猪流行性腹泻(Porcine Epidemic Diarrhea，PED)是一种由冠状病毒引起的高度接触性肠道传染病，年幼仔猪发病率高，可表现呕吐、腹泻和死亡，剖检可见胃肠道内有未消化乳汁，肠壁变薄近乎透明，死亡率可达100%^[1]。亚洲地区PED首次暴发于韩国，并迅速传到其他国家，在多个国家流行。猪流行性腹泻病毒(Porcine Epidemic Diarrhea Virus，PEDV)于2013年首次在美国猪群中分离并鉴定出^[2-3]。目前，PED已成为世界性养猪病害之一。

PEDV核酸是单股正链具有感染性的RNA，有6个ORF，其编码的纤突蛋白(S)、小膜蛋白(E)、膜糖蛋白(M)和核衣壳蛋白(N)为PEDV主要结构蛋白。福建PEDV流行毒株的S和ORF3变异程度较大，N基因存在个别氨基酸变异，E基因有高度保守性，M基因除个别基因突变外也相对保守^[4-5]。

引起猪只出现腹泻症状的病因是多方面的，需要实验室诊断来进行确诊。常见的PEDV检测方法主要是RT-PCR法、ELISA法、胶体金法和免疫电镜法。RT-PCR法和免疫电镜法需要特殊仪器设备和熟练的操作人员仅限实验室诊断，而操作便捷的ELISA和胶体金法则常用于临床检测。由于缺少特异性好的检测试剂，研制快速诊断PEDV的试剂成为研究重点。本研究在可识别M蛋白的抗PEDV单克隆抗体制备的基础上，采用纯化的全抗原制备兔抗PEDV多克隆抗体，通过优化反应条件建立检测PEDV的双抗体夹心ELISA，以期为PEDV临床样品的快速诊断提供更好的检测手段。

1.   材料和方法

1.1   病毒与细胞株

猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGV)、猪轮状病毒和PEDV MAb杂交瘤细胞株E1由福建省农业科学院畜牧兽医研究所畜病室保存。

1.2   主要试剂和仪器

HRP标记的羊抗兔HRP-IgG、TMB和终止液购自博士德生物公司，牛血清白蛋白(BSA)购自Sigma公司。

Nanodrop 2000/2000C分光光度计购自Thermo公司。

1.3   病毒纯化

取生长状况良好的vero单层细胞，用PBS缓冲液洗1次，加入1：100稀释的PEDV细胞培养物1 mL和终浓度为6 mg·mL^-1胰酶，37℃吸附1 h后，加入终浓度6 mg·mL^-1胰酶无血清的DMEM培养液，观察细胞病变(CPE)达80%以上收获病毒，10 000 r·min^-1离心1 h，取上清液，50 000 r·min^-1离心3 h，采用蔗糖密度梯度离心法收获病毒^[6]，分装后-70℃保存。

1.4   PEDV的MAb的制备

按常规方法复苏PEDV MAb杂交瘤细胞株E1并制备小鼠腹水，采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化腹水^[7]，并用建立的间接ELISA检测抗体效价，用Nanodrop 2000/2000C分光光度计测蛋白浓度。

1.5   兔抗PEDV多克隆抗体的制备和纯化

将纯化的PEDV病毒液稀释至1 mg·mL^-1，与等量弗氏完全佐剂乳化后背部多点注射清洁级大白兔，每只注射1 mL，2周后将病毒液与等量弗氏不完全佐剂乳化后加强免疫2次，每次间隔2周。最后1次免疫后第15 d采血并分离血清，采用辛酸-饱和硫酸铵法纯化后检测多抗效价，用Nanodrop 2000/2000C分光光度计测蛋白浓度。

1.6   PEDV双抗体夹心ELISA检测方法的建立

1.6.1   双抗体夹心ELISA基本操作步骤

采用纯化的腹水包被酶标板，37℃包被；PBST洗涤3次，每次5 min；加入含5%BSA的PBST封闭液，4℃封闭过夜；PBST洗涤3次，每次5 min；加入待检样品，37℃反应1 h；PBST洗涤3次，每次5 min；加入纯化的抗PEDV多克隆抗体37℃孵育1 h；PBST洗涤3次，每次5 min；加入稀释后的羊抗兔IgG-HRP二抗孵育一定时间后，加入终止液，读取数值。以OD_450nm值接近1，S/N值＞2，作为阳性判定依据。

1.6.2   捕获抗体和检测抗体稀释倍数的确定

采用方阵滴定法，将纯化的腹水以1：100、1：200、1：400、1：800、1：1600、1：3200、1：6400和1：12800进行稀释，每孔加入100 μL，设置2个复孔，37℃包被2 h，检测纯化的PEDV病毒液；同样将抗PEDV多克隆抗体以1：100倍比稀释后加入酶标板进行检测，根据OD_450nm值和S/N值选择最佳捕获抗体和检测抗体稀释倍数。

1.6.3   捕获抗体包被条件的确定

用0.05 mol·L^-1碳酸盐稀释纯化腹水，包被条件37℃包被2 h、4℃包被12 h和37℃ 2 h加4℃ 12 h。其他条件相同进行ELISA试验，根据OD_450nm值和S/N值确定最佳包被条件。

1.6.4   封闭液浓度和封闭时间的确定

采用2%BSA、3%BSA和5%BSA封闭液进行37℃封闭1 h，其他条件相同进行ELISA试验。确定最佳封闭液浓度后封闭时间以37℃封闭1 h、4℃封闭12 h和37℃ 1 h加4℃12 h进行封闭，观察封闭效果，根据OD_450nm值和S/N值确定最佳封闭液浓度和封闭时间。

1.6.5   抗原作用时间的确定

确定捕获抗体和检测抗体稀释倍数，经适合的封闭液封闭后，加入纯化的病毒液，以不加入抗原为阴性对照，37℃反应60、90 min，根据OD_450nm值确定最佳抗原作用时间。

1.6.6   酶标二抗浓度和作用时间的确定

确定捕获抗体和检测抗体稀释倍数，酶标二抗以1：1000、1：2000、1：3000、1：4000和1：5000稀释进行试验，确定最佳酶标二抗浓度后作用时间以30、60、90 min孵育，根据OD_450nm值确定最佳作用时间。

1.7   ELISA结果判定的标准

采用建立的ELISA方法检测经RT-PCR鉴定为阴性的样品20份，计算OD_450nm平均值(X)和标准差(SD)。以样品的OD_450nm值X+3SD为阳性临界值。

1.8   ELISA特异性试验

采用建立的ELISA方法对PEDV、TGV和轮状病毒进行检测，每个样品2个复孔，确定该方法特异性。

1.9   ELISA敏感性试验

PBS稀释纯化PEDV从1：10开始二倍稀释至1：2560，每个稀释度2个复孔，采用建立的ELISA方法进行检测，确定该方法敏感度。

1.10   ELISA重复性试验

在同一酶标板内检测5份阳性样品，每个样品3个重复，计算批内变异系数。不同批次酶标板对同一样品进行检测，每个样品3个重复，计算批间变异系数。

1.11   临床样品检测

取自临床发生腹泻，出现死亡的仔猪的小肠及内容物，研磨后1：10加入生理盐水制成匀浆，-20℃反复冻融3次，4℃、4000 r·min^-1离心20 min，收集上清液用建立的ELISA方法与RT-PCR方法同时检测，评价该方法的特异性、敏感性和符合率。

2.   结果与分析

2.1   病毒纯化

将细胞培养的PEDV经过蔗糖密度梯度离心纯化后，用Nanodrop 2000/2000C分光光度计测其纯化病毒的蛋白质量浓度为4.8 mg·mL^-1。

2.2   PEDV MAb和多抗的纯化和效价测定

用Nanodrop 2000/2000C分光光度计测其纯化后MAb和多抗的蛋白质量浓度分别为3.52、3.55 mg·mL^-1。间接ELISA方法测定纯化后MAb和多抗效价均为10⁴。

2.3   PEDV双抗体夹心ELISA方法的建立和反应条件优化

在建立PEDV双抗体夹心ELISA检测方法时对捕获抗体最佳包被浓度和时间、封闭液浓度选择和封闭时间、抗原最佳作用时间、兔抗最佳工作浓度和工作时间和酶标二抗稀释度和作用时间进行反应条件优化。结果显示，PEDV双抗体夹心ELISA的最佳反应条件为：抗PEDV单克隆抗体作为捕获抗体，包被质量浓度为1：800(4.40 μg·mL^-1)，37℃包被2 h，采用5%BSA封闭液，37℃封闭1 h；抗原最佳作用时间37℃，90 min；兔抗PEDV抗体作为检测抗体，工作质量浓度为1：600(5.91 μg·mL^-1)，37℃作用1 h，酶标二抗稀释度为1：2000，37℃作用1 h。

2.4   ELISA结果判定的标准

采用建立的ELISA方法检测经RT-PCR鉴定为阴性的样品20份，计算OD_450nm平均值为0.216，标准差0.055。根据公式X+3SD计算，即样品OD_450nm值≥0.381判断为阳性。

2.5   ELISA特异性

采用建立的ELISA方法同时对PEDV、TGV和轮状病毒进行检测，每个样品3次重复检测，结果显示只有PEDV的OD_450nm值＞0.381，TGV和轮状病毒检测为阴性，表明该方法特异性好(图 1)。

图  1  双抗体夹心ELISA特异性试验

Figure  1.  Specificity of DAS-ELISA

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2.6   ELISA敏感性

PBS稀释纯化PEDV从1：10开始二倍稀释至1：2560，每个稀释度2个复孔，采用建立的ELISA方法进行检测，以抗原的稀释浓度为横坐标，OD值为纵坐标，绘制标准曲线，其线性回归方程为y=4.859x+0.272，线性回归常数R²=0.9974，检测范围为30~480 μg·mL^-1。该方法最低可检测30 μg·mL^-1(5×10^3.12)的病毒(图 2)。

图  2  双抗体夹心ELISA敏感性试验

Figure  2.  Sensitivity of DAS-ELISA

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2.7   ELISA重复性

对5份不同PEDV阳性样品进行批内重复和批间重复试验，结果(表 1)显示批内和批间的变异系数均小于10%，表明建立的PEDV双抗体夹心法有较好的重复性。

表  1  批内和批间重复试验结果(n=5)

Table  1.  Intra-and inter-batch reproducibility test results on DAS-ELISA

样品	批内重复试验				批间重复试验
	平均数	方差	变异系数 /%		平均数	方差	变异系数 /%
1	1.050	0.021	2.003		0.778	0.023	2.998
2	0.655	0.020	3.128		0.897	0.036	4.056
3	0.774	0.031	4.007		0.920	0.033	3.588
4	0.589	0.018	3.122		0.691	0.020	2.975
5	1.255	0.058	4.589		1.320	0.049	3.745

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2.8   临床样品检测

采用建立PEDV双抗体夹心ELISA和RT-PCR同时检测42份临床样品，检测结果显示用建立的ELISA检测出阳性样品12份，阴性样品30份；用RT-PCR检测出阳性样品13份，阴性样品29份，RT-PCR检测为阴性样本，该方法也检测为阴性。阴性样品符合率为100%，阳性样品符合率为92.30%。表明该方法具有很好的特异性和敏感性，可用于临床对PEDV的检测。

3.   讨论与结论

猪流行性腹泻病全球范围内流行，严重危害养猪业的发展^[8]。即使是健康猪群也可能存在PEDV的潜在感染^[9]。由于临床缺少相应的检测设备和快速诊断手段，基层兽医人员无法较快地对临床症状相似的腹泻性疾病进行准确鉴别诊断，容易出现误诊延误病情，因此快速检测临床PEDV已成为生产中亟待解决的问题。

双抗体夹心ELISA法常用于临床抗原的检测，且受检样品无须稀释可直接进行检测，其灵敏度相对高于间接ELISA，该方法检测特异性的关键在于捕获抗体和检测抗体的选择^[10-11]。已制备的PEDV MAb E1可识别PEDV M蛋白，只识别单一抗原决定簇，与抗原结合特异性强，包被96孔板用于捕获抗原保证检测特异性，兔抗PEDV抗体可结合多个抗原决定簇，亲和性高，可提高检测灵敏度。因此选用单抗作为捕获抗体，多抗作为检测抗体建立PEDV双抗体夹心ELISA方法^[12]。

李一经等^[13]利用纯化的病毒免疫小鼠制备单抗，建立猪排泄物中PEDV检测方法，检测临床样品阳性样品符合率90.5%。张清真等^[14]采用商品化的单克隆抗体作为捕获抗体，生物素标记的抗PEDV IgG作为检测抗体，建立检测PEDV的生物素-亲和素系统双抗体夹心ELISA方法，与RT-PCR符合率为100%。本试验通过方阵法确定最佳PEDV MAb包被浓度和抗PEDV兔抗工作浓度分别为1：800(4.40 μg·mL^-1)和1：600(5.91 μg·mL^-1)。PEDV MAb 37℃包被2 h；采用5%BSA封闭液封闭1 h后，加入抗原反应90 min；兔抗PEDV抗体的作用时间1 h；酶标二抗稀释度为1：2000，作用时间1 h；以OD_450nm≥0.381作为阳性判定标准，最低可检测30 μg·mL^-1(5×10^3.12)的病毒。用建立的方法检测PEDV结果为阳性，TGV和轮状病毒结果为阴性，表明该方法具有很好的特异性。此外，本研究采用建立的PEDV双抗体夹心ELISA方法与RT-PCR同时进行临床样品检测比较，二者符合率达到92.3%，表明该方法可用于PEDV临床样品的快速检测。综上所述，本试验建立的PEDV双抗体夹心ELISA方法具有很好的临床应用价值，为PEDV流行病学调查提供了有效的工具。