Fluorescent RT-RAA for Diagnosing Epidemic Diarrhea in Pigs
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摘要:目的
建立一种快捷、灵敏、简便检测猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）的RT-RAA检测方法，以提高猪流行性腹泻病毒临床检测效率。
方法针对PEDV S基因片段保守区设计引物和探针，构建标准质粒PEDV-S，通过特异性、敏感性、重复性测定及条件优化，建立检测PEDV重组酶介导链置换核酸扩增荧光法（RT-RAA）。
结果在42 ℃恒温作用20 min的条件下，建立的检测方法对检测猪传染性胃肠炎病毒（porcine transmissible gastroenteritis virus, TGEV）、猪瘟病毒（classical swine fever virus, CSFV）、伪狂犬病病毒（porcine pseudorabies virus, PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus, PRRSV）和猪轮状病毒（porcine rotavirus, PoRV）等猪源病毒均为阴性，猪流行性腹泻病毒（PEDV）为阳性；最低检出限为4.43×102拷贝·μL−1的标准质粒；重复性结果显示，相同浓度标准质粒的差异性很小；利用建立的RT-RAA方法检测40份猪病毒样本，阳性率为7.5%（3/40），与实时荧光定量PCR检测结果相同。
结论本研究建立的PEDV RT-RAA检测方法具有快速简便、耗时短、特异性高、灵敏度强和重复性好等特点，适用于对PEDV的快速诊断。
Abstract:ObjectiveA rapid fluorescence RT-RAA to detect porcine epidemic diarrhea virus (PEDV) was developed and tested for field application.
MethodsPrimers and probes were designed for the conserved region of PEDV-S gene fragment, and a standard plasmid was constructed. Through condition optimization followed by tests for assay specificity, sensitivity, and repeatability, a recombinant enzyme-mediated chain replacement nucleic acid amplification fluorescence RT-RAA for detecting PEDV was established.
ResultsUnder a constant temperature of 42 ℃ for 20 min, the assay detected PEDV as positive, while negative on the porcine transmissible gastroenteritis virus (TGEV), classical swine fever virus (CSFV), porcine pseudorabies virus (PRV), porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), porcine rotavirus (PoRV) and other porcine viruses. It had a minimum detection limit of 4.43×102 standard plasmid copies·μL−1, a reproducibility showing little difference between the standard plasmids of the same concentration, and a positive rate of 7.5% (3 out of 40) on PEDV specimens comparable to that obtained by RT-qPCR.
ConclusionThe newly developed fluorescence RT-RAA for PEDV detection was considered appropriate for rapid diagnosis of epidemic diarrhea in pigs.
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Keywords:
- porcine epidemic diarrhea virus /
- S protein /
- fluorescence RT-RAA
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0. 引 言
【研究意义】 植物甾醇是一类生物活性成分，具有抗氧化、抗肿瘤、预防和治疗心脑血管疾病等作用[1-3]。铁皮石斛（Dendrobium officinale）是名贵中药材，具有增强免疫力、降血糖和抗肿瘤等生理活性[4-5]。已有研究表明铁皮石斛含有豆甾醇、β谷甾醇、γ-谷甾醇和油菜甾醇等植物甾醇类次生代谢产物[6-7]。鲨烯单加氧酶（Squalene Monooxygenase，SQE）又称鲨烯环氧酶（Squalene epoxidase, SE），催化角鲨烯生成2,3-氧化鲨烯[8-9]。环阿屯醇合酶（Cycloartenol synthase, CAS）催化2,3-氧化鲨烯形成环阿屯醇，代谢流向植物甾醇；羽扇豆醇合成酶（Lupeol synthase, LS）、β-香树脂醇合成酶（β-amyrin synthase, β-AS）和达玛烯二醇合成酶（Dammarenediol synthase, DS）催化2,3-氧化鲨烯形成羽扇豆醇、β-香树脂醇和达玛烯二醇，代谢转向三萜类生物合成通道[10-13]。因此，SQE是植物甾醇和三萜类物质合成途径的一个关键限速酶。开展铁皮石斛SQE基因的克隆及表达模式分析，对探讨铁皮石斛植物甾醇生物合成分子机制及代谢调控具有重要的意义。【前人研究进展】 孙蓉等[14]克隆了金龙胆草（Conyza blinii H. Lev）CbSQE基因，编码525个氨基酸，构建了原核表达载体，并在大肠杆菌BL21中成功诱导表达。祝传书等[15]克隆了雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook. f.）TwSE1和TwSE2基因，具76.18%相似性，TwSE1基因在花中表达量最高，TwSE2基因在花和嫩叶中的表达量最高，均受MeJA诱导上调表达，上调幅度TwSE1基因高于TwSE2基因。王学方等[16]对17种大戟科（Euphorbiaceae）植物的SE分析发现只有蓖麻（Ricinus communis）4和木薯（Manihot esculenta）1的SQE具有信号肽；5个没有跨膜结构域，7个只在N末端有跨膜结构域，5个N末端和C末端都有跨膜结构域。此外，在人参（Panax ginseng）[17]、绞股蓝（Gynostemma pentaphyllum）[18]、野三七（Panax vietnamensis var. fuscidiscus）[19]、金铁锁（Psammosilene tunicoides）[20]等药用植物也开展了SQE基因的克隆研究。【本研究切入点】目前，未见铁皮石斛SQE基因的相关研究报道。【拟解决的关键问题】本课题组通过铁皮石斛茎和叶的转录组测序，分析了植物甾醇的生物合成途径相关基因[21]，获得2个带5′末端的SQE基因片段，以此为基础开展全长cDNA及ORF克隆和表达模式分析。本研究通过已获得2个带5′末端的SQE基因片段设计3′RACE引物，克隆基因全长cDNA序列和ORF，并分析2个基因在不同营养生长期铁皮石斛茎和叶中的表达模式，以期为进一步研究铁皮石斛SQE基因功能及植物甾醇生物合成分子机制和代谢调控奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
植物材料为福建冠豸山种源铁皮石斛，2017年种于亚热带农业研究所温室大棚，基质为松树皮，光照强度8 000～10 000 lx，空气相对湿度70%～90%。于不同营养生长期（2018年8月、10月、12月）取铁皮石斛的茎和叶，每个样品3重复，超低温冰箱−80℃保存，用于RNA提取。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取和cDNA合成
按照TaKaRa的RNAiso Plus说明提取铁皮石斛茎、叶的总RNA，检测RNA的质量和浓度。以提取的总RNA为模板，随机引物逆转录合成cDNA第l链。
1.2.2 DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA的克隆
根据已经获得的DoSQE1与DoSQE2基因信息设计用于3′RACE的引物及接头引物（表1）。取8月、10月、12月铁皮石斛茎和叶的cDNA各10 μL混合作为模板，用引物3DoSQE1F1和dT-adaptor、3DoSQE2F1和dT-adaptor分别进行PCR。把PCR产物稀释10倍作为模板，3DoSQE1F2和adaptor、3DoSQE2F2和adaptor进行巢式PCR。反应体系25 μL：ddH2O 8.5 μL，上下游引物（10 μmol·L−1）各1 μL，2×SanTaq PCR Mix 12.5 μL，模板2 μL。PCR反应程序为94℃预变性5 min，然后94℃变性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸60 s，30个循环，最后72℃延伸10 min。PCR产物经电泳检测后，胶回收目的片段，与pMD19-T载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，复苏后涂LB平板（含100 mg·L−1氨苄青霉素），选择经菌落PCR鉴定的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。
表 1 PCR引物序列信息Table 1. Sequence of PCR primers引物名称
Primer name引物序列（5′-3′）
Primer sequence（5′-3′）引物用途
Primer usage3DoSQE1F1 CCTTCCATTGCTAACGGAGAGA DoSQE1基因 3′RACE引物3′RACE primers of DoSQE1 3DoSQE1F2 CCTGGAGCACTTCTAATGGGAG 3DoSQE2F1 CTCTTCCTACACCTGGAGCACT DoSQE2基因3′RACE引物 3′RACE primers of DoSQE2 3DoSQE2F2 TATACCTTGCGTAAGCCCGTTG dT-adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCCTTTTTTTTTTTTTTTTT 3′RACE接头引物 Adaptor primers of 3′RACE adaptor CTGATCTAGAGGTACCGGATCC DoSQE1F CGCGGTACCATGATGCTTCTCCAGTACA DoSQE1基因ORF克隆引物 primers of DoSQE1 ORF clone DoSQE1R CGCGTCGACGGAGTTCTCATTGTGTAGG DoSQE2F CGCGGTACCATGGTGATGCCACTTTCGTA DoSQE2基因ORF克隆引物 primers of DoSQE2 ORF clone DoSQE2R CGCGTCGACGTTGGAAGTTCACCCACGAG DoSQE1-F AGGACGCAAACAGCGAGAG DoSQE1基因表达分析引物 Expression analysis primers of DoSQE1 DoSQE1-R CACCAACGATTCTATGAGGC DoSQE2-F CCCCAGATACCGAGTCAG DoSQE2基因表达分析引物 Expression analysis primers of DoSQE2 DoSQE2-R CCCATCAGAAGTGCTCCAG DoACT-F AGGAAGGCGGCTTTGAATC 内参基因 Reference gene DoACT-R CCATGCCAACCATGACACC 注：下划线碱基为酶切位点。
Note：The ud bases were the enzyme site.1.2.3 DoSQE1与DoSQE2基因ORF的克隆
根据DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA序列设计DoSQE1基因的ORF克隆引物DoSQE1F（带Kpn Ⅰ酶切位点）与DoSQE1R（带Sal Ⅰ酶切位点）和DoSQE2基因的ORF克隆引物DoSQE2F（带Kpn Ⅰ酶切位点）与DoSQE2R（带Sal Ⅰ酶切位点），产物长度分别为1 579 bp和1 645 bp（表1）。以2 μL混合的cDNA为模板，PCR扩增体系和反应程序同上，延伸时间90 s。阳性克隆送去测序。
1.2.4 DoSQE1与DoSQE2基因的生物信息学分析
ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析DoSQE1与DoSQE2基因编码蛋白的理化性质，蛋白跨膜区预测利用TMHMM 2.0（http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/），二级和三级结构预测使用在线工具SSPro（http://scratch.proteomics.ics.uci.edu/）和SWISS-MODEL（https://www.swissmodel.expasy.org/）。采用NCBI的BLAST P搜索DoSQE1与DoSQE2基因编码蛋白的同源序列及保守结构域，通过MEGA6.0（Neighbor Joining Tree, Bootstrap 1000）构建系统进化树[22]。
1.2.5 DoSQE1与DoSQE2基因的表达分析
设计DoSQE1基因引物DoSQE1-F和DoSQE1-R、DoSQE2基因引物DoSQE2-F和DoSQE2-R、内参Actin基因引物DoACT-F和DoACT-R（表1）用于荧光定量PCR。把不同月份茎和叶的cDNA浓度定量为200 ng·μL−1。用Roche LightCycler 96检测DoSQE1与DoSQE2基因在不同生长期铁皮石斛茎和叶中的表达量。反应体系为：TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ（TliRNaseH Plus）10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，ddH2O补足 20 μL。反应程序为：95℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 20 s，45个循环；每个反应设置 3 个重复。利用2−∆∆CT法分析相对表达量[23]，DPS数据处理软件对结果进行方差分析，多重比较采用新复极差法（Duncan法）。
2. 结果与分析
2.1 DoSQE1与DoSQE2基因全长cDNA的克隆
以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用3′RACE引物进行巢式PCR扩增DoSQE1与DoSQE2基因3′末端，DoSQE1与DoSQE2基因分别得到1条特异条带，约800 bp和680 bp（图1-A、C），目的条带经过胶回收、连接、转化和克隆验证后送去测序、测序结果利用DNAMAN V6.0进行序列拼接及ORF预测，获得DoSQE1基因cDNA序列全长1 796 bp（GenBank 登录号MT160182），含有1个1 554 bp的ORF，编码517个氨基酸，5′末端非翻译区24 bp，3′末端非翻译区218 bp；DoSQE2基因cDNA序列全长1 963 bp（GenBank 登录号MT160183），含有1个1 578 bp的ORF，编码525个氨基酸，5′末端非翻译区127 bp，3′末端非翻译区258 bp。
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图 1 PCR产物电泳结果注：M. 分子量标记；A. DoSQE1基因3′RACE；B. DoSQE1基因开放阅读框；C. DoSQE2基因3′RACE；D. DoSQE2基因开放阅读框。Figure 1. PCR products by electrophoresisNote: M. DNA marker; A. 3′RACE of DoSQE1; B. ORF of DoSQE1; C. 3′RACE of DoSQE2; D. ORF of DoSQE2.2.2 DoSQE1与DoSQE2基因开放阅读框的克隆
以不同生长期茎和叶的cDNA混合物作为模板，利用扩增ORF的引物扩增DoSQE1与DoSQE2基因的ORF，电泳结果显示，DoSQE1与DoSQE2基因分别得到1条约1 579 bp和1 645 bp的特异条带（图1-B、D），大小与预测一致。PCR产物经过克隆及验证后送去测序，测序结果经DNAMAN V6.0比对，结果表明获得了DoSQE1与DoSQE2基因ORF，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%。提取阳性克隆的质粒pMD19-T-DoSQE1和pMD19-T-DoSQE2超低温冰箱保存。
2.3 DoSQE1与DoSQE2蛋白基本性质分析
利用ProtParam tool在线分析DoSQE1与DoSQE2蛋白的理化性质。结果表明，DoSQE1蛋白的分子量为56.235 kD，理论等电点为8.96，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为45，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为55，不稳定系数是44.92，总平均疏水性是0.084，属于一种不稳定的疏水性蛋白。DoSQE2蛋白的分子量为56.541 kD，理论等电点为8.77，负电荷的氨基酸残基数（Asp+Glu）为46，正电荷的氨基酸残基数（Arg+Lys）为53，不稳定系数是39.66，总平均疏水性是0.137，属于一种稳定的疏水性蛋白。使用TMHMM Server v.2.0预测DoSQE1与DoSQE2蛋白跨膜区，结果显示（图2），DoSQE1具有2个跨膜区，分别在4～22 aa和55～72 aa；DoSQE2只有1个跨膜区，在5～23 aa。DoSQE1蛋白在204～476 aa、DoSQE2蛋白在211～484 aa处含有鲨烯环氧酶结构域，E值分别为1.32×10−157和3.04×10−154。
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图 2 DoSQE1与DoSQE2蛋白跨膜区预测Figure 2. Predicted transmembrane regions in DoSQE1 and DoSQE22.4 DoSQE1与DoSQE2蛋白空间结构分析
SSPro在线预测DoSQE1与DoSQE2蛋白二级结构结果（图3）表明，DoSQE1和DoSQE2形成无规则卷曲氨基酸残基分别有207（40%）和231（44%）个，形成α螺旋氨基酸残基分别为232（44.9%）个和216（41.1%）个，形成β折叠氨基酸残基都是78个，分别占15.1%和14.9%。通过SWISS-MODEL在线预测，DoSQE1与DoSQE2蛋白3D结构如图4，同源建模的模板都是6c6n.1.A，一致性分别为48.07%和47.37%，建模范围在51～496和78～504位氨基酸残基，覆盖率85%和80%。
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图 3 铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2蛋白的二级结构预测注：大写字母：氨基酸序列；小写字母：二级结构；c：无规则卷曲；h：α螺旋；e：β折叠。Figure 3. Predicted secondary structures of DoSQE1 and DoSQE2 from D. officinaleNote:capital letters show amino acid sequence; lowercase letters show amino acid chain structure, as c for random coil, h for α-helix, and e for β-extended form.![]()
图 4 预测的铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2蛋白三维结构Figure 4. Predicted 3D structures of DoSQE1 and DoSQE2 from D. officinale2.5 DoSQE1与DoSQE2蛋白同源性系统进化分析
使用BLAST P检索DoSQE1与DoSQE2蛋白的同源序列，结果表明：DoSQE1蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris, XP_020599860.1）、高粱（Sorghum bicolor, XP_002468222.1）和油棕（Elaeis guineensis, XP_010936193.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为86%、85%和84%。DoSQE2蛋白的氨基酸与姬蝴蝶兰（Phalaenopsis equestris, XP_020579136.1）、小米（Setaria italica, XP_004985122.1）和玉米（Zea mays, ONL95392.1）SQE氨基酸序列的相似度分别为87%、86%和86%。将DoSQE1与DoSQE2蛋白的氨基酸序列与其他15个物种的SQE氨基酸序列进行系统进化分析，结果（图5）显示，兰科植物的铁皮石斛和姬蝴蝶兰聚为一类，DoSQE1与姬蝴蝶兰的XP_020599860.1亲缘关系最近，DoSQE2与姬蝴蝶兰的XP_020579136.1亲缘关系最近。
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图 5 铁皮石斛DoSQE蛋白系统进化树分析注：图中各节点处数字代表可信度。Figure 5. Phylogenetic tree analysis on DoSQE from D. officinaleNote: the numbers at the node of the figure is credibility.2.6 DoSQE1与DoSQE2基因表达分析
利用qRT-PCR检测DoSQE1和DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达模式，结果（图6）表明，茎和叶中都能检测到2个基因的表达，相同时间叶的表达量显著高于茎。DoSQE1基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量8月份最高，10月份次之，12月份最低。DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的表达量10月份最高，8月份次之，12月份最低。
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图 6 DoSQE1和DoSQE2基因在铁皮石斛茎和叶中的相对表达量Figure 6. Expressions of DoSQE1 and DoSQE2 in stems and leaves of D. officinale3. 讨论与结论
鲨烯单加氧酶是三萜类和甾醇类化合物生物合成关键酶。本研究克隆了铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因，核苷酸序列相似度为79.78%，编码氨基酸相似度为80.95%，含有鲨烯环氧酶结构域。DoSQE1与野三七的PvfSE[19]一样具有2个跨膜区；DoSQE2与雷公藤的TwSE2[15]一样仅有1个跨膜区。由于DoSQE1和DoSQE2跨膜区个数不同，推测蛋白在膜内和膜外的结构不一样，催化活性也存在差异。
不同植物具有不同的SQE基因拷贝数[24]，不同SQE基因组织表达模式也具有差异。雷公藤TwSE1基因表达量最高的是花，最低的是根；TwSE2基因表达量最高的是花和嫩叶，最低的是老叶[15]。DEVARENNE[25]等研究发现，提高或降低SQE基因的表达量，三萜皂苷的生成量也随之增加或减少。CHOI等[26]研究表明，茉莉酸甲酯（MeJA）诱导提高SQE基因的表达，增加了三萜的合成量。铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因在茎和叶都有表达，叶的表达量显著高于茎。DoSQE1基因从8月份到12月份表达量逐渐降低。DoSQE2基因表达量从8月份到12月份是先升高后降低。DoSQE1和DoSQE2基因表达模式不同，推测两者在铁皮石斛营养生长过程的催化活性存在差异。
本研究克隆了铁皮石斛DoSQE1和DoSQE2基因，分析了营养生长期的表达模式，为进一步研究其在铁皮石斛甾醇类化合物生物合成中的功能奠定基础。
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图 1 引物及探针所在S基因保守区域
Figure 1. Conserved region of S gene in which primers and probes are located
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图 2 PEDV S 基因PCR扩增
M：DL2000 Marker；1～4：PEDV S 基因扩增；5：阴性对照。
Figure 2. PCR amplification of PEDV S gene
M: DL2000 marker; 1–4: PEDV S gene amplification; 5: negative control.
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图 3 荧光型RT-RAA引物筛选
1：F3/R3；2：F3/R2；3：F1/R1；4：F2/R3；5：F3/R1；6：F1/R2；7：F2/R2；8：F1/R3；9：F2/R1；10：阴性对照。
Figure 3. Screening primers for fluorescence RT-RAA
1: F3/R3; 2: F3/R2; 3: F1/R1; 4: F2/R3; 5: F3/R1; 6: F1/R2; 7: F2/R2; 8: F1/R3; 9: F2/R1; 10: negative control.
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图 4 荧光型RT-RAA反应温度的筛选
1～3分别为42、39和37 ℃。
Figure 4. Selection of reaction temperature for fluorescent RT-RAA
1–3: 42, 39, and 37 °C, respectively.
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图 5 荧光型RT-RAA反应时间的筛选
1～3分别为反应20、25、17 min。
Figure 5. Selection of reaction time for fluorescent RT-RAA
1–3: 20, 25, and 17 min reaction time.
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图 6 荧光型RT-RAA特异性试验
1：PEDV-S；2～8：TGEV、CSFV、PRV、PCV、PRRSV、PoRV、阴性对照。
Figure 6. Specificity of fluorescent RT-RAA
1: PEDV-S; 2–8: TGEV, CSFV, PRV, PCV, PRRSV, PoRV, and negative control, respectively.
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图 7 荧光型RT-RAA的重复性检测
1～3：1×105拷贝·μL−1；4～6：1×103拷贝·μL−1；7～9：1×102拷贝·μL−1。
Figure 7. Repeatability of fluorescent RT-RAA
1–3: 1×105 copies·μL−1; 4–6: 1×103 copies·μL−1; 7–9: 1×102 copies·μL−1.
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图 8 荧光型RT-RAA敏感性试验
1～7：标准质粒依次为106～100 拷贝·μL−1；8：阴性对照。
Figure 8. Sensitivity of fluorescence RT-RAA
1–7: standard plasmid at 106–100 copies·μL−1; 8: negative control.
表 1 疑似猪流行性腹泻病料收集的来源信息
Table 1 Information source and collection of suspected porcine epidemic diarrhea specimens
地区
Region样本数（份）/来源猪场（个）
Samples/Farms宁德 Ningde 5/2 三明 Sanming 6/2 龙岩 Longyan 10/6 漳州 Zhangzhou 8/3 莆田 Putian 11/6 合计 Total 40/19 
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表 2 引物和探针
Table 2 Primers and probes
名称
Name序列（5′-3′）
SequencePEDV S-DF AAATCTGGCAGTATTGGCTAC PEDV S-DR ATCGGCTGAAAGAATGTCC PEDV S-F1 TATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTAG PEDV S-F2 GTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATTA PEDV S-F3 AGTATTCCCACCAACTTTAGTATGAGTATT PEDV S-R1 TAATGCTGACTCTATGGTCTTACATGCTGC PEDV S-R2 GTTGTAATGCTGACTCTATGGTCTTACATG PEDV S-R3 TGTAATGCTGACTCTATGGTCTTACATGCT PEDV S-P GACAGAATATTTACAGCTTTACAACACGCC(i6FAMdT)(THF)(iBHQ1dT)TAGTGTTGATTGTGC-C3spacer
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表 3 临床样本的检测
Table 3 Detection on clinical samples
方法
Method阳性样品
Number of
positives/份阴性样品
Number of
negatives/份总数
Total/份阳性率
Positivity
rate/%RT-RAA 3 37 40 7.5 RT-qPCR 3 37 40 7.5
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