Cloning and Biological Characteristics of PpCaMK1 in Pseudocohnilembus persalinus
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摘要:目的
钙调素依赖蛋白激酶（calmodulin-dependent protein kinases, CaMKs）是钙离子介导的信号转导通路中的关键组成部分，可能成为治疗盾纤虫病的药物靶点。本研究试图克隆水滴伪康纤虫（Pseudocohnilembus persalinus）的钙调素依赖蛋白激酶基因，分析其蛋白结构、功能，并基于该蛋白的氨基酸序列构建相关纤毛虫的系统进化树，以阐明水滴伪康纤虫CaMK的进化特征及与相关纤毛虫的系统发育关系。
方法参考水滴伪康纤虫RNA-seq测序结果，利用cDNA末端快速克隆（RACE）技术获得水滴伪康纤虫钙调素依赖蛋白激酶基因的全长cDNA序列，将其命名为PpCaMK1；利用生物信息学方法对该基因的序列特征、基因结构进行分析，预测该基因编码蛋白的理化性质、结构域及蛋白结构等，并构建其与相关纤毛虫CaMK的系统发育树。
结果PpCaMK1基因包含有9个外显子和8个内含子，其cDNA全长为1 737 bp（GenBank序列号：PQ278249），其5′-UTR长度为56 bp，3′-UTR长度为307 bp，ORF总长度为1 374 bp，编码457个氨基酸残基。PpCaMK1总亲水性平均值为−0.802，不稳定指数为54.78，为亲水性不稳定蛋白。亚细胞定位预测分析表明PpCaMK1存在于细胞质-细胞核中。该蛋白无跨膜结构域，无信号肽。蛋白质的二级结构分析结果显示该蛋白含有的无规卷曲占比达50.33%。构建的系统发育树显示，水滴伪康纤虫PpCaMK1与寡膜纲纤毛虫同源蛋白具有较近的亲缘关系。
结论本研究克隆了水滴伪康纤虫PpCaMK1基因的全长cDNA，阐明该基因的结构，并初步分析PpCaMK1蛋白的基本理化性质及结构特征，结果可作为进一步研究PpCaMK1功能的基础，并为深入探究水滴伪康纤虫钙调素依赖蛋白激酶基因家族提供参考。
Abstract:ObjectiveGene associated with the calmodulin-dependent protein kinases (CaMKs) from Pseudocohnilembus persalinus was cloned to study its protein structure and function as well as genetic relation and evolutionary characteristics for the development of treatment for the parasitic scuticociliatosis in aquaculture species.
MethodBased on the RNA-seq of P. persalinus, the full-length cDNA sequence of PpCaMK1 was obtained using the Rapid Amplification of cDNA Ends (RACE) technique. Bioinformatic methods were employed to analyze the features, structure, physicochemical properties, domains and phylogenetic relationships with other ciliates of the gene.
ResultPpCaMK1 contained 9 exons and 8 introns. The full cDNA length was 1 737 bp (GenBank accession number: PQ278249) including a 5'-UTR of 56 bp, a 3'-UTR of 307 bp, and an ORF of 1 374 bp and encoded 457 amino acids. It was a hydrophilic and unstable protein with an average overall hydrophilicity of −0.802 and an instability index of 54.78. Distributed within the cytoplasm and nucleus, PpCaMK1 notably lacked the transmembrane domains and signal peptides and had a secondary structure composed of a significant proportion (i.e., 50.33%) of random coils. P. persalinus closely related to other ciliates in the class Oligohymenophorea.
ConclusionThe full-length cDNA of PpCaMK1 was successfully cloned and the basic biological and physicochemical characteristics studied paving the way for further research on the development of an effective treatment of the devastating disease on marine lives in aquacultural environment caused by the parasite P. persalinus.
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Keywords:
- Pseudocohnilembus persalinus /
- CaMK /
- gene cloning /
- bioinformatics
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0. 引言
【研究意义】随着现代工业的发展，大量含有镉（Cd）的废气、废水因冶炼、采矿等进入环境中。通过食物链的富集作用，Cd在人体内蓄积并对人体造成危害，引发癌症、痛痛病和糖尿病等病症[1]。因湖南的镉大米事件，水稻镉污染超标事件备受关注。而早在21世纪初期就有报告指出我国生产的水稻中约有10%存在Cd含量超标的问题[2]。2013年广西地区镉污染超标1.3倍，贺江流域鱼群大量死亡[3]。2013年广东省食品药品监督局多次批评报道了稻米产品中Cd含量高于国家食品安全标准限制[2]。直至目前，大米中Cd含量超标问题依旧没有得到有效解决，稻米Cd超标已经成为我国粮食安全的大问题[4]。【前人研究进展】在广西、南京、湖南等重金属污染严重的地区，大量关于农田重金属污染的治理研究已经展开，研究结果表明这些地区的Cd污染严重超标，应当加强对农田重金属Cd污染控制技术的开发和研究[5-7]。在农田重金属污染状况不容乐观的背景下，重金属污染来源解析已成为研究热点。有研究表明农田重金属Cd污染输入的主要途径包括大气沉降、生活污水、商品肥和有机肥料等[8-12]。刘红恩等的研究表明，污水灌溉区土壤中重金属含量远远高出清洁水灌溉[13]。Wu等的田间试验研究表明施用猪粪能增加表层土壤Cd浓度，但秸秆还田对土壤中Cd含量的影响不显著[14]。Liu等的研究表明，新沉降的重金属更容易在土壤中累积[15]。而在湖南地区，大气沉降是重金属Cd的主要来源[11,16]。【本研究切入点】大多数研究均是针对少量的重金属污染来源对土壤或者植物的影响进行比较，而针对性地利用调控措施系统探讨重金属来源-土壤-水稻中重金属迁移和累积的影响研究较少。【拟解决的关键问题】本研究通过在湖南典型重金属污染区域布设田间小区，研究沉降截源、施用石灰、清洁水灌溉、秸秆离田以及秸秆还田等措施对土壤-水稻系统重金属Cd累积的影响，旨在通过不同污染源控制措施为重金属污染农田土壤治理和农产品安全提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 区域概况
醴陵市是高度工业化的区域，该地区重金属污染的来源主要是广泛分布的有色金属矿床和冶炼工厂，该处试验点位于醴陵市的一个村庄（113.22°E，27.58°N），附近有一个铅锌矿藏，污染源主要来自有色金属冶炼产生的废气。益阳试验点位于赫山区的一个小村庄（112.54°E，28.51°N），属于没有明显污染来源的耕地保护区。
采集试验点大田土壤样品及地表地下水样品分析，结果（表1）发现，益阳属于Cd轻度污染区域（0.38 mg·kg−1），而醴陵属于Cd中度污染区域，土壤Cd质量浓度高达1.13 mg·kg−1。益阳试验点与醴陵试验点均属于酸性土壤，醴陵土壤的pH值（4.82）比益阳土壤耕地pH值（5.65）更低，重金属具有更高的活性，醴陵试验田中重金属Cd的有效态含量达0.83 mg·kg−1，远超过益阳土壤（0.14 mg·kg−1）。虽然两个试验点均属Cd污染区域，但是两个试验点地下水（清洁水）中的Cd含量均非常低，同时灌溉水含量也未超标，但醴陵试验点灌溉水中Cd含量较益阳试验点要高得多。
表 1 试验田基本信息及灌溉水与清洁水中镉含量Table 1. Basic information on test sites and Cd contents of irrigation and clean water试验点
Experimental sitepH 土壤有机质
SOM/（g·kg−1）二乙烯三胺五乙酸-镉
DTPA-Cd/（mg·kg−1）总镉
Total Cd/（mg·kg−1）灌溉水镉含量
Cd in irrigation water /（μg·L−1）清洁水镉含量
Cd in clean water /（μg·L−1）醴陵 Liling 4.82 41.38 0.83 1.13 0.31 0.012 益阳 Yiyang 5.68 36.44 0.14 0.38 0.13 0.002 1.2 试验设计
分别在醴陵市与益阳市各布设5个处理：沉降截源（T1，地表径流水灌溉，秸秆还田，小区用透明胶板做顶，使用镀锌钢架作支柱，100尼龙纱网作围墙，建成一个高3 m 的透明简易棚，用来截断大气的干湿沉降）；石灰调控（T2，地表径流水灌溉，秸秆还田，在水稻播种前于小区中施用石灰并翻耕混匀，石灰施用量为1500 kg·hm−2；清洁水灌溉（T3，使用当地地下水进行灌溉，秸秆还田）；秸秆离田（T4，地表径流水灌溉，水稻收获后，水稻秸秆全部离田处理）与秸秆还田（CK，地表径流水灌溉，与大部分湖南水稻田秸秆处理模式相同，前茬水稻收获后，水稻秸秆全部归还于小区）。除沉降截源处理外，其余4个处理均无沉降截源装置。每个处理3次重复，2个试验点总共30个小区，每个小区面积约为4 m2，由塑料膜包裹小区田埂并埋入水稻田中来减弱各个小区之间及其与大田之间的相互影响。小区位于大田之中，与农户合作管理，在水稻整个生长期间均按照当地一般农田的管理模式进行管理。农户负责灌溉（T3处理小区需挑水灌溉）、施肥、除草及除虫事宜。整个试验从2016年5月始至2017年10为止。
试验中所用水稻品种为中早39号， 2016年5月中旬种植水稻，均采用插播种植水稻。水稻种植之前采集土壤样品、地表径流水、地下水。水稻种植前施用复合肥600 kg·hm−2做底肥，追肥150 kg·hm−2。10月上旬水稻收获后布设试验，5个处理随机分布，将秸秆离田小区的稻草全部离田。其余小区的水稻秸秆全部还田，冬季歇田。并于2017年5月开始继续种植水稻，水稻种植之前采集土壤样品，种植管理方式同2016年。于2017年10月收获水稻后，采集成熟期水稻样品。
1.3 样品采集及分析
于2017年10月份采集成熟期水稻样品。于每个小区中随机采集水稻植株3棵并装袋。水稻带回实验室后先用自来水冲洗，后用超纯水洗净，将水稻的籽粒、茎、叶和根分离。将水稻各部位放入烘箱中105 ℃杀青120 min后75 ℃烘干至恒重。然后将水稻各部位样品用粉碎机粉碎后密封保存。分别采集两个试验点水稻田表层土壤（0～20 cm），自然风干后，除去杂物，研磨过20目和100目尼龙筛后放入聚乙烯封口袋中保存备用。土壤pH值采用土水比为1∶2.5（m/V）浸提，pH计（雷磁，PHS-3C）测定。土壤有机质含量（Soil organic matter，SOM）测定采用低温外热重铬酸钾氧化-比色法[17]。植物样品采用硝酸消解，土壤样品采用盐酸-硝酸-高氯酸消解，土壤中有效态镉用二乙烯三胺五乙酸（DTPA）提取[18]。采用BCR分布提取步骤提取土壤中重金属各形态分布[11]。同时收集当地地表灌溉水和地下清洁井水，使用硝酸消解[16]。消解液和提取液中镉含量采用电感耦合等离子体发射光谱仪（Optima 8300，PerkinElmer）测定。每批消解样采用空白样品和土壤标准物质（GBW07405）或灌木枝叶标准物质（GBW07603）同时消解，所有样品分析检测过程中每20个样品加测一个标准液进行质量控制，土壤和植物样品镉回收率均高于95%。
镉的生物富集系数（BCF）与转运系数（TF）采用以下公式分别计算，其中Ct表示水稻地上部各组织（茎、叶、籽粒）中镉含量；Cs代表土壤中镉总量；Cr代表水稻根中镉含量。
BCF=CtCs;TF=CtCr。 1.4 数据分析
数据统计采用Microsoft Excel 2007进行分析，采用Origin 8.0软件作图。单因素方差分析（One-way ANOVA）和相关性分析均采用SPSS 19.0完成，P＜0.05表示处理间存在显著性差异。
2. 结果与分析
2.1 不同调控措施对土壤pH值、有机质及有效态Cd含量的影响
由图1可知，经过各处理1年之后土壤中各指标发生变化，无论是高污染土壤还是低污染土壤，与秸秆还田相比，秸秆离田处理后土壤pH值最低，但没有显著差异。T1处理土壤pH值也稍有下降，T2处理的土壤pH值最高，显著高于其他处理（P＜0.05），而使用T3处理的农田土壤pH与CK相比没有明显变化。各处理中，秸秆离田处理土壤的有机质含量最低，但差异不显著；其他各处理间有机质含量并没有明显差异；益阳土壤与醴陵土壤具有相同的变化趋势。各处理中Cd的有效态含量除T2处理外，无显著差异，T2处理下Cd的有效态含量显著降低。
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图 1 不同处理下土壤pH、SOM以及DTPA-Cd的含量注：图中不同字母表示不同水平处理间存在显著差异（P＜0.05），下同。Figure 1. pH and contents of SOM- and DTPA-Cd in soil under different treatmentsNote: Data with different letters on same row indicate significant difference between treatments (P＜0.05). Same for the following figures.2.2 不同调控措施对水稻植株Cd含量的影响
结果（图2）显示，无论是低污染区还是高污染区，水稻各部位重金属镉含量表现出根＞茎＞叶＞籽粒的规律。各处理在两个试验点中水稻各部位Cd含量与对照相比均有一定程度下降，其中以施用石灰效果最佳。与对照相比，两个试验点T2处理下水稻根中Cd含量均有下降趋势，但醴陵水稻根Cd含量下降不显著，而益阳水稻根中Cd含量下降达到显著水平，两个试验点水稻根中Cd含量降幅分别为29%和8%。T2处理中茎、叶以及籽粒中Cd含量都有较大下降，其中醴陵与益阳试验田籽粒中Cd含量的降幅分别为40%与24%，均达到显著水平。
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图 2 不同处理下试验区水稻各部位Cd含量Figure 2. Cd content in parts of rice plant at sites under different treatments2.3 不同调控措施对土壤Cd形态分布的影响
为进一步探讨各处理对农田系统中土壤的影响，分别对两个试验点的土壤进行了BCR分布提取试验，其结果如图3所示。两处试验点土壤中Cd的弱酸提取态含量约为40%左右，不同的是益阳土壤中Cd的残渣态含量约为20%，高于醴陵土壤（约17%）。与CK相比，两个试验点土壤T2处理中Cd的F1形态含量较其他处理低。T4处理下，各试验点土壤中F1形态含量均最高，但未达到显著水平。两处试验田T1、T3处理中土壤与CK相比，其Cd形态并没有明显变化。
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图 3 各处理下土壤中Cd的形态分布注：F1 ：弱酸提取态，F2：可还原态， F3：可氧化态，F4：残渣态。Figure 3. Distribution of varied fractions of Cd in soils under different treatmentsNote: F1: acid-extractable; F2: reducible fraction; F3: oxidizable fraction; F4: residual fraction.2.4 不同措施对水稻地上部Cd累积与转运的影响
为进一步探讨各处理对水稻富集与转运镉的影响，计算水稻各部位对Cd的富集系数与转运系数。从表2可看出，各处理下水稻茎、叶和籽粒对Cd的富集系数较CK相比均有不同程度地降低。其中T2处理下水稻叶片及籽粒中Cd的富集系数显著下降。同时，T2处理下茎、叶及籽粒的转运系数也较低，但是其差异并不明显。此外，T1与T3处理中，水稻各部位BCF值较CK相比均有所降低，但不显著。除T2处理中水稻籽粒的转运系数与CK相比显著下降外，水稻其他部位镉的转运系数并无明显差异。T4处理下，两个试验点中水稻茎、叶及籽粒对Cd的富集系数与转运系数均有所下降，但差异并不明显。
表 2 水稻各部位镉的富集系数与转运系数Table 2. Bioconcentration and translocation coefficients of Cd in rice tissues试验点
Site处理
Treatments富集系数 Bioconcentration factors 转运系数 Translocation factors 根 Root 茎 Stem 叶 Leaf 籽粒 Grain 茎 Stem 叶 Leaf 籽粒 Grain 益阳 Yiyang T1 17.253±1.380 a 6.583±0.527 a 4.469±0.358 a 1.195±0.096 a 0.382±0.031 a 0.259±0.021 a 0.069±0.006 ab T2 12.750±1.148 b 4.854±0.437 b 3.469±0.312 b 0.776±0.070 b 0.381±0.034 a 0.272±0.024 a 0.061±0.005 b T3 16.651±1.565 a 6.430±0.604 a 4.604±0.433 a 1.244±0.117 a 0.386±0.039 a 0.277±0.028 a 0.075±0.007 a T4 18.245±1.642 a 7.263±0.654 a 4.958±0.446 a 1.260±0.113 a 0.398±0.036 a 0.272±0.024 a 0.069±0.006 ab CK 17.911±1.684 a 7.294±0.686 a 5.109±0.480 a 1.297±0.122 a 0.407±0.041 a 0.285±0.029 a 0.072±0.007 ab 醴陵 Liling T1 13.082±1.177 a 5.711±0.514 a 3.206±0.289 ab 0.679±0.061 a 0.437±0.039 a 0.245±0.022 a 0.052±0.005 a T2 12.642±0.758 a 5.570±0.334 a 2.844±0.171 b 0.545±0.033 b 0.441±0.026 a 0.225±0.013 a 0.043±0.003 b T3 13.164±0.921 a 5.678±0.397 a 3.401±0.238 a 0.707±0.049 a 0.431±0.030 a 0.258±0.018 a 0.054±0.004 a T4 13.373±1.070 a 5.998±0.480 a 3.435±0.275 a 0.704±0.056 a 0.448±0.036 a 0.257±0.021 a 0.053±0.004 a CK 13.737±1.099 a 6.361±0.509 a 3.602±0.288 a 0.714±0.057 a 0.463±0.037 a 0.262±0.021 a 0.052±0.004 a 注：同一列中不同字母表示不同水平处理间存在显著差异（P<0.05）。
Note: Different letters in the same row indicate significant difference in different treatments (P<0.05).3. 讨论
许多研究表明，土壤pH值和SOM含量对土壤中重金属的生物有效性具有较大影响，并能间接影响到植物对重金属的富集行为[16,18-20]。本研究结果显示，秸秆还田在一定程度上可提高土壤的pH值，这与其他研究相似[21-22]。pH值的变化通常会引起土壤中重金属有效态含量的变化[16-17,21]，本研究结果表明，在T2处理中，土壤中Cd的有效态含量显著降低，其他处理相较于CK则没有明显差异。这是由于施用石灰导致土壤pH升高，土壤胶体表面负电荷量增加，增强了土壤胶体对Cd的吸附[23-24]，其有效态含量因而下降。各处理下，土壤中SOM的含量并未有显著性变化，但秸秆离田处理下SOM含量比其他处理要稍微低一些，这可能是秸秆还田过程中水稻秸秆中有机质归还农田所致。
经各处理后水稻各部位中Cd含量均有一定程度下降，其中以T2处理水稻Cd含量下降最为显著，这与其他研究结果一样[24-26]。各处理下，水稻籽粒中Cd含量较CK均有所降低，其中以T2处理降低效果最为显著，醴陵试验点水稻籽粒Cd含量从0.71 mg·kg−1降低到了0.55 mg·kg−1，降幅约为24%，益阳试验点水稻籽粒中Cd含量从0.50 mg·kg−1降低到了0.30 mg·kg−1，降幅高达40%。说明施用石灰能够显著降低水稻对重金属的累积，这与其他研究结果相一致[24-26]。虽然益阳水稻籽粒Cd含量并未达到国家标准（GB 2762—2017）[27]，但增加石灰施用量或持续对土壤施用石灰可能使低污染区域农产品达到安全水平。其次是T1处理，醴陵与益阳水稻籽粒中Cd含量分别降低为0.68、0.46 mg·kg−1，降幅分别达到5%与8%。有研究表明，较高的大气沉降量会带来更多的重金属输入通量[9,11,16]，这是T1处理下水稻镉含量相较于CK要低的主要原因。而使用清洁水灌溉，对降低水稻镉累积有一定效果但并不明显，可能是清洁水灌溉虽然降低了镉的输入，系统中镉的总通量减少，但灌溉水中镉含量远远低于土壤中镉含量。而秸秆离田处理，将含有高浓度镉的污染秸秆移除小区，增加了小区农田系统中镉的输出通量，虽然在本研究中其对镉的移除效率不高，但长期逐年维持镉的输出通量，将有效降低土壤中镉的污染程度。此外，秸秆还田增加了农田系统镉的输入通量，并增强了水稻对镉的累积。已有不少研究表明秸秆还田会增加农田土壤中重金属有效态的含量，同时使植物体内积累更多的有毒有害的重金属[28-30]。
两处试验点土壤中镉的F1形态约为40%左右，而益阳土壤中镉的F4形态高于醴陵土壤。这与土壤的pH有关，土壤的pH值越低，其重金属活性越强，F1+F2+F3的含量就越高[16]，因此，醴陵土壤中镉的残渣态含量较益阳的低。 石灰处理中土壤镉的F1形态含量最低，说明添加石灰对土壤中弱酸提取态镉的影响最大。同时F1的含量直接影响植物对镉的累积，F1含量越低，植物对镉的累积能力就越低，这一结果符合上述水稻各部位中镉含量变化的结果。值得注意的是，秸秆离田处理下，其F2含量均较CK有所降低，这说明，在秸秆离田处理下，土壤中F2形态向F1形态进行了转化。虽然有研究表明秸秆还田将增加土壤中F3形态的含量[22]，但在本研究中并没有发现这一现象，有可能是短期试验结果不太显著，需要长期监测考证。
各处理措施下水稻对镉的富集能力较CK相比均有不同程度地降低。其中石灰处理下水稻茎，叶及籽粒对镉的富集系数显著下降；益阳与醴陵水稻样品中茎、叶及水稻籽粒富集系数分别下降33%、32%、40%与12%、20%、23%。表明施用石灰能够有效降低植物对Cd的富集，这与多数研究结果一致[22,24-26]。而石灰处理下茎、叶及籽粒的转运系数虽然也较低，但是其差异并不明显，这可能是受水稻品种自身对重金属的转运能力所影响。此外，T1与T3处理中，试验田水稻中BCF值较CK相比均有所降低，说明截断大气沉降或使用清洁水灌溉处理可能会减少镉在水稻植株体内积累，这可能是因为隔绝大气沉降与使用清洁水灌溉，是对镉的输入源头进行了控制，降低了整个土壤-水稻系统中镉的输入通量，减少了水稻对镉的吸收，但有待长期试验考证。T1处理中水稻叶片的转运系数与CK相比显著下降是由于其他处理水稻叶片没有隔绝大气沉降颗粒物，从而导致水稻叶片接触大量的含有镉的颗粒物[15-16,31]，从而使水稻叶片具有较高的转运系数。而T4处理下，两个试验点水稻对镉的富集系数与转运系数变化差异不明显，这说明秸秆离田更多的是影响农田体系中Cd的输入输出平衡，在短期内对后茬作物的影响程度有限。
4. 结论
（1）在本研究的几种农艺措施中，施用石灰处理能有效降低土壤中有效态镉的含量。此外，沉降截源处理与施用石灰及清洁水灌溉均能降低水稻茎叶及籽粒对镉的累积。表明水稻各部位所积累的镉并不仅仅只是来源于土壤，还与周边空气质量和灌溉水有较大关联，说明土壤的安全利用与农产品的安全生产不能仅考虑土壤一个因素。
（2）沉降截源、施用石灰、清洁水灌溉及秸秆离田处理下糙米中镉含量均有不同程度的降低。其中以添加石灰与沉降截源效果较好，在低污染区益阳与高污染区醴陵，添加石灰处理下水稻籽粒中镉含量分别下降了40%与24%；而沉降截源处理下水稻籽粒中镉含量分别下降了8%与5%。虽然各处理在低污染区及高污染区均未能使水稻籽粒中镉含量达标，但是添加石灰与秸秆离田处理改变了土壤中镉的形态分布，其长期作用下应能逐渐改善土壤环境质量。因此，污染农田的治理应采取相应的控源措施，如施用石灰与秸秆离田等，同时还可结合植物修复等技术，在闲田的时候进行修复，以保证农产品的安全生产。
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图 1 PpCaMK1核心片段的克隆（A）和PpCaMK1 3′端和5′端的克隆（B）
M：DL1000 DNA Marker。 A：1~3分别为核心片段1、核心片段2、核心片段3 。B：1为3′RACE ，2为5′RACE。
Figure 1. Cloning PpCaMK1 core fragment (A) and 3' and 5' (B)
M: DL1000 DNA marker; A: 1, 2, and 3 were core fragments 1, 2, and 3, respectively; B: 1 was 3′RACE, 2 was 5′RACE.
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图 2 水滴伪康纤虫CaMK1基因全长cDNA序列及对应的氨基酸序列
ORF用大写字母表示，5′-UTR和3′-UTR用小写字母表示。起始密码子加框显示，终止密码子以星号标注。
Figure 2. Full-length cDNA sequence and corresponding amino acid sequence of PpCaMK1
ORF domain shown in uppercase letters; 5′-UTR and 3′-UTR domains in lowercase letters; start codon in box; stop codon with asterisk.
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图 3 水滴伪康纤虫CaMK1的DNA和mRNA结构
蓝线表示非翻译区，黑线表示内含子，长方形表示外显子。
Figure 3. Schematic DNA and mRNA of PpCaMK1
Blue line represents untranslated region; black line, introns; and rectangles, exons.
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图 6 水滴伪康纤虫PpCaMK1蛋白与其他生物的多序列比对
Figure 6. Multiple sequences of PpCaMK1 and those of other organisms
表 1 水滴伪康纤虫CaMK1基因克隆中应用的引物
Table 1 Primers used for cloning PpCaMK1
引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence（5′-3′）目的
Purposec15077 F1 GGTTTAGAGTTTAGACGCTGA PpCaMK1核心片段1克隆 c15077 R1 CTTCGTCCCAGTCGATTAAC PpCaMK1核心片段1克隆 c15077 F2 TTGGTGTTTCTATGGTCGCA PpCaMK1核心片段2克隆 c15077 R2 CTTCTTCGTTTACCTCCTCC PpCaMK1核心片段2、3克隆 c15077 F3 GCTGATGATGGACAGTTAATCG PpCaMK1核心片段3克隆 c15077 3′ F1 GATTACGCCAAGCTTCGACTGGGACGAAGAGGATTCAAAGTGG 第一轮3′ RACE 克隆 c15077 3′ F2 GATTACGCCAAGCTTGTTCAAAGGGTTACTCTGGTAAAGCTGC 第二轮3′ RACE克隆 c15077 5′ R1 GATTACGCCAAGCTTCCACTTTGAATCCTCTTCGTCCCAGTCG 第一轮5′ RACE克隆 c15077 5′ R2 GATTACGCCAAGCTTTTACCATCAGCGTCTAAACTCTAAACCAT 第二轮5′ RACE克隆 UPM（long） SMARTer RACE 5′/3′Kit（TAKARA code No.050421）提供 通用长引物 UPM（short） SMARTer RACE 5′/3′Kit（TAKARA code No.050421）提供 通用短引物 
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-
[1] 常志强,陈钊,李泽鹏,等. 中兽药驱虫复方制剂防治海水养殖中盾纤毛虫的临床试验研究[J]. 中兽医医药杂志,2019,38(5) :5−9. CHANG Z Q,CHEN Z,LI Z P,et al. Clinical assessment of traditional Chinese medicine compound on the ciliate parasite in marine aquaculture[J]. Journal of Traditional Chinese Veterinary Medicine,2019,38(5) :5−9. (in Chinese)
[2] IGLESIAS R,PARAMÁ A,ALVAREZ M F,et al. Philasterides dicentrarchi (Ciliophora,Scuticociliatida) as the causative agent of scuticociliatosis in farmed turbot Scophthalmus maximus in Galicia (NW Spain) [J]. Diseases of Aquatic Organisms,2001,46(1) :47−55.
[3] 崔龙波,刘冉,王琛,等. 大菱鲆盾纤毛虫病的流行病学调查[J]. 科学养鱼,2015(3) :54−56. CUI L B,LIU R,WANG C,et al. Epidemiological investigation of Scophthalmus maximus shield ciliary disease[J]. Scientific Fish Farming,2015(3) :54−56. (in Chinese)
[4] 潘旭明,马洪钢,邵晨,等. 海洋纤毛虫:水滴伪康纤虫的口器发生及形态学重描述[J]. 水生生物学报,2012,36(3) :489−495. DOI: 10.3724/SP.J.1035.2012.00489 PAN X M,MA H G,SHAO C,et al. Stomatogenesis and morphological redescription of Pseudocohnilembus persalinus (Ciliophora:Scuticociliatida) [J]. Acta Hydrobiologica Sinica,2012,36(3) :489−495. (in Chinese) DOI: 10.3724/SP.J.1035.2012.00489
[5] BRAUN A P,SCHULMAN H. The multifunctional calcium/calmodulin-dependent protein kinase:From form to function[J]. Annual Review of Physiology,1995,57:417−445. DOI: 10.1146/annurev.ph.57.030195.002221
[6] 肖圣燕,程隆基,许凯,等. 桑褐斑壳丰孢菌pmcamk基因的克隆与表达时相分析[J]. 蚕业科学,2023,49(1) :15−22. XIAO S Y,CHENG L G,XU K,et al. Cloning and expression analysis of calcium /calmodulin-dependent protein kinases gene of Phloeospora maculans[J]. Acta Sericologica Sinica,2023,49(1) :15−22. (in Chinese)
[7] 吴迪,赵梓彤,李志勇,等. 玉米大斑病菌钙/钙调素依赖性蛋白激酶(CaMK) 基因家族的鉴定与表达模式分析[J]. 农业生物技术学报,2015,23(8) :1020−1030. WU D,ZHAO Z T,LI Z Y,et al. Identification and expression pattern analysis of calcium/calmodulin dependent protein kinases (CaMKs) gene family in Setosphaeria turcica[J]. Journal of Agricultural Biotechnology,2015,23(8) :1020−1030. (in Chinese)
[8] 蒋倩倩,毛仁燕,李永才,等. 梨果黑斑病菌AaCaMK基因克隆、生物信息学分析及其在侵染结构分化中的表达分析[J]. 微生物学通报,2021,48(12) :4664−4676. JIANG Q Q,MAO R Y,LI Y C,et al. Cloning,bioinformatics and expression analysis of AaCaMK gene on infection structure differentiation of Alternaria alternate,causal agent of pear black spot[J]. Microbiology China,2021,48(12) :4664−4676. (in Chinese)
[9] KATO K,SUDO A,KOBAYASHI K,et al. Characterization of Plasmodium falciparum protein kinase 2[J]. Molecular and Biochemical Parasitology,2008,162(1) :87−95. DOI: 10.1016/j.molbiopara.2008.07.007
[10] KATO K,SUGI T,TAKEMAE H,et al. Characterization of a Toxoplasma gondii calcium calmodulin-dependent protein kinase homolog[J]. Parasites &Vectors,2016,9(1) :405.
[11] XIONG J,WANG G Y,CHENG J,et al. Genome of the facultative scuticociliatosis pathogen Pseudocohnilembus persalinus provides insight into its virulence through horizontal gene transfer[J]. Scientific Reports,2015,5:15470.
[12] 林能锋,曾红. 水滴伪康纤虫全长cDNA文库的构建及EST分析[J]. 福建农业学报,2017,32(9) :921−925. LIN N F,ZENG H. Full-length cDNA Library and EST Analysis on Pesudocohnilembus persalinus[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences,2017,32(9) :921−925. (in Chinese)
[13] 贺斌,黄兴奇,余腾琼,等. cDNA末端快速扩增技术及其方法的改进[J]. 浙江农业科学,2012,53(9) :1352−1357. DOI: 10.3969/j.issn.0528-9017.2012.09.045 HE B,HUANG X Q,YU T Q,et al. Rapid amplification technology of cDNA terminal and its improvement[J]. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences,2012,53(9) :1352−1357. (in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.0528-9017.2012.09.045
[14] HALL T A. BioEdit:a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT[J]. Nucleic Acids Symposium Series,1999,41(2) :95−98.
[15] KUMAR S,TAMURA K,NEI M. MEGA:Molecular Evolutionary Genetics Analysis software for microcomputers[J]. Computer Applications in the Biosciences,1994,10(2) :189−191.
[16] 宫春光,李凤晨. 牙鲆盾纤毛虫病的药物防治试验[J]. 水产科学,2007,26(9) :509−511. DOI: 10.3969/j.issn.1003-1111.2007.09.009 GONG C G,LI F C. Chemical treatment on protozoon Paralembus digitiformis in farmed Japanese flounder[J]. Fisheries Science,2007,26(9) :509−511. (in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1003-1111.2007.09.009
[17] 林能锋,郑晨艳,王侯杰,等. 中草药浸出液体外驱杀两种水产致病性盾纤虫的研究[J]. 福建畜牧兽医,2017,39(5) :13−15. DOI: 10.3969/j.issn.1003-4331.2017.05.006 LIN N F,ZHENG C Y,WANG H J,et al. Repellent effect of Chinese herbal leachate to two species of scuticociliate in vitro[J]. Fujian Journal of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,2017,39(5) :13−15. (in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1003-4331.2017.05.006
[18] 崔青曼,袁春营,李春岭,等. 主要海水养殖鱼类白点病和盾纤毛虫病防治技术[J]. 水利渔业,2007,27(6) :85−87,94. DOI: 10.3969/j.issn.1003-1278.2007.06.037 CUI Q M,YUAN C Y,LI C L,et al. Prevention and control technology of white spot disease and scuticociliatosis in major marine aquaculture fish[J]. Journal of Hydroecology,2007,27(6) :85−87,94. (in Chinese) DOI: 10.3969/j.issn.1003-1278.2007.06.037
[19] 刘荣荣,张进顺,张晓磊,等. 刚地弓形虫棒状体蛋白10的生物信息学分析[J]. 中国病原生物学杂志,2017,12(9) :855−859. LIU R R,ZHANG J S,ZHANG X L,et al. Bioinformatic analysis of rhoptry protein 10 of Toxoplasma gondii[J]. Journal of Pathogen Biology,2017,12(9) :855−859. (in Chinese)
[20] SIVALINGAM G N,SHEPHERD A J. An analysis of B-cell epitope discontinuity[J]. Molecular Immunology,2012,51(3/4) :304−309.
[21] HARMON A C,GRIBSKOV M,HARPER J F. CDPKs–a kinase for every Ca2+ signal?[J]. Trends in Plant Science,2000,5(4) :154−159. DOI: 10.1016/S1360-1385(00)01577-6
[22] KLIMECKA M,MUSZYŃSKA G. Structure and functions of plant calcium-dependent protein kinases[J]. Acta Biochimica Polonica,2007,54(2) :219−233. DOI: 10.18388/abp.2007_3242
[23] LIU H L,CHE Z J,ZENG X R,et al. Genome-wide analysis of calcium-dependent protein kinases and their expression patterns in response to herbivore and wounding stresses in soybean[J]. Functional &Integrative Genomics,2016,16(5) :481−493.
[24] 费小钰,李红丽,王俊皓. 植物钙依赖蛋白激酶CDPK基因功能综述[J]. 吉林农业,2017(9) :104−105. FEI X Y,LI H L,WANG J H. Review on the function of plant calcium-dependent protein kinase CDPK gene[J]. Agriculture of Jilin,2017(9) :104−105. (in Chinese)
[25] SWULIUS M T,WAXHAM M N. Ca2+/calmodulin-dependent protein kinases[J]. Cellular and Molecular Life Sciences,2008,65(17) :2637−2657. DOI: 10.1007/s00018-008-8086-2
-
期刊类型引用(3)
1. 张丽娜，刘鑫，王俊，盛浩. 单次有机肥或石灰施用阻控镉污染酸紫泥田早晚稻镉累积的效应. 土壤与作物. 2025(01): 15-24 . 
百度学术
2. 文耀林，丁华，谢沙，王子钰，辜娇峰，曾鹏，廖柏寒，周航. 秸秆离田对水稻Cd吸收累积的影响与摄入健康风险评估. 环境科学学报. 2024(02): 413-422 . 百度学术
3. 褚傲南，杨义，张全保，张文东，毛翀赟，屠俊，江淦. 钝化与淹水措施对水稻镉吸收积累的影响研究. 安徽农学通报. 2023(16): 96-101 . 百度学术
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