprints and Genetic Variations of Sun-Cured Tobacco Germplasms
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摘要:目的 较为准确地揭示晾晒烟种质间的遗传关系，提高晾晒烟种质资源的利用率和育种效率。方法 利用ISSR分子标记技术对36份晾晒烟种质资源进行遗传多样性分析。结果 从100个ISSR引物中筛选出7条多态性好的引物，扩增出113个条带，其中91条多态性条带，多态性条带比例有80.5%；ISSR标记有效等位基因数（Ne）的平均值为1.64，Nei's基因多样性指数（H）的平均值为0.37，Shannon's信息指数（I）值的平均值为0.55，表明ISSR标记具有较高的多态性检测效率；聚类分析结果表明36份晾晒烟种质间的遗传相似性系数（GS）为0.74~0.91，品种间遗传多样性水平较低，以0.78处作为截值可以划分为5个组；数字指纹图谱可以较为有效地将供试材料进行区分。结论 ISSR标记适合用于构建晾晒烟的DNA指纹图谱，可以为晾晒烟的品种鉴定提供科学依据。Abstract:Objective This study was aimed to accurately reveal the genetic relationship among sun-cured tobacco germplasms, and improve the utilization and breeding efficiency of sun-cured tobacco resources.Method Genetic diversity of 36 sun-cured tobacco germplasms was analyzed using ISSR.Result From the samples, 113 DNA bands were amplified with 7 polymorphic primers selected from 100 ISSR primers. Among them, 91 bands (80.5%) were polymorphic. The average effective number of alleles (Ne), Nei's gene diversity index (H), and Shannon's information index (I) of the ISSR markers were 1.64, 0.37, and 0.55, respectively, indicating a high detection efficacy. The UPGMA analysis showed a low diversity among the germplasms with the genetic similarity coefficients (GS) ranging from 0.74 to 0.91. With the new method, the germplasms were clustered into 5 groups at the level of 0.78.The digital fingerprints effectively distinguish the germplasms.Conclusion The ISSR markers chosen for the DNA fingerprints of 36 sun-cured tobacco germplasms were appropriate for the otherwise difficult task of differentiating and identifying those genetically closely related varieties.
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Keywords:
- sun-cured tobacco /
- ISSR /
- fingerprint maps /
- genetic diversity
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0. 引言
【研究意义】除烤烟以外，以自然条件为主的晾晒结合或晾制方法调制的烟叶即为晾晒烟，具有高烟碱低焦油的特点，是加工混合型卷烟的重要原料。种质资源的收集、保存和利用工作是烟草种质研究的核心，但一些烟草种质难以根据形态学特征进行鉴别，这就容易出现同名异物或者同物异名的问题，严重阻碍了晾晒烟的育种研究，运用分子标记技术对晾晒烟种质进行遗传学分析，构建DNA指纹图谱，可以有效地进行品种鉴定，为后续的选育优良品种提供科学依据。【前人研究进展】传统上对烟草进行品种鉴定采用的是形态性状的观察分析，人为的误差大，鉴定周期长，稳定性和可靠性都较差。随着分子生物学的发展，一些学者也采用分子标记技术对烟草进行遗传变异分析，最开始更多地是运用RAPD[1-5]标记技术对少量的烟草品种进行了初步研究，较少涉及构建分子指纹图谱的研究，之后SSR[6-9]、SRAP[10-13]、SCoT[14]等分子标记技术越来越多地运用于烟草种质资源的研究中。【本研究切入点】ISSR将RAPD和SSR的优势结合起来，优点是操作简便、具有丰富的多态性和较好的稳定性，在植物的遗传多样性研究中被广泛地运用[15]。【拟解决的关键问题】本研究采用ISSR标记对36份晾晒烟种质资源进行遗传多样性和亲缘关系分析，并构建DNA指纹图谱，为晾晒烟的品种选育以及保护提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
本试验中的36份烟草材料采集于广西亚热带作物研究所烟草资源圃(表 1)。
表 1 供试晾晒烟材料Table 1. Selected sun-cured tobacco germplasms编号Code 名称Name 来源Collectionsite 类型Type 1 贵港土烟1号Guigang No. 1 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 2 贵港土烟2号Guigang No. 2 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 3 贵港土烟3号Guigang No.3 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 4 横县土烟1号Hengxian No.1 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 5 柳城土烟1号Liucheng No. 1 广西柳城Liucheng Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 6 凌云土烟1号Lingyun No.1 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 7 全州土烟1号Quanzhou No. 1 广西全州Quanzhou Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 8 三里烟Shanglin 广西上林Shanglin Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 9 资源土烟1号Ziyuan No. 1 广西资源Ziyuan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 10 阳朔土烟1号Yangshuo No. 1 广西阳朔Yangshuo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 11 临桂土烟1号Lingui No. 1 广西临桂Lingui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 12 临桂土烟2号Lingui No. 2 广西临桂Lingui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 13 凌云土烟2号Lingyun No 2 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 14 凌云土烟3号Lingyun No 3 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 15 环江土烟3号Huanjiang No. 3 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 16 环江土烟1号Huanjiang No. 1 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 17 环江土烟2号Huanjiang No. 2 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 18 马山土烟1号Mashan No 1 广西马山Mashan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 19 横县土烟2号Hengxian No.2 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 20 平果土烟2号Pingguo No.2 广西平果Pingguo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 21 平果土烟1号Pingguo No.1 广西平果Pingguo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 22 横县土烟3号Hengxian No.3 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 23 凌云土烟4号Lingyun No.4 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 24 安太土烟1号Antai No.1 广西融水Rongshui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 25 安太土烟2号Antai No.2 广西融水RongshuiGuangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 26 凌云土烟5号Lingyun No.5 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 27 环江土烟4号Huanjiang No.4 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 28 马山土烟2号Mashan No.2 广西马山Mashan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 29 平乐土烟1号Pingle No.1 广西平乐Pingle Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 30 平乐土烟2号Pingle No.2 广西平乐Pingle Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 31 河池土烟1号Hechi No.1 广西河池Hechi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 32 都安土烟1号Du′an No.1 广西都安Du′an Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 33 都安土烟2号Du′an No.2 广西都安Du′an Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 34 靖西土烟1号Jingxi No.1 广西靖西Jingxi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 35 德保土烟1号Debao No.1 广西德保Debao Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 36 靖西土烟2号Jingxi No.2 广西靖西Jingxi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 1.2 主要实验设备
台式冷冻离心机(德国eppendorf 5430R)、梯度PCR仪(德国BiometraEasyCycler Gradient)、全自动化学发光/荧光图像分析系统(上海天能5200Multi)。
1.3 主要实验试剂
生工生物有限公司制备的dNTP、ddH2O、29:1 30%双甲叉丙烯酰胺、10%过硫酸铵、Taq DNA聚合酶、TEMED、5XTBE，博日科技有限公司制备的BioFasSpin Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒，参考加拿大哥伦比亚大学(UBC)提供的引物序列，生工生物有限公司合成了本实验所需的100条引物。
1.4 试验方法
1.4.1 DNA提取
试验材料是从烟草植株上选取的新鲜幼嫩无病害的叶片，DNA的提取使用的是BioFasSpin Plant Genomic DNA Extraction Kit试剂盒，DNA质量的检测使用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳，每孔上样1 μL，电泳30 min，120 V电压。
1.4.2 引物的筛选
对100条引物进行初筛的DNA模板选择1、21、31号种质资源，根据扩增出来的结果挑选多态性好、扩增条带数目多的引物，接着用初筛选取的引物对36份晾晒烟材料进行PCR扩增。
1.4.3 ISSR标记检测
ISSR-PCR反应体系参照覃剑峰[16]的方法，反应体系总体积为20 μL：2.00 μL10×buffer，50 ng(1 μL)模板DNA, Taq聚合酶的用量为4 U(0.8 μL)，0.6 μmol·L-1(1.2 μL)引物，0.75 mmol·L-1(0.6 μL)Mg2+，0.3 mmol·L-1(2.4 μL)dNTP，退火温度为52℃。
ISSR-PCR扩增程序：在94℃下预变性5 min；在94℃下变性30 s，在56℃下退火45 s，在72℃下延伸1 min，35个循环；最后在72℃下延伸5 min，在4℃下保存。
1.5 数据统计与分析
1.5.1 遗传多样性分析
PCR扩增得到的条带在电泳图谱上可以清晰辨认且重复出现的记为“1”，同一位置没有扩增出来或是无法清晰辨认的记为“0”，进而可以生成由“1”和“0”组成的矩阵。遗传多样性参数则是运用POPGENE1.32软件进行分析，计算多态性引物的Nei′s基因多样性指数(H)、Shannon’s信息指数(I)和有效等位基因数(Ne)以及总群体的基因流(Nm)和遗传分化系数(Gst)[17]。
1.5.2 聚类分析及相关性分析
品种间的遗传相似系数(GS)由NTSYS-pc2.1e软件中的Jaccard法计算得出，聚类分析采用SAHNC Clustering中的UPGMA法，绘制出树状聚类图；然后把聚类图转换成协表征矩阵，再运用Mxcomp程序对相似系数矩阵和协表征矩阵的相关性进行Mantel检测，计算得到相关系数r值；另外，以遗传相似系数为基础进行主坐标分析(principal coordinates analysis，PCOA)，绘制出二维平面散点分布图和三维空间图对聚类结果进行检验[17]。
1.5.3 构建数字指纹图谱
为了进一步提升数据的可靠性和准确性，从多态性引物的电泳图谱中挑选重复性和多态性好且清晰可辨的条带用于构建指纹图谱。每条引物根据“0-1”矩阵以不同谱带的组合绘制成指纹图谱的标准化图[17]。
2. 结果与分析
2.1 ISSR分子标记扩增结果分析
以1、21、31号种质资源的DNA作为模板对100条引物进行初筛，从中选择了7条扩增条带数目多，多态性较好的引物。试验结果显示，7条引物一共扩增出113个条带，其中引物扩增条带数最少为10条(引物825)，最多达到24条(引物855)，平均每个引物扩增出16.1个条带。在113个扩增带中，91个为多态性条带，多态性条带占80.5%，多态性条带最少为7条(引物809)，最多为23条(引物855)，平均多态性条带为13条，其中引物825扩增的多态性条带百分比为100%。
表 2 ISSR引物序列和扩增结果Table 2. ISSR primer sequences and amplifications引物编号No.Pri-mer 序列Primer sequences 多态性条带数Polymorphi-c bands 总条带数Total bands 多态性条带百分比The proportion of polymorphic bands/% 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 13 15 86.7 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 7 14 50.0 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 10 10 100 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 23 24 95.8 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 14 18 77.8 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 8 15 53.3 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A 16 17 94.1 平均数Mean - 13 16.1 80.5 总数Total - 91 113 - 2.2 晾晒烟ISSR标记的引物多态性分析
36份晾晒烟材料被筛选出的7个ISSR引物进行ISSR-PCR扩增，图 1为其中代表性扩增图谱。统计的各引物的多态性结果如下：各引物Nei′s基因多样性指数(H)的变化范围为0.14~0.49，平均值为0.37，H值最低的引物为889(0.14)，H值最高的引物为886(0.49)；各引物Shannon′s信息指数(I)值的变化范围为0.25~0.68，平均值为0.55，I值最低的引物为899(0.25)，I值最高的引物为886(0.68)；各引物有效等位基因数(Ne)的变化范围为1.17~1.95，平均值为1.64，Ne值最低的引物为899(1.17)，最高的引物为886(1.95)。由此可见，所筛选的7个ISSR引物具有较高的多态性检测效率。
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表 3 晾晒烟ISSR标记的多态性分析Table 3. ISSR genetated banding patterns on sun-cured tobacco germplasms引物编号No.Primer 有效等位基因数Effective number of alleles(Ne) Nei′s基因多样性指数Nei′s gene divesity(H) Shannon′s信息指数Shannon′s informaion index (I) 808 1.64 0.39 0.58 809 1.88 0.47 0.66 825 1.69 0.39 0.57 855 1.50 0.33 0.50 856 1.66 0.39 0.58 886 1.95 0.49 0.68 899 1.17 0.14 0.25 平均数Mean 1.64 0.37 0.55 2.3 基于ISSR标记的聚类分析
以ISSR标记的扩增结果作为基础，使用NTSYS-pc软件进行UPGMA聚类分析，获得36份晾晒烟种质的树状聚类图(图 2)。把聚类结果转换成协表征矩阵，并对相似系数矩阵和协表征矩阵之间的相关性进行Mantel检验。根据检验结果可以得出，这2种矩阵相关性极显著，其相关系数r=0.70，这个结果说明了晾晒烟种质间的遗传关系可以通过UPGMA聚类很好地体现出来。从图 2可以看出，晾晒烟种质间的遗传相似系数为0.74~0.91，ISSR分子标记可以将36份种质进行划分，在遗传相似系数(GS)在0.78处作为截值时，可以将种质分为5组。1组包括贵港土烟1号(1号)、贵港土烟2号(2号)、贵港土烟3号(3号), 2组还可以再划分为2A和2B两个亚组，2A亚组包括横县土烟1号(4号)、阳朔土烟1号(10号)、全州土烟1号(7号)、横县土烟2号(19号)、安太土烟2号(25号)、临桂土烟1号(11号)、环江土烟2号(17号)、凌云土烟3号(14号)、凌云土烟2号(13号)、环江土烟1号(16号)、临桂土烟2号(12号)、三里烟(8号)、凌云土烟1号(6号)、马山土烟1号(18号)、平乐土烟1号(29号)、凌云土烟5号(26号)、环江土烟4号(27号)、马山土烟2号(28号)、河池土烟1号(31号)、都安土烟1号(32号)、平果土烟2号(20号)种质，2B亚组包括平果土烟1号(21号)、安太土烟1号(24号)、横县土烟3号(22号)、凌云土烟4号(23号)、都安土烟2号(33号)、德保土烟1号(35号)、靖西土烟1号(34号)、靖西土烟2号(36号)，3组包括柳城土烟1号(5号)和环江土烟3号(15号)，4组仅有平乐土烟2号(30号)，5组仅有资源土烟1号(9号)。从图 2中还可以看出临桂土烟1号(11号)和环江土烟2号(17号)以及马山土烟2号(28号)和环江土烟4号(27号)这两组种质之间遗传距离很小，说明其遗传差异很小，有可能为相同的种质。
2.4 晾晒烟种质的遗传变异分析
样品间的Jaccard遗传相似性系数(GS)由NTSYS-pc软件计算，可以得到供试种质相似系数矩阵。计算结果显示，36份晾晒烟种质间的GS值为0.65~0.91，平均GS值为0.80，表明供试种质间有着相似的遗传背景又存在着一定的差异。其中，贵港土烟2号(2号)和环江土烟4号(27号)之间的GS值最大，为0.91，亲缘关系最近，遗传差异最小；环江土烟3号(15号)和德保土烟1号(35号)之间的GS值最小，为0.65，亲缘关系最远，遗传差异最大。由此可见，供试的36份晾晒烟种质间的遗传差异较小，遗传相似系数比较高，说明供试种质的遗传基础较为狭窄，遗传多样性比较低。供试晾晒烟总群体的遗传分化系数(Gst)和基因流(Nm)通过POPGENE1.32软件进行分析，分析结果如下：Nm值为2.93，Gst值为0.15，可以认为供试晾晒烟种质资源的遗传分化不显著，群体间基因交流程度较小。
2.5 晾晒烟种质的主坐标分析(PCOA)
以Jaccard遗传相似性系数为基础，对供试晾晒烟种质进行主坐标分析，在坐标图中不同种质的位置能反映出它们之间的亲缘关系(图 3)。分析结果表明，前3个主坐标分别解释11.25%、8.84%、8.61%的品种间相关性。主坐标分析可以从不一样的层面和方向更直观地反映36份晾晒烟种质间的遗传关系和遗传差异，对聚类结果可以起到相互补充，相互验证的作用。
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2.6 晾晒烟数字指纹图谱的构建
为了将供试材料有效地进行区分，且具有较强的说服力，构建了数字指纹图谱(表 5)，表 4则是筛选出的7条遗传多态性较好的引物及其区分开的晾晒烟种质，从表中可以看出引物855可以将供试的36份种质区别开来。
表 4 7条引物区分开的晾晒烟种质Table 4. Sun-cured tobacco germplasms differentiated by using 7 primers引物Primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 808 + + + + 809 + + 825 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 855 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 856 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 886 + + + + + + + + 899 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 注：1~36号材料编号同表 1，“+”表示该种质可被鉴定出来。
Note：1-36 are the same as Table 1, “+”said the germplasm could be identified.表 5 36份晾晒烟种质的ISSR数字指纹图谱Table 5. ISSR fingerprints of 36 sun-cured tobacco germplasms材料编号Code 808 809 825 855 856 886 899 1 000001100111010 11101101111111 1001111010 101010000100010101011101 101000101011101000 101011111111010 00000000000010100 2 000000011101010 11101101111111 1001111101 010101000100000000010101 101000101010101000 101010111101110 00000000000010000 3 100011100101100 11101101111111 1001111111 000001000100010100010101 101000011010001000 111110111111010 00010000000010100 4 100011100101100 11101011111111 0011011000 110000111100110000010101 101000101111101000 111110111111010 00000000000011000 5 100011100101100 11101011111111 1101011011 000000100011001100110101 101000101010101000 111010111111010 01000000000010010 6 000011100101100 11101011111111 1001010001 010000101100010000000101 101000100110101000 111111111101010 00000000001011000 7 100011100101100 11101011111111 1000011100 010000111100110100010101 111101011011001000 111110111111000 00000000000010000 8 100011100101100 11101011111111 0000011000 110000111100000000000011 101010001011101000 111010111111000 10001000000010000 9 111110000111111 11101011111111 0100011001 010000111101110100010101 101010001010101000 001110111101010 00000000000010000 10 100011100101100 11101011111111 0000011000 110000111100110100010001 101000111011001000 001010111101010 00000000000010000 11 100011000101100 11101011111111 1100000001 110000011100110100010101 101000111010101000 101110111101010 00000000000010000 12 100011100101100 11101111111111 0001000000 110000101101001100110001 101000111011001000 101110111111010 00100010000010000 13 100011100101100 11101011111111 1100011000 110000000000110100010101 101000111011011100 101110111101010 10100000000011010 14 100011100101100 11101011111111 1100001101 110000000100000100010101 101010001010001000 101110111101010 00100000100010000 15 100011100101100 11101011111111 1100001011 110000000001001010101101 101010001010001111 101110111101010 00001000000010010 16 000011100101100 11101011111111 0000001010 110000000110110100010101 101010001111111100 101110111111011 00000000000010000 17 100011100101100 11101011111111 1100001011 110000101100100100010001 101010111010101000 101110111111010 00000000001010000 18 100011100101100 11101011111111 0000001100 000000000000000000000101 101000111110101000 001111111101010 00000000000010000 19 100011100101100 11101011111111 0010001110 110001111100110100010101 101000111010001000 101111111101010 10000100100010000 20 100011100101100 00110011111110 0010001100 000000011101110100010001 101010111010001000 101111111101010 00000000000010000 21 100011100101100 11110011111111 1111101010 000000011100000100000001 101010111011001000 101110111101010 10001001100010000 22 100011100101100 11110011111111 1111101011 000001010001010101010101 101000111011001000 101110111101010 01100100000110000 23 100011100101100 11110011111111 1111111011 110001011001110101010101 101000111011001000 101110111101010 00010101011110000 24 100011100101100 11110011111111 1111001011 110001010111010000000001 101000111011001000 101110111101010 00000010000010000 25 100011100101100 11101011111111 1111111010 110001011110110100010001 101000001110001000 001010111101010 00000000000010000 26 100011100101100 11101011111111 0001111101 110001011000000000000001 101000000111101000 001111111101010 00000000000010000 27 100011100101100 11101011111111 1101001101 010001011101000000000001 101010111011001000 001111111111010 00000000000010000 28 100011100101100 11101011111111 1101101101 110000111000010000000001 101010111111111000 001111111111010 00000000000010000 29 100011100101100 11101011111111 0001101100 000000111010000000000001 101010111110001000 001111111111010 00000000000010000 30 100011100101100 11101011111111 1101111011 000000111010010100010001 101110000110001000 001111111101010 00000111011110000 31 100011100101100 11101011111111 1101111011 100000111010001001100101 101010111111001000 101111111101010 00000000000010000 32 100011100101100 11101011111111 1101111011 110000111000010101010101 101000111110111000 101111111101010 00000000000010000 33 100011100101100 11101011111111 0001101010 110000111000010101010111 101000111111111000 001010111101010 00000110000010000 34 100011100101100 11110011111111 0111111010 110000101010010011001111 101000111111111000 101010111101010 00010000000010000 35 100011100101100 11110011111111 0011111010 000000111000000101010111 101000111111111000 101010111111010 00000001001110000 36 100011100101100 11110011111111 1111111101 000000101000000101010101 101000111111001000 101010111101010 00000000000011101 3. 讨论与结论
SRAP、ISSR、SSR分子标记技术曾被应用于晾晒烟的遗传多样性和亲缘关系分析。龙腾[10]应用SRAP分子标记技术对25份晾晒烟材料进行分析，用25个引物组合扩增出了3 368个条带，其中998个多态性条带，多态性比率为29.6%，品种间相似性系数为0.75~0.97；陈真勇[18]应用ISSR分子标记技术对70份晾晒烟材料进行分析，用13条引物扩增出107个条带，其中97个多态性条带，多态性比率为90.37%，品种间相似性系数为0.46~0.87；张雪廷[7]应用SSR分子标记技术对38份晾晒烟材料进行分析，用30对引物扩增出173个多态性引物，品种间相似性系数为0.14~0.928。
本研究从100个ISSR引物中筛选出7个多态性好、重复性好、稳定性强的引物对36份晾晒烟种质的基因组DNA进行扩增，扩增得到113个条带，其中有92个多态性条带，平均每个引物扩增出的多态性条带数量(13.1个)多于陈真勇[18](7.5个)和张雪廷[7](5.8个)的研究结果，多态性比率为80.5%，远远高于龙腾[10](29.6%)的研究结果，可见本研究筛选出的ISSR分子标记引物用于晾晒烟材料上具有较丰富的多态性，为后续的晾晒烟种质鉴定、遗传图谱构建、遗传多样性分析、基因克隆、基因定位等研究工作提供了坚实的研究基础。
本研究的聚类分析结果表明，晾晒烟的种质可分为5个组群，36份晾晒烟种质资源间的遗传相似性系数(GS)为0.65~0.91，平均遗传相似性系数(GS)为0.80，遗传变异度较小，说明其遗传多样性较低，遗传基础较为狭窄，这个结论与龙腾和陈真勇的分析结果接近，表明了晾晒烟具有较为狭窄的遗传基础和较高的遗传相似性系数，这也是晾晒烟育种中所要面对的主要问题，造成这个问题的原因可能是在生产中烟农会选择具有几个优良经济性状的晾晒烟品种进行留种，长此以往会造成其他优良性状的丢失，种质资源的减少。之前也有研究表明晾晒烟与烤烟、黄花烟之间存在较大的遗传差异[10]，烤烟相对于晾晒烟有更广阔的遗传基础和更大的育种潜力[5, 9]，在选育晾晒烟新品种的时候，要对新的优异晾晒烟资源进行挖掘和利用，尽可能拓宽晾晒烟的遗传基础，也可以考虑选用具有优良性状的烤烟或者黄花烟育种材料，进而提高晾晒烟种质资源的利用率和育种效率[10, 18]。
由于晾晒烟的遗传差异小，难以用传统的形态学鉴定方法进行鉴别。采用以分子标记为基础的指纹图谱可以较为准确地揭示种质间的遗传关系，在品种鉴定和知识产权保护具有重要作用[19-20]。本研究构建了36份晾晒烟的ISSR数字指纹图谱，每份种质都有属于自己的指纹图谱，可以为今后晾晒烟种质的品种鉴定以及指纹身份证数据库提供技术支持。
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表 1 供试晾晒烟材料
Table 1 Selected sun-cured tobacco germplasms
编号Code 名称Name 来源Collectionsite 类型Type 1 贵港土烟1号Guigang No. 1 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 2 贵港土烟2号Guigang No. 2 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 3 贵港土烟3号Guigang No.3 广西贵港Guigang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 4 横县土烟1号Hengxian No.1 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 5 柳城土烟1号Liucheng No. 1 广西柳城Liucheng Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 6 凌云土烟1号Lingyun No.1 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 7 全州土烟1号Quanzhou No. 1 广西全州Quanzhou Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 8 三里烟Shanglin 广西上林Shanglin Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 9 资源土烟1号Ziyuan No. 1 广西资源Ziyuan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 10 阳朔土烟1号Yangshuo No. 1 广西阳朔Yangshuo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 11 临桂土烟1号Lingui No. 1 广西临桂Lingui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 12 临桂土烟2号Lingui No. 2 广西临桂Lingui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 13 凌云土烟2号Lingyun No 2 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 14 凌云土烟3号Lingyun No 3 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 15 环江土烟3号Huanjiang No. 3 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 16 环江土烟1号Huanjiang No. 1 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 17 环江土烟2号Huanjiang No. 2 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 18 马山土烟1号Mashan No 1 广西马山Mashan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 19 横县土烟2号Hengxian No.2 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 20 平果土烟2号Pingguo No.2 广西平果Pingguo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 21 平果土烟1号Pingguo No.1 广西平果Pingguo Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 22 横县土烟3号Hengxian No.3 广西横县Hengxian Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 23 凌云土烟4号Lingyun No.4 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 24 安太土烟1号Antai No.1 广西融水Rongshui Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 25 安太土烟2号Antai No.2 广西融水RongshuiGuangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 26 凌云土烟5号Lingyun No.5 广西凌云Lingyun Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 27 环江土烟4号Huanjiang No.4 广西环江Huanjiang Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 28 马山土烟2号Mashan No.2 广西马山Mashan Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 29 平乐土烟1号Pingle No.1 广西平乐Pingle Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 30 平乐土烟2号Pingle No.2 广西平乐Pingle Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 31 河池土烟1号Hechi No.1 广西河池Hechi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 32 都安土烟1号Du′an No.1 广西都安Du′an Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 33 都安土烟2号Du′an No.2 广西都安Du′an Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 34 靖西土烟1号Jingxi No.1 广西靖西Jingxi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 35 德保土烟1号Debao No.1 广西德保Debao Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 36 靖西土烟2号Jingxi No.2 广西靖西Jingxi Guangxi 晒烟Sun-cured Tobacco 
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表 2 ISSR引物序列和扩增结果
Table 2 ISSR primer sequences and amplifications
引物编号No.Pri-mer 序列Primer sequences 多态性条带数Polymorphi-c bands 总条带数Total bands 多态性条带百分比The proportion of polymorphic bands/% 808 AGA GAG AGA GAG AGA GC 13 15 86.7 809 AGA GAG AGA GAG AGA GG 7 14 50.0 825 ACA CAC ACA CAC ACA CT 10 10 100 855 ACA CAC ACA CAC ACA CYT 23 24 95.8 856 ACA CAC ACA CAC ACA CYA 14 18 77.8 886 VDV CTC TCT CTC TCT CT 8 15 53.3 899 CAT GGT GTT GGT CAT TGT TCC A 16 17 94.1 平均数Mean - 13 16.1 80.5 总数Total - 91 113 -
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表 3 晾晒烟ISSR标记的多态性分析
Table 3 ISSR genetated banding patterns on sun-cured tobacco germplasms
引物编号No.Primer 有效等位基因数Effective number of alleles(Ne) Nei′s基因多样性指数Nei′s gene divesity(H) Shannon′s信息指数Shannon′s informaion index (I) 808 1.64 0.39 0.58 809 1.88 0.47 0.66 825 1.69 0.39 0.57 855 1.50 0.33 0.50 856 1.66 0.39 0.58 886 1.95 0.49 0.68 899 1.17 0.14 0.25 平均数Mean 1.64 0.37 0.55
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表 4 7条引物区分开的晾晒烟种质
Table 4 Sun-cured tobacco germplasms differentiated by using 7 primers
引物Primer 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 808 + + + + 809 + + 825 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 855 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 856 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 886 + + + + + + + + 899 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 注：1~36号材料编号同表 1，“+”表示该种质可被鉴定出来。
Note：1-36 are the same as Table 1, “+”said the germplasm could be identified.
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表 5 36份晾晒烟种质的ISSR数字指纹图谱
Table 5 ISSR fingerprints of 36 sun-cured tobacco germplasms
材料编号Code 808 809 825 855 856 886 899 1 000001100111010 11101101111111 1001111010 101010000100010101011101 101000101011101000 101011111111010 00000000000010100 2 000000011101010 11101101111111 1001111101 010101000100000000010101 101000101010101000 101010111101110 00000000000010000 3 100011100101100 11101101111111 1001111111 000001000100010100010101 101000011010001000 111110111111010 00010000000010100 4 100011100101100 11101011111111 0011011000 110000111100110000010101 101000101111101000 111110111111010 00000000000011000 5 100011100101100 11101011111111 1101011011 000000100011001100110101 101000101010101000 111010111111010 01000000000010010 6 000011100101100 11101011111111 1001010001 010000101100010000000101 101000100110101000 111111111101010 00000000001011000 7 100011100101100 11101011111111 1000011100 010000111100110100010101 111101011011001000 111110111111000 00000000000010000 8 100011100101100 11101011111111 0000011000 110000111100000000000011 101010001011101000 111010111111000 10001000000010000 9 111110000111111 11101011111111 0100011001 010000111101110100010101 101010001010101000 001110111101010 00000000000010000 10 100011100101100 11101011111111 0000011000 110000111100110100010001 101000111011001000 001010111101010 00000000000010000 11 100011000101100 11101011111111 1100000001 110000011100110100010101 101000111010101000 101110111101010 00000000000010000 12 100011100101100 11101111111111 0001000000 110000101101001100110001 101000111011001000 101110111111010 00100010000010000 13 100011100101100 11101011111111 1100011000 110000000000110100010101 101000111011011100 101110111101010 10100000000011010 14 100011100101100 11101011111111 1100001101 110000000100000100010101 101010001010001000 101110111101010 00100000100010000 15 100011100101100 11101011111111 1100001011 110000000001001010101101 101010001010001111 101110111101010 00001000000010010 16 000011100101100 11101011111111 0000001010 110000000110110100010101 101010001111111100 101110111111011 00000000000010000 17 100011100101100 11101011111111 1100001011 110000101100100100010001 101010111010101000 101110111111010 00000000001010000 18 100011100101100 11101011111111 0000001100 000000000000000000000101 101000111110101000 001111111101010 00000000000010000 19 100011100101100 11101011111111 0010001110 110001111100110100010101 101000111010001000 101111111101010 10000100100010000 20 100011100101100 00110011111110 0010001100 000000011101110100010001 101010111010001000 101111111101010 00000000000010000 21 100011100101100 11110011111111 1111101010 000000011100000100000001 101010111011001000 101110111101010 10001001100010000 22 100011100101100 11110011111111 1111101011 000001010001010101010101 101000111011001000 101110111101010 01100100000110000 23 100011100101100 11110011111111 1111111011 110001011001110101010101 101000111011001000 101110111101010 00010101011110000 24 100011100101100 11110011111111 1111001011 110001010111010000000001 101000111011001000 101110111101010 00000010000010000 25 100011100101100 11101011111111 1111111010 110001011110110100010001 101000001110001000 001010111101010 00000000000010000 26 100011100101100 11101011111111 0001111101 110001011000000000000001 101000000111101000 001111111101010 00000000000010000 27 100011100101100 11101011111111 1101001101 010001011101000000000001 101010111011001000 001111111111010 00000000000010000 28 100011100101100 11101011111111 1101101101 110000111000010000000001 101010111111111000 001111111111010 00000000000010000 29 100011100101100 11101011111111 0001101100 000000111010000000000001 101010111110001000 001111111111010 00000000000010000 30 100011100101100 11101011111111 1101111011 000000111010010100010001 101110000110001000 001111111101010 00000111011110000 31 100011100101100 11101011111111 1101111011 100000111010001001100101 101010111111001000 101111111101010 00000000000010000 32 100011100101100 11101011111111 1101111011 110000111000010101010101 101000111110111000 101111111101010 00000000000010000 33 100011100101100 11101011111111 0001101010 110000111000010101010111 101000111111111000 001010111101010 00000110000010000 34 100011100101100 11110011111111 0111111010 110000101010010011001111 101000111111111000 101010111101010 00010000000010000 35 100011100101100 11110011111111 0011111010 000000111000000101010111 101000111111111000 101010111111010 00000001001110000 36 100011100101100 11110011111111 1111111101 000000101000000101010101 101000111111001000 101010111101010 00000000000011101
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期刊类型引用(1)
1. 杨金初，童治军，李萌，赵旭，徐永明，冯颖杰，杨宗灿，曲鹏，李悦，孙九喆，张轲. 基于SNP标记的4个品种复烤烟叶鉴别研究. 河南农业科学. 2023(11): 174-180 . 
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