Full-length cDNA Library and EST Analysis on Pesudocohnilembus persalinus
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摘要: 水滴伪康纤虫为海水养殖鱼类的重要危害性寄生虫。采用SMART技术构建营养期水滴伪康纤虫全长cDNA文库，初始文库滴度3.3×106pfu·mL-1，文库容量约为1.5×107 pfu，重组率97%。随机挑取24个克隆，经PCR检测插入的片段长度在0.3~2.0 kb，平均长度>500 bp。挑选文库中的1 200个克隆进行表达序列标签测序，得到1 032条高质量的EST，与NCBI数据库进行比对后，获得292个同源基因，其中包含190条单拷贝EST和102个重叠群，冗余度为71.7%。有215条EST在Tetrahymena thermophila，Paramecium tetraurelia，Ichthyophthirius multifiliis，Cryptocaryon irritans，Oxytricha trifallax等自由生活及寄生种类的纤毛虫的基因组中比对到同源基因，其中有134条EST具有功能注释，其余为未知功能的假定蛋白基因。水滴伪康纤虫cDNA文库的构建及EST测序的完成，为进一步发现和研究水滴伪康纤虫的功能基因奠定了基础。Abstract: Pesudocohnilembus persalinus is a harmful parasite found in marine fish. Using SMART technology, a full-length cDNA library of P. persalinus was constructed. Titer of the primary library was 3.3×106 cfu·mL-1, and the library capacity was 1.5×107 cfu with a recombination rate of 97%. A PCR amplification on 24 random clones revealed that the inserted cDNA fragments ranged from 300-2 000 bp, with an average length over 500 bp. Subsequently, 1 200 clones were selected from the library for EST sequencing. As a result, 1 032 high-quality ESTs were obtained and assembled into 292 unigenes including 102 contigs and 190 unique ESTs with a redundancy rate of 71.7%. In a blast analysis against NCBI database, 215 of the unigenes were homologous to the corresponding genes of ciliates with free-living and parasitic lifestyle, such as Tetrahymena thermophila, Paramecium tetraurelia, Ichthyophthirius multifiliis, Cryptocaryon irritans, Oxytricha trifallax, etc. But, only 134 ESTs had been annotated. The remainders were hypothetical protein genes. The results obtained from this study would substantially facilitate the molecular cloning and characterization of the functional genes in P. persalinus.
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Keywords:
- Pesudocohnilembus persalinus /
- cDNA library /
- EST sequencing
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微重力影响生命活动的过程和机理，是人类为实现征服太空的目标所必须研究阐明的问题[1]。任何空间微重力试验都需要大量的地面模拟准备试验作为基础，Krikorian等[2]研究发现微重力和模拟微重力条件下胡萝卜细胞发育的不同阶段胚的生长比例相同，说明模拟微重力可以替代太空微重力研究植物生长的试验。地面模拟回转器因经济、易操控，可反复试验，可弥补空间微重力试验条件相对不足并且造价昂贵的缺憾[3-4]。诸多的真实以及模拟微重力对不同植物种类，不同植物部位影响的相关研究表明，微重力对生物的遗传、生长及生理特征等有影响[5]，如模拟微重力环境对人参、甜菊、燕麦、向日葵、萝卜等植物生长发育影响的相关报道[6-10]。目前，尚未有模拟微重力对食用菌生长与营养品质影响的相关报道。为此，本研究利用三维回转器模拟微重力环境，探讨微重力作用对金针菇氨基酸营养成分的影响，为揭示微重力对食用菌生长发育机理及开展空间园艺与育种提供科学借鉴。
1. 材料与方法
1.1 供试菌种
试验于2015年开展研究，金针菇品种由福建省农业科学院土壤肥料研究所提供。
1.2 回转装置
三维回转装置为福建省农业科学院生态农业研究所在国家“863”计划支持下自主研发的适合植物湿润栽培的旋转式植物栽培装置(中国发明专利：ZL200710009491.6)。装置设置两套独立旋转机构，三维旋转栽培盘在绕着自转心轴旋转的同时，又绕着公转心轴旋转。机架内部设置受控密闭舱，三维旋转栽培盘置于舱内，舱内气体组分、调速电机转速、人工光源光照强度和光周期等技术参数也可根据试验要求进行调控，采用触摸屏作为人机交互界面[11-12]。
1.3 试验方法与设计
1.3.1 栽培设计
试验设2个处理，分别为模拟微重力金针菇处理(X3) 与静止栽培金针菇处理(X0)。
金针菇培养料配方：棉籽壳77%，石膏1%，白糖1%，石灰2%，玉米粉19%，pH自然。培养料料水比1：1.8，拌匀后装入塑料袋，每袋装干料230 g，套上封口环，环内塞棉花，高压灭菌。待培养料温度冷却至26℃左右接种，每处理3个重复，每个重复10袋。接种后的菌袋置于回转装置上避光培养，培养温度22~23℃，空气相对湿度70%~75%。出菇时环境温度控制在18~21℃，空气相对湿度控制在90%~93%。三维回转装置频率1/60。
1.3.2 氨基酸组成测定
采收子实体菌盖呈钟型，尚未开伞时的金针菇。烘干箱中75℃烘干，粉碎机中磨粉150目过筛，用密封袋包装后在干燥环境中保藏备用。
将烘干样品置于6 mol·L-1盐酸溶液中，于110℃水解24 h，用氨基酸自动分析仪(日立8801型)测定氨基酸含量[13]。
1.4 数据统计与分析
氨基酸评分(Amino Acid Score，AAS)、生物价(Biologica1 Value，BV)、必需氨基酸指数(Essential Amino Acid Index，EAAI)和营养指数(Nutritional Index，NI)采用Bano的方法[14]；化学评分(chemical score，CS)采用FAO确定的方法[15]；氨基酸比值系数(RCAA)与氨基酸比值系数分(SRCAA)按朱圣陶的方法测定[16]。
2. 结果与分析
2.1 模拟微重力和静止栽培的金针菇氨基酸含量
X3与X0处理的金针菇子实体中所含17种氨基酸种类完全相同，模拟微重力栽培金针菇子实体中有15种氨基酸含量高于静止栽培处理，氨基酸总量达151.2 g·kg-1，比静止栽培处理提高了26.3%。模拟微重力处理的金针菇必需氨基酸总量81.7 g·kg-1，比静止栽培处理提高了29.89%，其必需氨基酸总量与氨基酸总量的比值为54.03%，超过食物类的必需氨基酸与氨基酸总含量的比值应接近40%的标准[17]。天冬氨酸和谷氨酸是鲜味氨基酸，模拟微重力处理的鲜味氨基酸含量达34.7 g·kg-1，比静止栽培处理的提高了37.15%。说明模拟微重力效应不仅可以提高金针菇的各种类氨基酸的含量，尤其对提高必需氨基酸和鲜味氨基酸含量有显著的增效效应(表 1)。
表 1 模拟微重力与静止栽培的金针菇子实体氨基酸含量比较Table 1. AA in fruiting bodies of F. velutipescultivated under simulated microgravity and conventional method[单位/(g·kg-1)] 氨基酸 X0 X3 增幅/% 天门冬氨酸Asp 9.9 15.5 56.6 苏氨酸Thr 8.9 10.2 14.6 丝氨酸Ser 5.7 7.6 33.3 谷氨酸Glu 15.4 19.2 24.7 甘氨酸Gly 5.4 6.6 22.2 丙氨酸Ala 7.2 8.5 18.1 半胱氨酸Cys 2.4 3.5 45.8 缬草氨酸Val 6.0 8.3 38.3 甲硫氨酸Met 9.6 10.3 7.3 异亮氨酸Ile 6.3 7.7 22.2 亮氨酸Leu 7.9 11.7 48.1 酪氨酸Tyr 4.2 5.5 31.0 苯丙氨酸Phe 5.6 8.3 48.2 赖氨酸Lys 12.0 16.2 35.0 组氨酸His 2.7 2.8 3.7 精氨酸Arg 5.8 4.7 -19.0 脯氨酸Pro 4.7 4.6 -2.1 氨基酸总量 119.7 151.2 26.30 必需氨基酸总量 62.9 81.7 29.89 鲜味氨基酸总量 25.3 34.7 37.15 2.2 模拟微重力和静止栽培的金针菇必需氨基酸组成及含量
必需氨基酸含量(Essential Amino Acids，EAA)指必需氨基酸含量分别占总氨基酸含量的比例[18]。模拟微重力环境栽培的金针菇必需氨基酸含量比静止栽培处理、鸡蛋白、FAO/WHO的参照标准分别提高了2.82%、8.71%和52.63%(表 2)。此外，模拟微重力处理的缬草氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸+酪氨酸和赖氨酸含量比静止栽培处理的子实体提高l1.34%、17.27%、11.48%和6.78%，而苏氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、异亮氨酸则低了14.67%、9.86%和3.34%。参照世界粮农和卫生组织标准和鸡蛋白的氨基酸营养模式，从表 2还发现，模拟微重力和静止栽培的金针菇蛋白质必需氨基酸的含量均高于世界粮农和卫生组织规定的标准和鸡蛋白的含量。
表 2 模拟微重力和静止栽培的金针菇子实体必需氨基酸组成及含量Table 2. Compositions and contents of essential AA in fruiting bodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 苏氨酸
Thr蛋氨酸+胱氨酸
Met+Cys缬草氨酸
Val异亮氨酸
Ile亮氨酸
Leu苯丙氨酸+酪氨酸Phe+Tyr 赖氨酸
Lys总量 X0 7.44 10.03 5.01 5.26 6.60 8.19 10.03 52.55 X3 6.75 9.13 5.49 5.09 7.74 9.13 10.71 54.03 鸡蛋白 5.1 5.5 7.3 6.6 8.8 10.0 6.4 49.7 FAO/WHO 4.0 3.5 5.0 4.4 7.0 6.0 5.5 35.4 2.3 模拟微重力和静止栽培的金针菇蛋白质化学评分
模拟微重力栽培金针菇子实体的化学评分比静止栽培处理高6.63%，t测验的差异达到显著水平。缬草氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸和赖氨酸评分值比静止栽培处理提高6.63%、14.10%、8.40%和3.91%，而苏氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、异亮氨酸则低了13.31%、12.98%和6.20%(表 3)。
表 3 模拟微重力和静止栽培的金针菇的蛋白质化学评分Table 3. CS of proteins in fruiting bodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 苏氨酸
Thr蛋氨酸+胱氨酸
Met+Cys缬草氨酸
Val异亮氨酸
Ile亮氨酸
Leu苯丙氨酸+酪氨酸Phe+Tyr 赖氨酸
Lys化学评价 X0 137.9 172.4 64.9 75.4 70.9 77.4 148.2 64.9 X3 121.7 152.6 69.2 71.0 80.9 83.9 154.0 69.2 2.4 模拟微重力和静止栽培的金针菇氨基酸评分
模拟微重力栽培金针菇子实体的氨基酸评分比静止栽培处理高16.43%，t测验的差异达到显著水平。缬草氨酸、亮氨酸和苯丙氨酸+酪氨酸和赖氨酸评分比静止栽培高9.47%、17.18%、11.43%和6.86%，而苏氨酸、蛋氨酸+胱氨酸、异亮氨酸则低了10.20%、9.82%和3.37%。
2.5 模拟微重力和静止栽培的金针菇必需氨基酸指数、生物价和营养指数
模拟微重力栽培金针菇子实体的必需氨基酸指数、生物价、营养指数均高于静止栽培处理的相对应值，其依次比静止栽培处理高2.92%、3.21%和29.37%，这表明模拟微重力栽培金针菇子实体的各类氨基酸组分不仅含量高于静止栽培处理，相应的氨基酸组成比例较为合理。
表 4 模拟微重力和静止栽培金针菇的氨基酸评分Table 4. AAS of proteins in fruiting bodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 苏氨酸
Thr蛋氨酸+胱氨酸
Met+Cys缬草氨酸
Val异亮氨酸
Ile亮氨酸
Leu苯丙氨酸+酪氨酸Phe+Tyr 赖氨酸
Lys氨基酸评分 X0 185.9 286.4 100.3 119.6 94.3 136.5 182.3 94.3 X3 168.7 260.8 109.8 115.7 110.5 152.1 194.8 109.8 表 5 模拟微重力和静止栽培金针菇的必需氨基酸指数、生物价和营养指数Table 5. EAAI, BVand NI of proteins in fruitingbodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 必需氨基酸指数 生物价 营养指数 X0 104.92 102.7 12.6 X3 107.98 106.0 16.3 2.6 模拟微重力和静止栽培对金针菇氨基酸比值和比值系数分
根据WHO/FAO的必需氨基酸评分模式，RC值＞1表明该氨基酸相对过剩，RC值＜1则表明不足，RC最低者为第一限制性氨基酸。如果必需氨基酸组成含量组成与EAA模式一致，则SRC=100，与EAA模式越接近，则SRC越接近100，其营养价值越高[18]。模拟微重力栽培金针菇子实体的氨基酸比值系数分(SRCAA)高于静止栽培处理，其相应值比静止栽培处理高0.66%。根据必需氨基酸模式，静止栽培的金针菇必需氨基酸——亮氨酸的氨基酸比值系数为0.9，小于WHO/FAO模式的必需氨基酸的RC值1，说明静止栽培的金针菇的第一限制氨基酸是亮氨酸。但是模拟微重力栽培的金针菇中亮氨酸的氨基酸比值系数为1.2，高于WHO/FAO模式的RC值，而且其他必需氨基酸的氨基酸比值系数均高于1，表明模拟微重力栽培金针菇的蛋白质是优质蛋白质。
表 6 模拟微重力和静止栽培金针菇的氨基酸比值系数分Table 6. AARC of proteins in fruiting bodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 苏氨酸
Thr蛋氨酸+胱氨酸
Met+Cys缬草氨酸
Val异亮氨酸
Ile亮氨酸
Leu苯丙氨酸+酪氨酸Phe+Tyr 赖氨酸
Lys氨基酸比值系数分 X0 1.86 2.86 1.00 1.20 0.94 1.36 1.82 72.68 X3 1.69 2.61 1.10 1.16 1.11 1.52 1.95 73.16 2.7 模拟微重力和静止栽培的金针菇蛋白质营养价值影响的综合评价
从表 7看出，模拟微重力栽培金针菇的化学评分、氨基酸评分、氨基酸比值系数分、必需氨基酸指数、营养指数及生物价6项蛋白质指标均高于静止栽培的金针菇，说明模拟微重力有利于金针菇子实体的氨基酸合成与积累，不仅氨基酸总量高，而且各种氨基酸组成比例更为合理。根据通用的蛋白质营养价值评判标准，模拟微重力栽培金针菇子实体中蛋白质综合营养价值优于静止栽培处理。
表 7 模拟微重力和静止栽培金针菇的蛋白质营养综合评价Table 7. Over-allnutritional qualities of proteins in fruiting bodies of F. velutipes cultivated under simulated microgravity and conventional method处理 化学评分 氨基酸评分 氨基酸比值系数分 必需氨基酸指数 营养指数 生物价 X0 64.9 94.3 72.68 104.92 12.6 102.7 X3 69.2 109.8 73.16 107.98 16.3 106.0 3. 讨论与结论
诸多研究发现，微重力对作物的生长、发育和繁殖产生一定的影响，而且多是以不利影响为主。Giuseppe等[19]研究空间实验微重力对芸芥发芽率、苗干鲜重、葡萄糖与果糖含量、蔗糖和淀粉含量有不利影响；徐国鑫等[20]发现模拟微重力抑制拟南芥种子贮藏蛋白的积累，导致种子贮藏蛋白总体含量降低。本研究模拟微重力栽培的金针菇子实体17种氨基酸中有15种氨基酸含量高于静止栽培处理，且氨基酸、必需氨基酸和鲜味氨基酸总量均高于静止处理，说明模拟微重力栽培有利于金针菇中蛋白质物质的代谢与积累，其结果与赵伟等[21]研究经回转器处理的人参细胞的人参皂苷含量提高10%左右相似。为此模拟微重力的相关试验要因作物而异，在今后的科学研究中需根据具体作物具体分析。
由于食物蛋白质中一种或几种必需氨基酸缺少或不足，就会使食物蛋白质合成为机体蛋白质的转变过程受限，进而限制了此种蛋白质的营养价值[22]。本研究的静止栽培金针菇中亮氨酸的氨基酸评分与必需氨基酸比值系数均最小，因此亮氨酸是限制氨基酸；而模拟微重力栽培的金针菇限制氨基酸是缬草氨酸，苯丙氨酸+酪氨酸的必需氨基酸比值系数RC值大于1。因此模拟微重力栽培可提升秀珍菇中氨基酸的含量，尤其是限制性氨基酸——苯丙氨酸+酪氨酸的含量，从而更为接近人体蛋白质各种氨基酸的构成比例，易于更完全被人体吸收转化。
模拟微重力栽培金针菇子实体中有15种氨基酸含量高于静止栽培处理，而且化学评分、氨基酸评分、氨基酸比值系数分、必需氨基酸指数、生物价与营养指数6项蛋白质指标均高于静止栽培的金针菇，说明模拟微重力栽培金针菇有利于其氨基酸的形成，不仅能提高蛋白质含量，而且促进了各种氨基酸构成比例的合理性，使之更为接近人体蛋白质各种氨基酸的构成比例，其作用机理有待于进一步的探索。微重力是否对维生素、脂肪酸、多糖、微量元素以及重金属的作用也有待于深入研究。
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图 1 水滴伪康纤虫总RNA(A)及双链cDNA(B)的凝胶电泳
注：M为DL2000 DNA marker; a为total RNA; b为ds cDNA。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of total RNA (A) and double strand cDNA (B) from P. persalinus
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图 2 24个随机克隆中插入片段扩增产物的凝胶电泳
注：M为DL2000 DNA marker; 1~24为positive clones。
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of inserted fragments in 24 random clones
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图 3 EST的长度分布(A)及单一序列的冗余度(B)
Figure 3. Distribution of lengths(A) and redundancy(B) of singlets of ESTs
表 1 部分EST序列的功能注释及与GenBank中同源比对
Table 1 Function annotation and homology of partial EST sequences compared with data from GenBank
编号 长度 功能注释 同源性/% E值 Pp-10-B02 1131 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 94 7.00E-152 Pp-109-D12 731 NADH脱氢酶亚基7 81 7.00E-174 Pp-A3-C01 1220 3-磷酸甘油醛脱氢酶 74 1.00E-168 Pp-A82-B11 1220 多聚泛素5 93 3.00E-136 Pp-E5-E01 1068 组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶 51 2.00E-87 Pp-B58-B08 1073 组织蛋白酶B 92 0 Pp-G91-C12 669 2型甲硫氨酸胺基肽酶 65 4.00E-77 Pp-I36-D05 1204 粪卟啉原Ⅲ氧化酶 56 2.00E-111 Pp61-E08 662 磷酸吡哆醛依赖转移酶 78 9.00E-61 Pp0382 1114 肌醇磷酸合成酶 67 9.00E-125 Pp-K73-A10 781 丙氨酰-tRNA合成酶 72 1.00E-119 Pp-A1-A01 1147 热休克蛋白90 69 1.00E-106 Pp-B10-B02 436 延长因子2 71 1.00E-31 Pp-D20-D03 472 核苷结合外膜蛋白 76 5.00E-49 Pp-D34-B05 1225 醌氧化还原酶 77 0 Pp-D4-D01 976 ATP合成酶γ亚基 51 5.00E-81 Pp-D53-E07 455 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶 69 1.00E-32 Pp-E56-H07 811 电压门控性钾通道β2亚基 77 5.00E-125 Pp-F5-E01 547 转录因子Dp-1 62 8.00E-23 
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