Cloning and Expression of Nitrite Reductase Gene HcNiR in Kenaf
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摘要:目的 了解红麻亚硝酸还原酶基因HcNiR生物信息学特性及组织表达特异性，为培育红麻氮高效利用品种提供理论依据。方法 以红麻材料349叶片的cDNA为模板，利用PCR扩增HcNiR基因的CDS序列，采用生物信息学方法分析HcNiR的氨基酸组成、蛋白质跨膜结构、信号肽、高级结构以及蛋白的同源进化树；采用实时荧光定量PCR检测HcNiR基因在红麻不同组织的表达情况。结果 HcNiR基因cDNA全长1395 bp，编码蛋白含有464个氨基酸，包含2个保守的亚硝酸和亚硫酸还原酶4Fe-4S结构域及铁氧蛋白部分结构域。HcNiR蛋白是一个不含跨膜转运结构与信号肽的亲水稳定性蛋白质，该蛋白质等电点是5.49，分子量51.68 kDa；具有26处潜在磷酸化位点。在其蛋白二级结构中，α-螺旋和无规则卷曲所占比例超过70%。通过氨基酸序列同源性分析发现，红麻HcNiR氨基酸序列与木槿HsNiR氨基酸序列相似性较高，达到97.37%，都含有铁-硫/铁血红素结合位点。进化树分析结果表明，红麻HcNiR基因与木槿HsNiR基因亲缘关系较近。组织特异性表达结果显示，红麻HcNiR基因在叶中的表达量高于根。结论 HcNiR基因编码蛋白含亚硝酸和亚硫酸还原酶4Fe-4S结构域及铁氧蛋白部分结构域；HcNiR基因具有组织表达特异性，在红麻叶片中表达较高，推测其主要在初级氮的同化过程中发挥重要调控作用。Abstract:Objective Bioinformatics and expressions of the nitrate reductase gene of kenaf(Hibiscus cannabinus) were studied for breeding varieties highly efficient in nitrogen utilization.Method From the leaf of kenaf 349, the coding sequences (CDS) of HcNiR was amplified by PCR. Bioinformatics method was applied to analyze the amino acid sequences, protein transmembrane structure, protein signal peptide, high-level structures, and homologous evolutionary tree associated with the gene, while the expression in various tissues detected by qRT-PCR.Result The full length of HcNiR cDNA was 1395 bp encoded 464 amino acids. The amino acid sequence contained two conserved nitrite and sulfite reductase 4Fe-4S domains and two conserved nitrite/sulfite reductase ferredoxin-like half domains. The predicted stable, hydrophilic HcNiR protein with an isoelectric point of 5.49 and molecular weight of 51.68 kDa had no transmembrane domain or signal peptide. It contained 26 potential phosphorylation sites in a secondary structure that consisted of more than 70% in the forms of alpha helix and irregular coils. The amino acid sequence of HcNiR was 97.37% homologous with that of H. syriacus, and both included nitrite and sulfite reductases iron-sulfur/siroheme-binding sites. The phylogenetic tree on HcNiR showed it closely related to HsNiR. The HcNiR expression was higher in the leaves than in the roots of a kenaf plant.Conclusion HcNiR contained two conserved nitrite and sulfite reductase 4Fe-4S domains and two conserved nitrite/sulfite reductase ferredoxin-like half domains. The gene was abundantly expressed in the kenaf leaves and speculated to be mainly involved in the process of primary nitrogen assimilation.
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Keywords:
- kenaf /
- nitrate reductase /
- HcNiR /
- gene cloning /
- expression analysis
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0. 引言
【研究意义】非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）又名扶郞花，为菊科大丁草属多年生宿根花卉，因其具有花色艳丽、花朵硕大、花茎挺拔、连续开花等特点，观赏价值较高，在全球切花贸易中排名第五[1−2]。大丁草属约有80种，主要分布于非洲南部，中国约有20种，主要分布于西南地区[3]。市场上常见的非洲菊是非洲菊的栽培种（Gerbera jamesonii Bolus），由非洲菊野生种（Gerbera jamesonii）与绿叶非洲菊（Gerbera viridifolia）杂交而来，几乎所有的非洲菊商业品种均为这两个种的杂交后代，且几乎都为二倍体（2n=50）[4−5]。荷兰、日本、德国、美国等是主要的育种国家，经过长期的人工培育，已选育出切花、盆栽和庭院等不同用途的品种[6−7]，也选育出红、橙、黄、粉、白、紫等不同花色，单瓣、半重瓣和重瓣等不同花序类型，迷你型和细丝状花瓣型等多种不同类型品种[5]。中国不是非洲菊原产地，自20世纪80年代引种进行商业化栽培以来，国内科研机构及花卉企业广泛引进非洲菊种质资源[8−10]，主要通过杂交育种方式培育新品种，累计培育非洲菊新品种达100余个 [5]。由于非洲菊种质引进历史较长，种源来源复杂，类型多样，部分种质有同物异名的可能，种内亲缘关系不够明确，严重制约非洲菊种质资源的引进、保护及育种利用。因此，开展非洲菊种质资源遗传多样性及亲缘关系研究十分必要。【前人研究进展】分子标记技术是研究植物遗传多样性的重要手段，能够有效揭示种内和种间的遗传变异[11]。早期非洲菊种质资源遗传多样性的研究主要采用ISSR、RAPD等分子标记技术[12−14]。简单重复序列（simple sequence repeat, SSR）通常由1～6个碱基为单元经过多次重复串联构成的DNA序列，具有共显性、多态性丰富、稳定性高、重复性好、简便易行等优点，目前SSR标记广泛应用于荷花（Nelumbo spp.）、兜兰（Paphiopedilum hirsutissimum）、月季（Rosa hybrida）等多种花卉种质资源遗传多样性研究中[15−17]。根据序列来源，SSR标记可以分为基因组SSR和表达序列标签SSR（expressed sequence tags-SSR, EST-SSR），EST-SSR标记来源于转录区域。2010年Gong等[18]筛选出99个可用EST-SSR标记，并应用于非洲菊种质资源遗传多样性研究中；Benemann等[19]利用17对EST-SSR标记对34份非洲菊种质进行分析，证明EST-SSR标记具有高度多态性；尹茂[20]利用48对EST-SSR标记对123份非洲菊材料遗传多样性和花色性状关联分析，挖掘出5个花色关联SSR标记位点；Yuan等[21]利用14对SSR标记对170份非洲菊种质进行分析，构建出170份非洲菊种质的指纹图谱。【本研究切入点】目前SSR标记应用于非洲菊种质资源遗传多样性的研究还存在可用标记数量仍较稀缺、分析所用标记较少，未能覆盖全部染色体、分析局限于常规舌状花等少数类型种质等的问题，而有关丝状花瓣、卷曲花瓣、盆栽、迷你等非洲菊不同类型及不同来源群体遗传多样性的研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】本研究利用筛选出的分布于非洲菊不同染色体上的EST-SSR标记，对不同来源群体、不同类型的170份非洲菊种质资源进行遗传多样性及亲缘关系分析，旨在揭示不同来源群体、不同类型非洲菊种质的遗传多样性及亲缘关系，为非洲菊种质资源的引进、保护及利用等提供依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
170份非洲菊种质由三明市农业科学研究院提供，种质均保存于国家非洲菊种质资源库，其中1~19号为德国喜乐达公司（Slecta）选育品种，20~27号为荷兰花舞士公司（Florist）选育品种，28~45号为荷兰西露丝公司（Schirus）选育品种，46~59号为来源于日本的盆栽非洲菊种质，60~90号为中国云南省的育种单位选育品种，91~170号种质为市场收集而来（表1）。每份种质剪取嫩叶样品，液氮速冻后置于−80 ℃的超低温冰箱中保存备用。
表 1 供试的非洲菊种质Table 1. Information on 170 G. jamesonii germplasms种质来源
Germplasm sources资源名称
Resource name德国喜乐达
German Slecta莉莉安Liliana（1）、王子Prince（2）、纳坦Natan（3）、阿姆莱特Amlet（4）、茱莉亚Julia（5）、特蕾莎Teresa（6）、里奥内格罗Rionegro（7）、莫蕾莉亚Morelia（8）、黑杰克Black Jack（9）、菲比Febe（10）、福娃Fuwa（11）、艾玛Emma（12）、科蒂奶油Cotti Creme（13）、科蒂奶油变异Cotti Creme（14）、安娜Anacleto（15）、罗德里Rodrigo（16）、米格尔Miguel（17）、红旅Red Trip（18）、希拉里Hillary（19） 荷兰花舞士
Holland Florist菜花黄Aruba（20）、法莱伦斯Fleurance（21）、水粉Ellymay（22）、大臣Testarossa（23）、玲珑Rosalin（24）、热带草原Savannah（25）、阳光露Sunway（26）、阳光海岸Cabana（27） 荷兰西露丝
Holland Schirus伊斯玛拉Esmara（28）、马德里Madeli（29）、佛罗里达Foluolida（30）、卡尔加里Kaerjiali（31）、斐济Feiji（32）、苏黎世Sulishi（33）、维也纳Weiyena（34）芭比娃娃Babiwawa（35）、香格里拉Xianggerila（36）、毛里求斯Maoliqiusi（37）、摩洛哥Moluoge（38）、亚历山大Yalishanda（39）、亚丁Yading（40）、大溪地Daxidi（41）、莫斯科Mosike（42）、巴塞罗那Basailuona（43）、爱丁堡Aidingbao（44）、休斯敦Xiusidun（45） 日本
JapanP01（46）、P02（47）、P03（48）、P04（49）、P05（50）、P06（51）、P07（52）、P08（53）、P09（54）、P10（55）、P11（56）、P12（57）、P13（58）、P14（59） 中国云南
Yunnan, China荣耀Rongyao（60）、秋日Qiuri（61）、醉雪Zuixue（62）、醉红Zuihong（63）、靓粉Liangfen（64）、红韵5号Hongyun No.5（65）、红韵6号Hongyun No.6（66）、红袍Hongpao（67）、紫佳人Zijiaren（68）、金葵花Jinkuihua（69）、温馨Wenxin（70）、醉粉Zuifen（71）、金桂Jingui（72）、国色Guose（73）、粉佳人Fenjiaren（74）、俏佳人Qiaojiaren（75）、曙光Shuguang（76）、宽云1号Kuanyun No.1（77）、紫衣皇后Ziyihuanghou（78）、紫佳人Zijiaren（79）、美阳阳Meiyangyang（80）、紫韵Ziyun（81）、玉镜Yujing（82）、珍爱Zhenai（83）、拉丝1号Spider No.1（84）、拉丝2号Spider No.2（85）、拉丝3号Spider No.3（86）、拉丝4号Spider No.4（87）、拉丝6号Spider No.6（88）、紫拉丝Spider Purple（89）、拉丝8号Spider No.8（90） 混合
Mix开心Kaixin（91）、红星Hongxing（92）、玲珑粉Linglongfen（93）、桑格里厄Sanggelier（94）、F1（95）、冰清玉洁Bingqingyujie（96）、大雪桔Daxuejv（97）、小雪桔Xiaoxuejv（98）、大088 Da088（99）、234（100）、黄色绿心旧Huangselvxinjiu（101）、新大088Xinda 088（102）、路易Luyi（103）、红胜利Hongshengli（104）、红艳Hongyan（105）、云南红Yunnanhong（106）、红黑心Hongheixin（107）、HZ（108）、S29（109）、浅紫Qianzi（110）、紫衣Ziyi（111）、太阳神Taiyangshen（112）、爱神Aishen（113）、卡提Kati（114）、白边紫衣Baibianziyi（115）、紫水晶Zishuijing（116）、紫灵Ziling（117）、绿心靓粉Lvxinliangfen（118）、粉蝶Fendie（119）、大地粉Dadifen（120）、大玲珑Dalinglong（121）、蜜糖Sweet Candy（122）、GU078（123）、薇娅Weiya（124）、LA4（125）、白马王子Dalma（126）、星光Xingguang（127）、彩蝶Caidie（128）、老香槟Laoxiangbin（129）、香槟Xiangbin（130）、新香槟Xinxiangbin（131）、大香槟Daxiangbin（132）、梅罗斯Meiluosi（133）、太阳风暴Taiyangfengbao（134）、纯黄Chunhuang（135）、贵族Guizu（136）、淑女Shunv（137）、紫带白边Zidaibaibian（138）、白色红圈Baisehongquan（139）、橙黄双色Chenghuangshuangse（140）、白粉复色Baifenfuse（141）、晨光Chenguang（142）、双色Shuangse（143）、西瓜红Xiguahong（144）、鲁西亚Luxiya（145）、露西娅Lucia（146）、高山Gaoshan（147）、普罗文斯Puluowensi（148）、多利Fredonzelle（149）、马亚Maya（150）、巴比伦Babilun（151）、上海绿Shanghailv（152）、巴龙Balong（153）、灿烂Canlan（154）、一点红Motezuma（155）、S50（156）、Y5（157）、北极星Beijixing（158）、千禧红Qianxihong（159）、红小花Hongxiaohua（160）、派德Paide（161）、爱心Aixin（162）、B6（163）、火焰Huoyan（164）、CY1804（165）、西瓜红拉丝Spider xiguahong（166）、黄色拉丝Spider yellow（167）、紫色拉丝Spider purple（168）、葵心Kuixin（169）、紫苏Zisu（170） 资源名称后括号内的数字表示种质编号。
Number in parentheses after a germplasm name is sample code.1.2 试验方法
1.2.1 DNA的提取和检测
采用E.Z.N.A.TM HP Plant DNA Kit植物基因组DNA提取试剂盒（美国OMEGA生物技术公司）提取非洲菊叶片基因组DNA，用1%的琼脂糖凝胶电泳和BioDrop超微量蛋白核酸分析仪检测所提取DNA质量及浓度，然后用无菌ddH2O将样品DNA浓度稀释至20 ng·μL−1，−20 ℃保存备用。
1.2.2 SSR引物合成与筛选
从三明市农业科学研究院以非洲菊云南红转录组序列为基础开发的EST-SSR引物中随机选取重复单元为二核苷酸至六核苷酸的引物122对[22]，本课题组先前选取65对[23]，查阅文献挑选25对[24]，共挑选212对引物，交由福州尚亚生物技术有限公司合成。
以6份不同类型非洲菊种质DNA为模板，对照非洲菊云南红全基因组测序结果（另文发表），对挑选出的212对EST-SSR引物进行筛选，以扩增条带清晰、多态性高、重复性好且每对染色体至少选择1对引物的原则，筛选出引物用于后续分析。
1.2.3 PCR反应体系、程序及电泳检测
PCR反应体系、反应程序及电泳检测按照曹奕鸯等[23]的方法实施。
1.2.4 数据处理与分析
在SSR标记位点处，位置相同的条带记为一个标记等位基因，有带记为1，无带为0，缺失为2。利用NTSYS-pc2.10e软件计算遗传距离，基于UPGMA法在MEGA6.06软件中对不同非洲菊种质进行聚类分析；使用Popgen32软件计算位点等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon信息指数（I），群体总等位基因数、总基因型数、平均等位基因数、平均基因型数、平均杂合度、Nei’s遗传距离和遗传一致度；多态信息含量（PIC）则由公式
PICi=1−∑jPij2 计算，其中Pij 表示第i 个位点第j 个等位基因的频率[25]。群体聚类分析则是根据Popgen32软件计算得到的遗传一致度，用UPGMA法进行聚类。2. 结果与分析
2.1 EST-SSR引物的筛选
以6个不同类型的非洲菊种质资源DNA为模板，用212对EST-SSR引物进行PCR扩增、筛选，结果表明，在自主开发的187对EST-SSR引物中，有30对引物扩增条带清晰、多态性高、重复性好，分布于非洲菊1#、3#等21条不同染色体上，部分引物扩增结果见图1；25对参考EST-SSR引物中，9对引物扩增条带清晰，多态性高，重复性好，分布于非洲菊1#、2#等8条不同染色体上。每对染色体匹配1～3对引物（表2），因此选用这39对引物进行遗传多样性分析。
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图 1 部分EST-SSR引物扩增图谱M：100bp DNA marker；1~6：6个不同非洲菊种质样品；A：g131引物扩增结果；B：g139引物扩增结果；C：g145引物扩增结果；红色框部分所示引物在EST-SSR位点处的扩增条带。Figure 1. Map of partial amplified EST-SSR primersM:100bp DNA marker; 1-6: G. jamesonii samples; A: amplified g131 primer; B: amplified g139 primer; C: amplified g145 primer; red box shows different amplification band at EST-SSR location.表 2 39对EST-SSR引物序列Table 2. Sequences of EST-SSR primers引物名称
Primer name正向引物
Forward primer反向引物
Reverse primer片段长度
Fragment length/bp染色体位置
Chromosomal locationg23 CATCCCTTACGTTGGCACTT CACCCTTGAAACCCTCTCTG 167 16# g24 AGTGGGAGAAGCTATGCCAA GGGTCGCCATAGCAAATAGA 187 17# g25 GATTGGATGCTAGCTTTGCC GGGCATTTTGGACATTTGAT 162 25# g27 AATCCTCAATGCCACCTTTG GAGGCAGGAATTGACTGGAA 160 16# g28 CGTTTTACATGCAGCCTCAA CTTTGCTTCCTCTGCCTGAC 167 7# g31 ATCGGCTCAAGGTAAGGGAT GCTCAATGGCTTCAGACACA 186 1# g32 ATTTTGAAGGGATTGGTGGG TCATGCCATATTCCCTCGAT 174 25# g36 AGCAAGATCAAAAGACCCGA CCTTTGTCGTCATAGCAATCAA 167 21# g37 CGCCATTAAAGCCTTCTTTC GGAAGGCTTGTGTTGGTTGT 151 3# g39 ACAAAGAATCCGTCCACCAG GACCGTATTGGGCAGGTCTA 164 24# g40 GAGGCGTTATCGGACTTTGA TTCTTCTTGGGACGTAACCG 168 9# g44 TTAGGAGTGGAGTCGCTGCT CGAAAAGCTAGCAAATGGACA 200 21# g47 GAAATCCGTGAAAGGTCGAA TGTACAAACCCACCTCCCTT 193 11# g64 CGCTTCCTCCTACAACAAGC GTGTCCCCACCATTCAAGTT 163 9# g81 CCAAAAGCCGAAATTGCTAC AATCACATTTGCAAGCGACA 149 3# g91 CCGAGCAAATTGTGGATCTT CGACACCTTTCCAAGCATCT 154 5# g93 TGCTGCATCTCATCATTCCT AGGAGAATCCATGTAGCCGA 217 18# g96 TCTGTGTTCCTCCGTCTCCT AATCAGTCGGAATGCGAATC 175 18# g108 AATGGCAGCTACTGCGTCTT TCACCATTAACGGCTGATGA 158 11# g100 AAGAATCAGAGCCTGGAGCA CCCCTCTACGCTTCTTGATG 237 6# g110 ATTCATGTAACCAGTGGCGG AAGTAACGGCGATCAACGAC 145 13# g118 GCTGCCCAACAACTCATGTA TACCAAGCACAACCAGGTCA 237 6# g127 CGACCAACGTTCCAAGAAAT CGACAAACACTTCGGAGGAT 205 24# g129 GGCGTACAACACTAGCAGCA TGATTTGTGGAATGGCTTGA 216 12# g131 GTGGAAAAAGAAAATGGCGA CAACATTTTCGATTGCGATG 130 4# g139 TCATCATGGGTCCTTCACAA ACCCACAAAAAGCTTTGCAC 189 8# g145 AGCTAGTGGTGTTTCAGCCA CATCATGACTGACGGGAGTG 157 10# g155 CTGGCTTTGACGAAAACACA ATCGCCATCCTGTCAATTTC 148 20# g167 GCCTGGTGTCAATCCTTGTT TGAATTGCAAAGGGTTGTGA 139 14# g185 AGGAAGTGTGGGGTCACTTG TTTGAAGTTATGCTGCACCG 203 23# GEM57 GGGTTGATGTAGGCTTTGTT TCCTGGATTATCATTCACCAT 155 1# GEM109 TGCTCCTCCTGCATTATCCT TAAGAGGGAGGCGAGAACAG 135 GEM130 GCGGAGATACATTACGTGATAGG AGAGTTTTGCTCGCCAACAT 146 15# GEM148 CGAAGCTCTCAAAGCAAAGG TTCAGGAGGTGATGGTGTCA 140 2# GEM162 AAAGGTGCATTACTTGTTCTCTCC GCTTTGCTCTTGGCTTTGTC 134 12# GEM187 CCCTTCCTTTTTCTACTCCTCCT GATGTCGATCCAGGTTGCTC 154 22# GEM203 TTCTGCTTCTTGGGATGATTG TAAAAACCGTCTCCGTCGTC 141 21# GEM209 GGGTATCCAAAGTCTACGAT ACTAAGTTTGCATAAAGATTGC 135 19# GEM264 GTTGACATCAAACCGTCGTC TCCATATTTTGTTGCACCGTA 157 13# GEM57~GEM264等9对EST-SSR引物来源于参考文献[24]。
Nine pairs of EST-SSR primers, including GEM57-GEM264, were obtained from references [24].2.2 EST-SSR位点多态性分析
利用筛选出的39对EST-SSR引物对170份非洲菊种质资源进行检测（表3），共检测出168个等位基因（Na），每对引物检测到的等位基因为3～7个，平均等位基因为4.308个；有效等位基因（Ne）为1.354～4.772个，平均为2.734个，有效等位基因数与等位基因数存在一定差异，表明等位基因在非洲菊群体中分布不均匀。Shannon信息指数（I）为0.518～1.656，平均为1.098。多态信息含量（PIC）为0.431~0.920，平均为0.760，PIC值大于0.500的高多态标记有37个，占全部标记的94.87%。说明本研究所选EST-SSR标记具有较高的多态性，可有效反映非洲菊种质资源的遗传多样性信息。
表 3 39对EST-SSR标记的遗传参数Table 3. Genetic parameters from 39 EST-SSR marker pairs位点
Locus等位基因数
Number of alleles (Na)有效等位基因数
Effective number of alleles (Ne)Shannon信息指数
Shannon’s information index (I)多态信息含量
Polymorphic information (PIC)g23 5 2.488 1.052 0.770 g24 3 2.030 0.864 0.695 g25 4 3.241 1.244 0.824 g27 6 3.009 1.303 0.843 g28 3 1.354 0.518 0.431 g30 5 3.346 1.316 0.845 g32 6 4.772 1.623 0.920 g36 4 2.672 1.134 0.786 g37 3 2.654 1.037 0.790 g39 3 2.837 1.071 0.801 g40 5 2.629 1.168 0.791 g44 4 2.892 1.162 0.822 g47 4 2.217 0.972 0.734 g64 3 2.057 0.766 0.655 g81 5 3.936 1.461 0.850 g91 4 2.352 1.066 0.762 g93 6 3.209 1.315 0.849 g96 4 1.393 0.593 0.478 g100 7 4.423 1.656 0.917 g108 4 2.670 1.107 0.790 g110 5 4.043 1.486 0.893 g118 4 2.541 1.040 0.773 g127 3 2.300 0.929 0.731 g129 4 1.701 0.679 0.579 g131 4 2.435 1.062 0.772 g139 5 3.478 1.344 0.856 g145 4 3.154 1.261 0.850 g155 3 2.513 1.005 0.770 g167 3 2.563 1.002 0.746 g185 3 1.570 0.656 0.544 GEM57 3 1.982 0.813 0.650 GEM109 5 1.840 0.858 0.644 GEM130 3 1.837 0.800 0.647 GEM148 4 2.274 1.068 0.766 GEM162 6 4.178 1.550 0.905 GEM187 4 1.804 0.801 0.630 GEM203 7 4.159 1.607 0.903 GEM209 4 2.220 0.939 0.734 GEM264 6 3.858 1.510 0.891 平均值 Mean 4.308 2.734 1.098 0.760 2.3 群体间的遗传多样性分析
利用Popgen32软件分析非洲菊种质资源6个不同群体间的遗传多样性（表4） ，结果表明群体间观测到的总等位基因数为114～167，最低为日本群体，最高为混合群体，总基因型数变化范围为156～335，最低为荷兰花舞士群体，最高为混合群体；平均等位基因数与平均基因型数的最低值与最高值的群体分别与总等位基因数和总基因型数的最低值和最高值群体一致。混合群体、中国云南群体以及荷兰花舞士群体平均杂合度均较高，接近0.600，日本群体最低，仅为0.482。总体而言，6个不同群体间遗传多样性差异较大，混合群体和中国云南群体的总等位基因数、总基因型数、平均等位基因数、平均基因型数、平均杂合度均较高，遗传多样性较丰富。
表 4 6个非洲菊群体间的遗传多样性Table 4. Genetic diversity of 6 G. jamesonii populations群体
Population群体大小
Population size总等位基因数
Total allele number总基因型数
Total gene type number平均等位基因数
Average allele number平均基因型数
Average gene type number平均杂合度
Average heterozygosity德国喜乐达
German Slecta19 153 243 3.923 6.231 0.578 荷兰花舞士
Florist Holland8 132 156 3.385 4.000 0.606 荷兰西露丝
Schirus Holland18 145 228 3.718 5.846 0.513 日本
Japan14 114 165 2.923 4.231 0.482 中国云南
Yunnan China31 159 280 4.077 7.179 0.607 混合群体
Mix80 167 335 4.282 8.590 0.604 2.4 不同群体间遗传相似性及聚类分析
对6个非洲菊群体间进行Nei’s遗传一致度和遗传距离检测（表5） ，结果表明群体间遗传距离的变化范围为0.016～0.158，平均为0.069。遗传一致度变化范围为0.854～0.984，平均为0.935。6个群体间，中国云南群体与混合群体的遗传一致度最高（0.984），遗传距离最小（0.016），说明这两个群体的亲缘关系较近。而日本群体和德国群体的遗传一致度最小（0.854），遗传距离最大（0.158），说明这两个群体的亲缘关系较远。
表 5 非洲菊群体间的遗传一致度和遗传距离Table 5. Genetic similarity and distance between G. jamesonii populations群体
Population德国喜乐达
German Slecta荷兰花舞士
Holland Florist荷兰西露丝
Holland Schirus日本
Japan中国云南
Yunnan, China混合
Mix德国喜乐达 German Slecta 0.950 0.956 0.854 0.973 0.982 荷兰花舞士 Holland Florist 0.052 0.951 0.893 0.955 0.973 荷兰西露丝 Holland Schirus 0.045 0.050 0.861 0.943 0.963 日本 Japan 0.158 0.114 0.149 0.891 0.894 中国云南 Yunnan, China 0.028 0.046 0.059 0.116 0.984 混合 Mix 0.018 0.028 0.038 0.112 0.016 右上角为Nei氏遗传一致度，左下角为遗传距离。
Data on upper right corner are Nei’s genetic consistency; those on lower left corner, genetic distance.根据6个非洲菊群体的Nei’s 遗传一致度利用NTSYS-pc2.10e软件对非洲菊群体进行UPGMA聚类分析（图2），结果表明在相似系数0.965处，可将6个群体分为4个组群，第一个组群包括日本群体；第二个组群为荷兰西露丝群体；第三个组群为荷兰花舞士群体；德国群体和中国云南群体以及混合群体位于同一分支，分在第四组群，说明中国云南群体与混合群体及德国群体间的亲缘关系较近。
2.5 非洲菊种质资源聚类分析
基于UPMGA法对170份非洲菊种质进行聚类（图3），结果显示在遗传相似系数0.550处，170份种质共分为6大组群，组群Ⅰ包括5份种质，均为迷你型种质；组群Ⅱ包括2份种质，均为常规舌状花瓣类型种质；组群Ⅲ包括11份种质，含1份丝状瓣种质、5份卷曲花瓣种质；组群Ⅳ包括4份种质，含2份丝状瓣种质、2份常规类型种质；组群Ⅴ包括49份种质，组群Ⅵ种质数量最多，为99份种质。在遗传相似系数0.558处，组群Ⅴ可分为Ⅴ-1、Ⅴ-2、Ⅴ-3、Ⅴ-4共4个亚群，亚群Ⅴ-1包括28份非洲菊种质，含23份常规类型种质、4份丝状瓣种质、1份迷你型种质；亚群Ⅴ-2含2份迷你型种质；亚群Ⅴ-3包括13份种质，含1份卷曲花瓣种质、1份丝状花瓣种质、1份迷你型种质、3份球型种质；亚群Ⅴ-4包括6份种质，含1份球型种质、1份迷你型种质。在遗传相似系数0.570处，组群Ⅵ可分为Ⅵ-1、Ⅵ-2、Ⅵ-3、Ⅵ-4共4个亚群。亚群Ⅵ-1包括29份种质，含1份迷你种质、1份丝状花瓣种质；亚群Ⅵ-2包括24份种质，含14份盆栽类型种质，均来源于日本群体；亚群Ⅵ-3包括17份种质，含2份丝状花瓣种质；亚群Ⅵ-4包括29份非洲菊种质，含7份丝状花瓣种质、1份迷你型种质。
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图 3 基于EST-SSR标记的170份非洲菊种质资源UPGMA聚类分析Figure 3. EST-SSR-based UPGMA dendrogram of 170 G. jamesonii germplasms从种质资源在各组群和亚群的分布可以看出，来源于日本群体的全部14份盆栽类型种质集中分布于Ⅵ-2亚群，来源于荷兰西露丝群体的6份卷曲花瓣类型种质，分布于组群Ⅱ（5份）及亚群Ⅴ-3（1份），4份球型非洲菊种质均位于组群Ⅴ的Ⅴ-3和V-4亚群，表明同一类型且群体来源单一的非洲菊种质间组群分布较为单一，亲缘关系较近。丝状花瓣非洲菊、迷你非洲菊、常规非洲菊种质组群分布较为分散，表明这些类型非洲菊种质多样性较高。
迷你型的科蒂奶油（13）与科蒂奶油变异株（14），迷你型的红小花（160）、派德（161）、B6（163），常规类型的玲珑（24）与玲珑粉（93），红艳（105）与云南红（106），大雪桔（97）、小雪桔（98）、大088（99）、234（100）与阳光露（26）等种质间遗传相似系数为1，说明所用39对EST-SSR引物未扩增出差异条带，未能区分这些种质，种质间亲缘关系最近，部分种质有同物异名的可能。
3. 讨论与结论
与传统基因组SSR引物相比，利用转录组序列设计EST-SSR引物速度更快、成本更低且具备良好的属间通用性，被广泛应用于种质资源遗传多样性研究[26−28]。近年来，EST-SSR标记应用于非洲菊种质资源遗传多样性分析的研究已有不少报道。Gong[24]等采用53个EST-SSR标记，扩增出169个等位基因，平均每个位点3.189个，平均PIC值为0.425；尹茂[20]采用48对EST-SSR标记，扩增出155个等位基因，平均每个位点3.22个，平均PIC值为0.44；Benemann等[19]采用17对EST-SSR标记，扩增出101个等位基因，平均每个位点5.94个，平均PIC值为0.67；本研究利用39对EST-SSR标记，对170份非洲菊种质资源进行遗传多样性分析，扩增出168个等位基因，平均每个位点4.308个，PIC值平均为0.760，平均等位基因数高于尹茂[20]、Gong等[24]，低于Benemann等[19]的研究结果，这可能与种质资源的多样性、SSR标记的筛选标准有关，相比尹茂[20]、Gong等[24]的结果，本研究所选非洲菊种质包括丝状花瓣、卷曲花瓣、迷你、盆栽等类型，多样性更丰富，Benemann等[19]要求位点基序的重复次数达12次及以上，引物筛选标准更高。本研究SSR位点平均PIC值高于Gong[24]等、尹茂[20]和Benemann等[19]的研究结果，PIC≥0.5的高多态性标记[29]占94.87%，进一步表明所选引物为高多态性引物，可用于非洲菊遗传多样性和亲缘关系分析等研究。
本研究结果显示中国云南群体的遗传多样性高于德国喜乐达、荷兰西露丝、荷兰花舞士、日本等群体，云南省作为非洲菊的主产区及非洲菊种苗的最大产区（占60%以上市场份额）[30]，是荷兰西露丝、荷兰花舞士、德国喜乐达等非洲菊育种公司新品种的主推地区，中国云南群体是由云南省科研单位和企业选育品种组成，其育种亲本的来源更加丰富，可能是云南群体遗传多样性较高的重要原因。此外，中国云南群体与混合群体间遗传距离最小，亲缘关系最近，推测云南群体部分品种的杂交亲本可能直接或间接来源于混合群体。因此，加强非洲菊种质资源的引进的广度有助于提高非洲菊种质资源遗传多样性。
本研究对170份非洲菊种质聚类分析结果显示盆栽和卷曲花瓣等类型非洲菊种质组群分布较集中，这可能与本研究中盆栽非洲菊种质为日本种群独有，卷曲花瓣非洲菊种质为荷兰西露丝群体独有，基因交流主要在群体内部有关。玲珑与玲珑粉，云南红与红艳，大雪桔与小雪桔、大088、234、阳光露等种质间亲缘关系最近，且其花型、花色、叶型等综合性状较为接近，推测是品种改良所致。云南红、玲珑、大088等均为多年前从国外引进的品种，当前仍作为主栽品种种植[31−34]，因此通过诱变或杂交等育种方法对非洲菊主栽品种进行改良是培育新品种的重要方式。
综上所述，本研究筛选出39对EST-SSR标记，分析了170份不同来源群体、不同类型种质的遗传多样性和亲缘关系，研究结果可为非洲菊种质资源的引进、保护及利用等提供理论依据及数据支撑。
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图 1 HcNiR基因克隆的琼脂糖凝胶电泳检测结果
M-DL2000 DNA Marker; 1为HcNiR-1, 2为HcNiR-2, 3为HcNiR-3。
Figure 1. Gel electrophoresis of HcNiR cloning result
M: DL2000 DNA marker; 1: HcNiR-1; 2: HcNiR-2; 3: HcNiR-3.
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图 4 HcNiR蛋白潜在磷酸化位点预测结果
A为潜在磷酸化位点；B为磷酸化势。
Figure 4. Predicted phosphorylation sites in HcNiR protein
A: Potential phosphorylation site; B: Phosphorylation potential.
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图 9 HcNiR的氨基酸序列对比
HcNiR：红麻；HsNiR：木槿（XP_039006864.1）；TcNiR：可可树（XP_007042430.2）；GhNiR：陆地棉（ADJ68001.1）；GrNiR：雷蒙德氏棉（XP_012463711.1）。
Figure 9. Amino acid sequences of HcNiR
HcNiR: H. cannabinus; HsNiR: H. syriacus (XP_039006864.1); TcNiR: Theobroma cacao (XP_007042430.2); GhNiR: Gossypium hirsutum (ADJ68001.1); GrNiR: Gossypium raimondii (XP_012463711.1).
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图 11 HcNiR在不同组织中的表达情况
不同小写字母表示不同组织间差异显著（P＜0.05）。
Figure 11. Expressions of HcNiR in various tissues
Data with different lowercase letters indicate significant difference at P＜0.05.
表 1 引物序列
Table 1 Primer sequence
引物名称
Primer names引物序列（5′-3′）
Primer sequence(5′-3′)HcNiR-F ATGACAGATGGGAGATTTATGATG HcNiR-R GCATTTTCCACTTCTTCTTCCC HcNiR-qPCR-F TCTTGGTTACAGGGGCAATAGAC HcNiR-qPCR-R TGGACACCAAGATAGTCTCTCCT beta-actin-F ATCCTCCGTCTTGACCTTG beta-actin-R TGTCCGTCAGGCAACTCAT 
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表 2 HcNiR基因编码蛋白质产物一级结构预测分析
Table 2 Primary structure of HcNiR encoded protein
一级结构特征
Characteristics of
primary structure氨基酸数量
Number of
amino acids等电点
pI相对分子质量
Relative molecular
mass/Da分子式
Molecular
formula正电荷
残基
Arg+Lys负电荷
残基
Asp+Glu平均疏水性
Average
hydrophobicity脂肪系数（AI）
Fatty
coefficient不稳定系数（Ⅱ）
Instability
coefficient (Ⅱ)半衰期
Estimated
half-life/h预测结果
Prediction result464 5.490 51683.220 C2276H3632N644O681S24 54 64 −0.289 89.480 37.930 30
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