Pseudomonas in Hippophae rhamnoides Rhizosphere Affecting Growth of Ipomoea aquatica
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摘要:目的
从青海野生中国沙棘根际土中筛选出具有多重功能的假单胞属菌株，为生物菌肥的研发创造条件。
方法利用筛选培养基对沙棘根际土中的微生物进行分离，利用平板划线法对菌株进行纯化。通过形态、生理生化及16S rDNA序列比对鉴定菌株，并测定菌株解有机磷、解无机磷、解钾、固氮和降解纤维素能力。以雍菜为试验材料，检测各假单胞菌属菌株促进雍菜种子萌发以及雍菜幼苗生长能力。
结果从中国沙棘根际土壤中分离出7株假单胞菌，培养3 d，7株假单胞菌溶解有机磷浑浊圈直径为4.28～13.71 mm，溶解无机磷透明圈直径为3.51～7.62 mm，解有机磷菌液中磷的质量浓度为5.15～25.41 μg·mL−1，解无磷菌液中磷的质量浓度为2.15～22.26 μg·mL−1，解钾黄色光圈直径为11.12～21.85 mm，解钾菌液中K+质量浓度为5.07～14.33 μg·mL−1，固氮透明圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d）为1.33～1.86，降解纤维素透明圈直径为4.61～10.22 mm。平板促生试验结果表明，假单胞菌可提高雍菜种子发芽率，并且可显著提高雍菜幼苗生长。其中菌株ZGSJ-3促生效果最好，其叶宽和茎长分别为3.69 mm和50.25 mm，较CK显著增加35.2%和41.2%。
结论经综合评价后得出，不同假单胞菌菌液处理下雍菜的生长状况均得到一定程度改善，发芽率得到显著提高，其中ZGSJ-3和ZGSJ-7效果较好。
Abstract:ObjectivePseudomonas sp. in the rhizosphere of Hippophae rhamnoides were isolated and studied for potential application as a biofertilizer.
MethodMicroorganisms in the rhizosphere soil of Hippophae rhamnoides sinensis subsp. in the wild in Qinghai Province were isolated by using selected media and purified by plate streaking. Candidate Pseudomonas strains were morphologically, physiologically, and biochemically identified as well as 16S rDNA sequenced. Abilities of the isolates to degrade organic and inorganic phosphorus, potassium, cellulose and/or to fix nitrogen were examined. Effects of spraying the bacterial culture broth of the individual isolates on the seed germination and seedling growth of Ipomoea aquatica Forssk were observed.
ResultOn different media of specific formulations, the diameters of the turbid circles born by the 7 isolated Pseudomonas strains cultured for 3 d ranged 4.28–13.71 mm with 5.15–25.41 μg·mL-1 of dissolved organic phosphorus, those of clear circles 3.51–7.62 mm with 2.15–22.26 μg·mL−1 of dissolved inorganic phosphorus, those of halos 11.12–21.85 mm with 5.07–14.33 μg·mL-1 of dissolved potassium, those of transparent circles 4.61–10.22 mm of cellulose-degradation, and the ratios of the nitrogen-fixing clear circle diameter (D) to the colony growth circle diameter (d) 1.33–1.86. The isolated Pseudomonas strains significantly improved the I. aquatica seed germination rate and seedling growth. Among them, ZGSJ-3 showed the largest increases of 35.2% on the 3.69 mm leaf width and of 41.2% on the 50.25 mm stem length over control.
ConclusionPresence of the Pseudomonas sp., especially ZGSJ-3 and ZGSJ-7, isolated in this study significantly improved the seed germination and seedling growth of I. aquatica.
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0. 引言
【研究意义】中国沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis Rousi）抗逆能力强，耐寒、耐旱、耐盐碱、耐瘠薄，具有抗风沙、保持水土、固氮解磷解钾等特性，是青藏高原首选的造林树种[1−2]。在青海复杂的自然条件下中国沙棘分布范围广，生态适应性强，因原始生存环境复杂，沙棘类群多样且种类丰富，因而相较于人工种植的沙棘其功能基因更加多样，遗传物质更加丰富，更有利于研究根际促生菌丰富度和多样性[3]。通过对野生沙棘根际土壤假单胞属菌株的筛选及其解磷解钾固氮降解纤维素等促生功能研究，可以提高土壤养分分解速率，增加土壤的养分含量，使农作物获得更好的生长环境[4]。【前人研究进展】根际促生菌可以通过黏附到矿物表面并释放酸性物质，将难溶性钾、磷和硅等营养元素释放出来进而供植物吸收利用[5−8]。目前，从植物根际土中分离出的菌株主要有假单胞菌、芽孢杆菌、不动杆菌，其中假单胞菌是青藏高原地区根际促生菌的优势菌株，具有溶磷、解钾、固氮和促进植物生长等作用[9]。马福林等[10]从西藏沙棘中分离出了具有解磷解钾功能的假单胞菌菌株，西藏沙棘接种该菌株后生长得到明显改善。Hameeda等[11]混合接种5种不同菌属的菌株于玉米后发现，假单胞菌可显著提高种子发芽率，并能促进玉米生长，减少氮肥使用。杨晓帆等[12]对桃树根际土壤中的假单胞菌进行分离筛选，发现桃树接种假单胞菌对其叶片、须根数、株高、鲜质量均有明显的促生效应。近些年来的研究表明，植物根际中分离的假单胞菌菌株在促进种子萌发、幼苗生长、提高农作物产量、品质和改善土壤特性等方面起着重要的作用[13]。【本研究切入点】目前，根际促生菌中的分离鉴定工作主要集中在玉米、马铃薯等经济作物方面[14−16]，对沙棘，尤其是青海野生中国沙棘根际促生菌中的分离及研究其多功能能力的相关研究鲜有报道。【拟解决的关键问题】从青海野生中国沙棘根际土壤中分离具有解磷解钾固氮降解纤维素能力的假单胞菌，对其进行生理生化、分子鉴定、种子发芽试验和促生试验，以期为研发适宜高原农业生产所需的高效生物菌肥奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 取样地概况
于2021年8月，采集分布于西宁大通的野生中国沙棘根际土壤。土壤为沙质土壤，伴生植物有西藏沙棘、金露梅等。
1.2 试验材料
试验试剂：革兰氏染液、磷标准溶液、抗坏血酸溶液 、钼酸盐溶液、钼锑抗显色剂、琼脂糖、细菌DNA提取试剂盒、甘油、75%硫酸溶液，细菌生化鉴定管。试验培养基：普通肉汤琼脂培养基、阿须贝固氮培养基、无机磷培养基、有机磷培养基、卵黄琼脂培养基、硅酸盐培养基、LB液体培养基、1/2MS固体培养基、纤维素刚果红培养基。以上试验试剂及试验培养基均购自青岛海博生物技术有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 样土采集
用土壤钻在采样点按照S形采样法，采集中国沙棘根际土壤，将其制成混合土样，保存于4 ℃冰箱，用于根际促生菌的分离、纯化与鉴定。
1.3.2 菌株分离筛选
在无菌条件下，称取10 g混合土壤样品，溶解在装有90 mL生理盐水的三角形烧瓶中，完全摇匀并在28 ℃和170 r·min−1的摇床中振荡30 min，配制成体积分数分别为10%、1%、0.1%、0.01%、0.001%和0.0001%的稀释液，分别吸取上述稀释液100 μＬ到阿须贝固氮培养基、无机磷培养基、有机磷培养基、硅酸盐培养基、纤维素刚果红培养基等筛选固体培养基上，用涂布棒均匀涂抹。每种培养基平板重复3次。倒置于30 ℃生化培养箱中，培养3 d。
1.3.3 菌株纯化
选择在有机磷固体培养基、无机磷固体培养基、硅酸盐固体培养基、阿须贝固体培养基和纤维素刚果红固体培养基上长势好、凸起高的单菌落接种在普通肉汤琼脂培养基上进行划线，直至出现单一菌株。
1.3.4 菌株形态学鉴定
在普通肉汤琼脂培养基上选择单一菌落，观察该菌落形态特征，并根据《常见细菌系统鉴定手册》[17]对菌株进行形态学鉴定。
1.3.5 菌株生理生化鉴定
根据《常见细菌系统鉴定手册》[17]对菌株的生理生化特征进行测定，参照生化管说明书判定结果并记录。
1.3.6 菌株分子生物学鉴定
将待提取DNA的细菌制成悬浊液，利用细菌DNA提取试剂盒提取中国沙棘根际细菌DNA。使用通用引物[5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGATGA-3′（27F）和5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTTAGC-3′（1492R）]扩增16S rDNA。预期扩增产物长度为1 500 bp。扩增体系：Premix Taq 25 μL，上下游引物各1 μL，基因组DNA 0.5 μL，ddH2O补足至50 μL。扩增条件：95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，35个循环；72 ℃ 5 min，4 ℃结束反应。用 1% 琼脂糖凝胶电泳检测产物质量后，送至北京奥维森基因科技有限公司进行测序。将测序所得基因序列提交于NCBI数据库中的核苷酸序列进行BLAST分析，从中下载同源性较高的16S rDNA序列进行比对分析后运用MEGA构建系统发育树，确定其分类地位。
1.3.7 菌种解磷能力测定
溶磷定性测定：用打孔器分别在卵黄琼脂培养基、无机磷培养基上打3个孔，每个孔接种 30 μL 菌液，每个平板重复3次。置于28 ℃生化培养箱中培养 3 d，分别在1 d后和3 d后测量透明圈直径和浑浊圈直径。
溶磷定量测定：参考张祥胜[18]的方法进行磷含量测定。
1.3.8 菌株解钾能力测定
解钾定性测定：运用点接法将单一菌株接种于硅酸盐细菌培养基上，每个平板重复3次，倒置于30 ℃生化培养箱中培养3 d，分别在1 d后和3 d后测量黄色透明圈直径。
解钾定量测定：接种400 μL 菌液到10 mL硅酸盐液体培养基中，于28 ℃、180 r·min−1条件下振荡培养3 d，重复3次；取上述10 mL菌液于离心管中，10 000 r·min−1、4 ℃下离心10 min后转移至另一个离心管中，加入5 mL70%（体积分数）浓H2SO4和2 mL20%（体积分数）H2O2溶液；放入消煮炉中消煮至黏稠物质变成透明色，用无菌水定容至50 mL，再用原子吸收仪测定其K+含量。
1.3.9 菌株固氮能力测定
使用灭菌牙签挑取已纯化平板上的单菌落，接种在阿须贝固体培养基上，每个平板重复3次，于30 ℃生化培养箱中培养。分别在1 d后和3 d后使用游标卡尺测量透明圆圈直径（D）与菌落直径（d）。
1.3.10 菌株降解纤维素能力测定
运用点接法，将单一菌株用灭菌牙签点接到纤维素刚果红培养基，每个处理重复3次，于28 ℃生化培养箱中倒置培养3 d，测量纤维素透明圈直径。
1.3.11 种子发芽能力的测定
将分离菌株接种于LB液体培养基中，于30 ℃、170 r·min−1的摇床中培养12 h后，将菌液加入96孔板中。 酶标仪波长设置为595 nm，测定菌液光密度值，运用无菌水添加法将菌液的光密度调为1，加无菌水稀释100倍，备用。
将雍菜种子浸泡于10%（体积分数）的双氧水中消毒10 min，用无菌水多次清洗晾干。挑取大小一致、饱满的雍菜种子在菌液中浸泡2 h，以无菌水作为对照，每种菌株重复3次。将浸泡后的种子用镊子转移至铺有湿润滤纸的培养皿中，每个培养皿50粒种子，28 ℃培养72、120 h，分别在第3 天和第5 天时测量雍菜种子发芽率。
1.3.12 植物生长能力的测定
选取15个长势一致的出苗期雍菜幼苗均匀种植于1/2MS固体培养基中。在幼苗根系下方3 cm处滴加200 μL稀释后的菌液，对照组滴加200 μL无菌水。每个处理组重复3次。置于光照培养箱28 ℃、光周期16L∶8D培养10 d，观察平板植物生长状况，并且记录植物的茎长、叶长、叶宽、根长、须根、鲜重等生长指标。
1.4 数据分析方法
采用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析；采用 Microsoft Excel 2010 绘制柱形图，采用 MEGA构建系统发育树。
2. 结果与分析
2.1 菌株形态学鉴定
在普通肉汤琼脂培养基上纯化得到23株假单胞菌属菌株，其中有7株菌株在硅酸盐培养基、无机磷培养基、有机磷培养基、阿须贝固氮培养基和纤维素刚果红培养基上均长势良好。
将7株菌株分别命名为ZGSJ-1、ZGSJ-2、ZGSJ-3、ZGSJ-4、ZGSJ-5、ZGSJ-6、ZGSJ-7，并接种到普通肉汤琼脂培养基上进行培养。其生长形态如图1，菌体镜检如图2所示。菌株ZGSJ-1：菌落扁平，圆形，淡黄色，单一菌落直径3～4 mm；菌体革兰氏染色呈阴性，短棒状。菌株ZGSJ-2：菌落中间凸起，椭圆形，淡黄色，单一菌落直径2～4 mm；菌体革兰氏染色呈阴性，棒状。菌株ZGSJ-3：菌落中间凸起，圆形，淡黄色，单一菌落直径3～4 mm；菌体革兰氏染色为阴性，圆球状。菌株ZGSJ-4：菌落扁平，圆形，黄色，单一菌落直径1～3 mm；菌体革兰氏染色呈阴性，圆球形。菌株ZGSJ-5：菌落中央隆起边缘扁平，圆形，单一菌落直径1～2 mm；菌体革兰阴性菌，小杆状略弯曲。菌株ZGSJ-6：菌落微隆起，微隆起，黄色，单一菌落直径2～3 mm；菌体革兰氏阴性菌，呈杆状。菌株ZGSJ-7：菌落凸起，圆形，淡黄色，单一菌落直径2～4 mm；菌体革兰氏染色为阴性，圆球状。
2.2 菌株生理生化特征鉴定
由表1可知，7株细菌在接触酶试验为阳性，在甲基红、水杨苷、吲哚试验试验中呈阴性，不能水解淀粉，生长pH值为5.7，符合假单胞菌的生理生化特征。其中ZGSJ-1、ZGSJ-7可还原硝酸盐、可分解木糖。在葡萄糖氧化发酵测试（oxidation-fermentation test, OF）中，产碱型细菌为ZGSJ-1、ZGSJ-2，氧化型细菌为ZGSJ-3、ZGSJ-6、ZGSJ-7，发酵型细菌为ZGSJ-4、ZGSJ-5。
表 1 菌株生理生化特征鉴定结果Table 1. Physio-biochemical characteristics of isolates
项目
Item菌株
Strain
项目
Item菌株
StrainZGSJ-1 ZGSJ-2 ZGSJ-3 ZGSJ-4 ZGSJ-5 ZGSJ-6 ZGSJ-7 ZGSJ-1 ZGSJ-2 ZGSJ-3 ZGSJ-4 ZGSJ-5 ZGSJ-6 ZGSJ-7 接触酶
Catalase+ + + + + + + 7%氯化钠
7%sodium
chloride+ − − + + + + 氧化酶
Oxidase− + − − + − − 木糖
Xylose+ − − + − − + 甲基红
Methyl
red− − − − − − − pH5.7 + + + + + + + 明胶液化
Gelatin liquefaction+ − − − − − + 水杨苷
Salicin− − − − − − − 淀粉水解
Starch
hydrolysis− − − − − − − 吲哚
Indole− − − − − − − 硝酸盐
还原
Nitrate
reduction+ − − − − − + L-精氨酸
双水解
L-arginine dihydrolyze− − − + − + − 葡萄糖
Glucose− + + − + + − 葡萄糖OF
Glucose
OF产碱
Alkali production产碱
Alkali production氧化
Oxidation发酵
Fermentation发酵
Fermentation氧化
Oxidation氧化
Oxidation2.3 菌株分子生物学鉴定
提取菌株16S rDNA进行PCR扩增，将扩增产物送至北京奥维森基因科技有限公司测序。基于测定的16S rDNA序列，在NCBI中BLAST比对分析，运用MEGA建立系统发育树，结果如图3所示。菌株ZGSJ-1、ZGSJ-2、ZGSJ-3、ZGSJ-4、ZGSJ-5、ZGSJ-6和ZGSJ-7分别与模式菌株盖氏假单胞菌（Pseudomonas gessardii）KC790316、萨拉曼卡假单胞菌（Pseudomonas_helmanticensis）NR
126220 、莫尔氏假单胞菌（Pseudomonas umsongensis）MF716696、贝提卡假单胞菌（Pseudomonas baetica）KC790260、克氏假单胞菌（Pseudomonas kribbensis）MK240439、克氏假单胞菌（Pseudomonas kribbensis）MK240439、孟氏假单胞菌（Pseudomonas mandelii）OK13585共聚一支，同源性分别为100.0%、99.0%、99.9%、99.8%、99.0%、99.6%和100.0%，结合形态学和生理生化特征，可将7株菌株均鉴定为假单胞菌。2.4 菌株的解磷能力的测定
在卵黄琼脂培养基和无机磷培养基上对7株菌株进行解磷定性测定（表2），通过平板上的浑浊圈直径（解有机磷）和透明圈直径（解无机磷），可以初步确定菌株的解磷定性能力。本试验结果显示，在卵黄琼脂培养基上培养1 d，各菌株所形成的浑浊圈直径为2.91～9.75 mm，浑浊圈直径大小依次为ZGSJ-6＞ZGSJ-1＞ZGSJ-4＞ZGSJ-5＞ZGSJ-7＞ZGSJ-3＞ZGSJ-2，ZGSJ-6浑浊圈直径最大，为9.75 mm，显著高于其他6株菌。培养3 d，浑浊圈直径为4.28～13.71 mm，ZGSJ-1浑浊圈最大，较ZGSJ-2显著提高220.3%（P＜0.05）。在无机磷培养基上培养1 d，透明圈直径在0.63～4.30 mm，ZGSJ-5显著高于除ZGSJ-4外的其他菌株（P＜0.05）。培养3 d，透明圈直径在3.51～7.62 mm，ZGSJ-4最大，较ZGSJ-7增加117.1%，差异显著（P＜0.05）。
表 2 菌株解磷能力的定性测定结果Table 2. Phosphate-degrading ability of isolates菌株
Strain1 d后的浑浊圈直径
Diameter of turbid circle
after 1 d/mm3 d后的浑浊圈直径
Diameter of turbid circle
after 3 d/mm1 d后的透明圈直径
Diameter of transparent ring
after 1 d/mm3 d后的透明圈直径
Diameter of transparent ring
after 3 d/mmZGSI-1 7.79±1.10b 13.71±0.49a 1.66±0.16c 4.27±1.06b ZGSI-2 2.91±2.91d 4.28±0.70c 0.82±0.51d 5.13±0.78b ZGSI-3 3.75±0.74cd 8.05±0.49b 0.63±0.35d 5.45±0.8ab ZGSI-4 7.56±0.98b 11.65±2.48a 3.62±0.96ab 7.62±0.78a ZGSI-5 4.92±0.52c 9.07±0.36b 4.30±0.11a 4.31±0.85b ZGSI-6 9.75±0.80a 12.05±0.67a 1.93±0.07c 4.82±2.75b ZGSI-7 4.12±0.00cd 7.95±0.29b 2.94±0.24b 3.51±0.01b 同列不同小写字母表示差异达显著水平（P＜0.05）。下同。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences at P＜0.05. Same for below.解磷量通过检测发酵液中的P含量确定，菌株在有机磷液体培养基和无机磷液体培养基下培养3 d，测得磷质量浓度结果如表3所示。在有机磷液体培养基下测得7株菌的磷质量浓度为5.15～25.41 μg·mL−1，在无机磷液体培养基下测得菌株的磷质量浓度为2.15～22.26 μg·mL−1。其中，菌株ZGSJ-5解有机磷功能显著高于其他菌株，其次为菌株ZGSJ-3。菌株ZGSJ-5解无机磷功能显著高于其他菌株。
表 3 菌株的解磷量Table 3. Phosphorus-degrading capacity of isolates菌株
Strain解有机磷量
Organophosphorus
hydrolysis
/(μg·mL−1)解无机磷量
Hydrolysis of
inorganic phosphorus
/(μg·mL−1)ZGSJ-1 8.08±0.41e 2.15±0.13f ZGSJ-2 7.41±0.39e 2.49±0.43f ZGSJ-3 18.77±0.14b 16.62±0.36b ZGSJ-4 17.79±0.47c 9.46±0.41d ZGSJ-5 25.41±0.77a 22.26±0.68a ZGSJ-6 5.15±0.14f 13.01±0.07c ZGSJ-7 9.76±0.19d 3.06±0.51e 2.5 菌株的解钾能力的测定
菌株的定性结果如表4所示。培养1 d后，各菌株所形成的解钾黄色光圈直径为3.01～21.66 mm，解钾黄色光圈直径大小依次为ZGSJ-3＞ZGSJ-4＞ZGSJ-1＞ZGSJ-6＞ZGSJ-7＞ZGSJ-2，ZGSJ-3解钾黄色光圈直径最大，为21.66 mm，显著高于其他菌株。培养3 d后，解钾黄色光圈直径为11.12～21.85 mm，ZGSJ-3解钾黄色光圈最大，较ZGSJ-2显著提高96.5%。
表 4 菌株解钾能力的定性测定结果Table 4. Potassium-degrading ability of isolates菌株
Strain1 d后的黄色光圈直径
Diameter of yellow
aperture after
1 d /mm3 d后的黄色光圈直径
Diameter of yellow
aperture after
3 d /mmZGSI-1 9.18±1.39c 13.70±1.94bc ZGSI-2 3.01±0.42e 11.12±1.85c ZGSI-3 21.66±0.40a 21.85±0.60a ZGSI-4 12.17±2.29b 16.98±0.19b ZGSI-5 5.99±1.73d 14.00±3.10bc ZGSI-6 8.25±1.34cd 17.61±3.58b ZGSI-7 3.48±0.67e 11.49±1.39c 如图4所示，培养3 d，7种菌株菌液中的K+含量均大于CK，ZGSJ-3最高，达14.33 μg·mL−1，较CK显著增加374.5 %。菌株ZGSJ-5、ZGSJ-7、ZGSJ-2解钾量较CK分别显著增加198.7%、165.89%、150.0%，其他菌株与CK无显著差异。
2.6 菌株的固氮能力的测定
在阿须贝固氮培养基上对7株菌株进行固氮能力测定，结果（图5）表明，通过测量平板上菌落的透明圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d），可以初步确定菌株的固氮能力。在阿须贝固氮培养基上培养1 d，各菌株所形成的透明圈直径（D）和菌落生长直径（d）的比值（D/d）为1.29～1.77，D/d大小依次为ZGSJ-3＞ZGSJ-7＞ZGSJ-5＞ZGSJ-4＞ZGSJ-1＞ZGSJ-2＞ZGSJ-6，ZGSJ-3 D/d最大，为1.77，显著高于其他菌株。培养3 d，D/d为1.33～1.86，ZGSJ-3 D/d最大，较ZGSJ-6显著提高39.8%。
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图 5 菌株固氮透明圈直径与菌落生长直径的比值不同小写字母表示同一时期不同处理间差异显著（P＜0.05）。Figure 5. Colony D/d ratios of isolates on mediaDifferent lowercase letters indicate significant difference in different treatment on the same period (P＜0.05).2.7 菌株降解纤维素能力的测定
不同菌株降解纤维素功能测定结果如图6所示，7种菌株均具有降解纤维素功能，且降解纤维素功能存在显著差异，培养3 d，降解纤维素的透明圈直径在4.61～10.22 mm，效果最好的为菌株ZGSJ-6，降解纤维素功能较差的为ZGSJ-4。
2.8 菌株对雍菜种子发芽的影响
由表5可知，不同菌株菌液处理均可促进雍菜种子发芽。在光照培养箱内培养3 d，测得对照组发芽率为53.3%，试验组发芽率在63.3%～80.0%，较CK相比，发芽率提高了18.8%～50.1.5%，ZGSJ-2、ZGSJ-3发芽率最高，均为80.0%，显著高于除ZGSJ-5外的其他菌株。浸种培养5 d，CK的发芽率为63.3%，试验组发芽率在66.7%～96.7%，比CK提高5.4%～52.8%，菌株ZGSJ-5处理雍菜种子发芽率最高，为96.7%。综合评价发现，假单胞菌菌液的使用可显著提高雍菜种子萌发，提高其发芽率，在第3 天、第5 天时ZGSJ-3、ZGSJ-5发芽率高。
表 5 菌株对雍菜发芽率的影响Table 5. Effect of isolates on I. aquatica seed germination rate菌株 Strain 第3 天 The 3rd day/% 第5 天 The 5th day/% CK 53.3±5.77d 63.3±5.77d ZGSI-1 63.3±23.09c 66.7±11.55d ZGSI-2 80.0±20.00a 80.0±20.00ab ZGSI-3 80.0±10.37a 80.0±10.00b ZGSI-4 70.0±10.00b 90.0±0.00ab ZGSI-5 76.7±20.81ab 96.7±5.80a ZGSI-6 66.7±5.77bc 76.7±15.3bc ZGSI-7 73.3±11.54b 86.7±11.5a 2.9 菌株对雍菜生长的影响
由表6可知，施用假单胞菌菌液可明显提高雍菜的茎长、鲜重、叶长、叶宽、主根长和须根数，其中ZGSJ-3处理的雍菜茎长比其他菌液处理有明显增加，其茎长为50.25 mm，比CK显著增加41.2%，各个处理茎长整体增量在8.1%～41.2%。施用假单胞菌菌液对鲜重增长不明显，ZGSJ-3、ZGSJ-6、ZGSJ-7菌株处理效果最好，其鲜重为0.22 g。ZGSJ-7的叶长较其他假单胞菌菌液处理增加明显，其叶长为20.23 mm，比CK相比显著增加29.9%。ZGSJ-3的叶宽较其他假单胞菌菌液处理增加明显，其叶宽为3.69 mm，比CK显著增加35.2%。ZGSJ-7处理的主根长最长，为18.36 mm，比CK增加36.3%，ZGSJ-3次之。ZGSJ-4的须根数较CK处理显著增加110.0%，ZGSJ-3次之。茎长、鲜重、叶长和主根长ZGSJ-3较ZGSJ-7处理，对雍菜的生长影响不显著，但较CK处理，促进效果较明显。由此可以看出，施用假单胞菌菌液可以促进雍菜生长，效果以ZGSJ-3、ZGSJ-7较好。
表 6 菌液处理对雍菜生长的影响Table 6. Effect of bacterial broth treatment on I. aquatica growth处理
Treatment茎长
Stem length/mm鲜重
Fresh weight/g叶长
Leaf length/mm叶宽
Blade width/mm主根长
Taproot length/mm须根数
Number of hairsCK 35.60±4.34c 0.21±0.04a 15.57±3.05bc 2.73±0.43c 13.47±3.03de 15.00±8.58d ZGSI-1 38.48±9.44bc 0.18±0.04b 15.79±2.94bc 2.48±0.47e 14.88±3.81d 24.83±7.08b ZGSI-2 48.39±5.52ab 0.20±0.03a 17.01±2.00b 3.08±0.63b 15.92±3.73c 25.00±7.32b ZGSI-3 50.25±7.15a 0.22±0.04a 19.88±3.05a 3.69±0.62a 18.23±3.15a 25.33±4.41ab ZGSI-4 39.23±6.49bc 0.21±0.04a 17.86±3.65ab 3.11±0.63b 14.30±2.76d 31.50±7.61a ZGSI-5 42.87±6.36b 0.17±0.04b 18.99±2.34a 3.67±0.79a 14.32±3.11d 23.17±10.19b ZGSI-6 44.92±3.07b 0.22±0.03a 14.60±3.51c 2.44±0.51de 17.05±4.90b 21.67±7.76c ZGSI-7 46.54±10.76ab 0.22±0.03a 20.23±2.25a 3.25±0.44b 18.36±7.48a 17.50±6.47d 3. 讨论与结论
3.1 讨论
根际促生菌具有解磷、解钾、分泌生长激素的特性，研究其特性对于揭示植物根际微生态调控过程、土壤微生物功能及促进农作物增产等方面具有重要的意义[19−20]。大量研究表明，假单胞菌为根际促生菌的优势菌株：邱睿等[21]从烟草根际土中分离出2株优势细菌，均为假单胞菌；杨彬彬等[22]从高原荒漠灌木霸王和室内盆栽植物的根际土中分离假单胞菌株BP16，具有固氮、解磷、产 IAA、产铁载体等功能，同时显著提高了小麦的株高、根长、叶绿素含量以及干重等多种植物性状。本研究中所得的根际促生菌菌株经生理生化与分子鉴定，筛选出7株假单胞菌属菌菌，均展示了不同的溶磷、解钾、固氮、降解纤维素和促生能力，与上述研究结果一致。
研究表明，不同的假单胞菌解磷、解钾、固氮效果不同[23]。初旭等[24]从杉木人工林根际土壤中筛选到10株溶磷菌，其中CX-7菌株有机磷溶解量最大，达13.5 μg·mL−1，本试验ZGSJ-5菌株有机磷溶解量为25.41 μg·mL−1，明显高于菌株CX-7。彭帅等[25]从番茄根际土壤中筛选到1株解磷荧光假单胞菌LAD6，其最大磷溶解量达24.5 μg·mL−1，与本研究结果相似。本研究7株菌株的解钾量在5.07～14.33 μg·mL−1，不同假单胞菌解钾功能存在差异。解钾量最大的为ZGSJ-3，解钾量为14.33 μg·mL−1，解钾量最小的为ZGSJ-6，解钾量为5.07 μg·mL−1。中国沙棘根际菌解钾能力存在这种巨大差异的现象与张成省等[26]和Sugumaran等[27]研究结果基本一致。这可能是由于菌株生长过程中本身需要消耗的钾离子具有差异，也有可能是因为消煮过程中各个菌株的钾元素分解有所损耗导致的[28,29]。本试验测得降解纤维素的透明圈直径在4.61～10.22 mm，效果最好的为ZGSJ-6，尹国云等[30]从农田土壤中分离出的降解纤维素细菌，其透明圈在10～15 mm，略高于菌株ZGSJ-6，可能的原因是农田生境与高寒草原生境差异明显，农田生境因秸秆大量还田，土壤中纤维素含量明显多于高寒草原生境，因此农田生境中降解纤维素菌株数量多且能力强。
同时，本试验研究发现从沙棘根际土壤中分离出来的假单胞菌菌株可以通过固氮、解磷、解钾和降解纤维素多种作用模式来改良土壤的特性，以提高种子发芽率并促进植物的生长，与王奎萍等[31]、李利坤[32]等和吴菊艳[33]等研究结果一致。杨晓帆等[12]通过对从桃树根区土壤中分离出来的荧光假单胞菌进行促生特性的研究，探索对桃树生长的影响，发现荧光假单胞菌可以通过分泌有机酸、降低pH，提高根区土壤有效磷，在盐碱地生物修复中具有良好应用潜力。本研究中分离出高效假单胞细菌ZGSJ-3和ZGSJ-7，可利用上述高效菌株制成多功能混合菌剂，在生物防治和农业生产领域进行推广应用，以提高农作物的产量和品质。本研究结果为高效生物菌肥的制作提供了理想候选菌株，也为野生中国沙棘多功能根际促生菌株的分离鉴定提供了理论依据。
3.2 结论
本研究从青海野生中国沙棘根际土中分离出7株具有解磷解钾固氮降解纤维素和促生能力的假单胞菌菌株，通过定性和定量测定其解磷解钾固氮降解纤维素能力，结果显示ZGSJ-3解钾能力最强，在改良解钾培养基上培养3 d，解钾黄色光圈最大，直径为21.85 mm，在硅酸盐液体培养基下测得解钾量为14.33 μg·mL−1，比CK增加274.5 %。ZGSJ-3固氮能力最强，培养3 d，D/d最大为1.86，较ZGSJ-6显著提高39.8%。使用假单胞菌菌液可促进雍菜种子的萌发，发芽率较CK显著增加；同时，使用假单胞菌菌液有助于雍菜幼苗鲜重增加，有效促进其生长，其幼苗的茎长、叶长、叶宽和须根数均较CK显著增加，以ZGSJ-3和ZGSJ-7菌株促生效果最明显。通过生理生化和16S rDNA分子鉴定，两株菌分别属于莫尔氏假单胞菌和孟氏假单胞菌，可将其制作成混合菌剂，为后续的菌肥开发与利用提供理想候选菌株。
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图 5 菌株固氮透明圈直径与菌落生长直径的比值
不同小写字母表示同一时期不同处理间差异显著（P＜0.05）。
Figure 5. Colony D/d ratios of isolates on media
Different lowercase letters indicate significant difference in different treatment on the same period (P＜0.05).
表 1 菌株生理生化特征鉴定结果
Table 1 Physio-biochemical characteristics of isolates
项目
Item菌株
Strain
项目
Item菌株
StrainZGSJ-1 ZGSJ-2 ZGSJ-3 ZGSJ-4 ZGSJ-5 ZGSJ-6 ZGSJ-7 ZGSJ-1 ZGSJ-2 ZGSJ-3 ZGSJ-4 ZGSJ-5 ZGSJ-6 ZGSJ-7 接触酶
Catalase+ + + + + + + 7%氯化钠
7%sodium
chloride+ − − + + + + 氧化酶
Oxidase− + − − + − − 木糖
Xylose+ − − + − − + 甲基红
Methyl
red− − − − − − − pH5.7 + + + + + + + 明胶液化
Gelatin liquefaction+ − − − − − + 水杨苷
Salicin− − − − − − − 淀粉水解
Starch
hydrolysis− − − − − − − 吲哚
Indole− − − − − − − 硝酸盐
还原
Nitrate
reduction+ − − − − − + L-精氨酸
双水解
L-arginine dihydrolyze− − − + − + − 葡萄糖
Glucose− + + − + + − 葡萄糖OF
Glucose
OF产碱
Alkali production产碱
Alkali production氧化
Oxidation发酵
Fermentation发酵
Fermentation氧化
Oxidation氧化
Oxidation
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表 2 菌株解磷能力的定性测定结果
Table 2 Phosphate-degrading ability of isolates
菌株
Strain1 d后的浑浊圈直径
Diameter of turbid circle
after 1 d/mm3 d后的浑浊圈直径
Diameter of turbid circle
after 3 d/mm1 d后的透明圈直径
Diameter of transparent ring
after 1 d/mm3 d后的透明圈直径
Diameter of transparent ring
after 3 d/mmZGSI-1 7.79±1.10b 13.71±0.49a 1.66±0.16c 4.27±1.06b ZGSI-2 2.91±2.91d 4.28±0.70c 0.82±0.51d 5.13±0.78b ZGSI-3 3.75±0.74cd 8.05±0.49b 0.63±0.35d 5.45±0.8ab ZGSI-4 7.56±0.98b 11.65±2.48a 3.62±0.96ab 7.62±0.78a ZGSI-5 4.92±0.52c 9.07±0.36b 4.30±0.11a 4.31±0.85b ZGSI-6 9.75±0.80a 12.05±0.67a 1.93±0.07c 4.82±2.75b ZGSI-7 4.12±0.00cd 7.95±0.29b 2.94±0.24b 3.51±0.01b 同列不同小写字母表示差异达显著水平（P＜0.05）。下同。
Data with different lowercase letters on same column indicate significant differences at P＜0.05. Same for below.
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表 3 菌株的解磷量
Table 3 Phosphorus-degrading capacity of isolates
菌株
Strain解有机磷量
Organophosphorus
hydrolysis
/(μg·mL−1)解无机磷量
Hydrolysis of
inorganic phosphorus
/(μg·mL−1)ZGSJ-1 8.08±0.41e 2.15±0.13f ZGSJ-2 7.41±0.39e 2.49±0.43f ZGSJ-3 18.77±0.14b 16.62±0.36b ZGSJ-4 17.79±0.47c 9.46±0.41d ZGSJ-5 25.41±0.77a 22.26±0.68a ZGSJ-6 5.15±0.14f 13.01±0.07c ZGSJ-7 9.76±0.19d 3.06±0.51e
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表 4 菌株解钾能力的定性测定结果
Table 4 Potassium-degrading ability of isolates
菌株
Strain1 d后的黄色光圈直径
Diameter of yellow
aperture after
1 d /mm3 d后的黄色光圈直径
Diameter of yellow
aperture after
3 d /mmZGSI-1 9.18±1.39c 13.70±1.94bc ZGSI-2 3.01±0.42e 11.12±1.85c ZGSI-3 21.66±0.40a 21.85±0.60a ZGSI-4 12.17±2.29b 16.98±0.19b ZGSI-5 5.99±1.73d 14.00±3.10bc ZGSI-6 8.25±1.34cd 17.61±3.58b ZGSI-7 3.48±0.67e 11.49±1.39c
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表 5 菌株对雍菜发芽率的影响
Table 5 Effect of isolates on I. aquatica seed germination rate
菌株 Strain 第3 天 The 3rd day/% 第5 天 The 5th day/% CK 53.3±5.77d 63.3±5.77d ZGSI-1 63.3±23.09c 66.7±11.55d ZGSI-2 80.0±20.00a 80.0±20.00ab ZGSI-3 80.0±10.37a 80.0±10.00b ZGSI-4 70.0±10.00b 90.0±0.00ab ZGSI-5 76.7±20.81ab 96.7±5.80a ZGSI-6 66.7±5.77bc 76.7±15.3bc ZGSI-7 73.3±11.54b 86.7±11.5a
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表 6 菌液处理对雍菜生长的影响
Table 6 Effect of bacterial broth treatment on I. aquatica growth
处理
Treatment茎长
Stem length/mm鲜重
Fresh weight/g叶长
Leaf length/mm叶宽
Blade width/mm主根长
Taproot length/mm须根数
Number of hairsCK 35.60±4.34c 0.21±0.04a 15.57±3.05bc 2.73±0.43c 13.47±3.03de 15.00±8.58d ZGSI-1 38.48±9.44bc 0.18±0.04b 15.79±2.94bc 2.48±0.47e 14.88±3.81d 24.83±7.08b ZGSI-2 48.39±5.52ab 0.20±0.03a 17.01±2.00b 3.08±0.63b 15.92±3.73c 25.00±7.32b ZGSI-3 50.25±7.15a 0.22±0.04a 19.88±3.05a 3.69±0.62a 18.23±3.15a 25.33±4.41ab ZGSI-4 39.23±6.49bc 0.21±0.04a 17.86±3.65ab 3.11±0.63b 14.30±2.76d 31.50±7.61a ZGSI-5 42.87±6.36b 0.17±0.04b 18.99±2.34a 3.67±0.79a 14.32±3.11d 23.17±10.19b ZGSI-6 44.92±3.07b 0.22±0.03a 14.60±3.51c 2.44±0.51de 17.05±4.90b 21.67±7.76c ZGSI-7 46.54±10.76ab 0.22±0.03a 20.23±2.25a 3.25±0.44b 18.36±7.48a 17.50±6.47d
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