SSR Loci in Transcriptome of Moringa oleifera Lam
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摘要: 采用MISA对15 824条长度大于1 kb的辣木Unigene进行SSR位点分布频率和基本特征的分析，共检测到8 272个SSR位点，分布于6 003条Unigene，SSR位点出现频率为52.28%，共包含114种重复单元。辣木转录组的SSR以单核苷酸重复为主，占总SSR的55.69%。其次是二、三核苷酸重复，分别占总SSR的32.34%和11.24%。A/T、AG/CT和AAG/CTT是单核苷酸、二核苷酸和三核苷酸中的优势重复基元。辣木转录组SSR以10~20次重复为主，基序长度主要集中于12~19 bp。结果表明辣木转录组中含有大量SSR，且类型丰富，可为辣木SSR引物开发提供候选序列。Abstract: MISA software was employed to analyze the distribution and basic characteristics of SSR loci of 15 824 unigenes, which were longer than 1 kb, from the transcriptome of Moringa oleifera Lam leaves at different development stages. A total of 8 272 SSR loci consisting of 114 motifs were detected in 6 003 unigenes, i.e., a frequency of 52.28%. The most abundant repeating motif was a single nucleotide (55.69%), which was followed by dinucleotide (32.34%) and trinucleotide (11.24%); and, their SSRs were A/T, AG/CT and AAG/CTT, respectively. The most commonly found SSRs had 10-20 tandem repeats (30.35%) with their motif lengths ranging from 12 bp to 19 bp. It appeared that there were numerous SSRs in the transcriptomes with high distribution frequencies and many varieties. The results obtained from this study provided valuable information for developing SSR markers.
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Keywords:
- Moringa oleifera /
- transcriptome /
- SSR
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辣木Moringa oleifera Lam.原产印度，为辣木科辣木属植物，是一种具有较高经济价值的多用途树种，目前世界各地均有引种栽培[1-2]。辣木的叶片、花、嫩荚和种子等均可食用，且具有较高的食用价值[3-4]。辣木叶片富含蛋白质、矿物质、β-胡萝卜素和维生素等，是天然抗氧化剂的良好来源[5]。辣木种子富含不饱和脂肪酸，可作为优质食用油[6]。辣木还具有重要的药用价值，对高血压、糖尿病、失眠和贫血等均具有很好的治疗作用[5, 7]。此外，辣木还可作为优质蛋白质饲料[8]，具有广阔的发展前景。然而，生产上存在辣木种源谱系不清、实生苗个体差异大等问题[9]。因此，建立和完善辣木品种资源分类和鉴定体系，对辣木产业的发展具有重要的意义。
分子标记技术是有效的种质资源鉴定途径[10]。分子标记在辣木种质资源研究中的成功应用已有报道[9, 11-14]。SSR(Simple sequence repeats)标记集共显性、多态性高、重复性好、易操作和检测等诸多优点于一身[11]，广泛地用于植物遗传多样性分析、品种鉴定和亲缘关系研究等领域[15-18]。EST-SSR可直接反映植物功能基因的多样性，且通用性好[19]。本研究以辣木叶片RNA-Seq(RNA Sequencing)数据为基础，分析辣木转录组SSR位点信息，为SSR引物开发以及辣木种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 转录组数据
辣木转录组数据为本课题组于2016年采用Illumina高通量测序获得的辣木不同阶段叶片(展叶期后0、10、20、30 d)的转录组数据。测序时，分别提取不同阶段叶片的RNA并等量混合用于文库构建。委托北京百迈客生物科技有限公司采用Illumina HiSeq 4000进行测序，原始数据已提交至NCBI SRA数据库(编号SRR5765086)。测序数据经过滤后，采用Trinity进行序列组装。
1.2 辣木转录组SSR位点鉴别与分析
提取辣木叶转录组中序列长度大于1 kb的Unigene，并采用MISA(MIcroSAtellite identification tool)软件(http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)进行SSR(包括单碱基重复SSR、双碱基重复SSR、三碱基重复SSR、四碱基重复SSR、五碱基重复SSR、六碱基重复SSR和混合SSR)位点的搜索。SSR位点搜索条件为单核苷酸重复不低于10次，二核苷酸重复不低于6次，三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复不低于5次，2个SSR位点间的距离不超过100 bp即认定为复合SSR。
2. 结果与分析
2.1 辣木转录组中SSR的分布及结构特点
辣木叶片转录组共组装得到75 452条Unigene，其中有15 824条Unigene的长度大于1 kb，大于1 kb的Unigene序列总长度约为36 676 kb。采用MISA软件对这些序列进行SSR搜索，结果表明含有SSR位点的Unigene共有6 003条，其中1 695条Unigene(28.24%)含有2个或2个以上的SSR位点，432条Unigene含有复合型SSR。共检测到8 272个SSR位点，SSR发生频率为52.28%(检出的SSR位点总数8 272/大于1 kb的Unigene数15 824)，平均每4.43 kb含有1个SSR位点，其中复合SSR有449个(7.22%)。如表 1所示，有单核苷酸至六核苷酸6种重复类型的SSR位点存在。其中单核苷酸重复出现频率最高，占总SSR位点的55.69%，其次为二核苷酸和三核苷酸重复，分别占总SSR的32.34%和11.24%；四、五和六核苷酸重复出现频率均较低，分别为总SSR的0.54%、0.06%和0.12%。
表 1 辣木转录组SSR不同基序长度和重复次数的数量分布Table 1. Distribution of SSRs with different motif types and repeating numbers in transcriptome of M. oleifera基序长度/bp 重复次数 总计 比例/% 5 6 7 8 9 10~20 >20 1 0 0 0 0 0 4522 85 4607 55.69 2 0 769 501 452 429 524 0 2675 32.34 3 579 217 108 21 3 2 0 930 11.24 4 37 6 2 0 0 0 0 45 0.54 5 4 1 0 0 0 0 0 5 0.06 6 1 5 3 0 0 1 0 10 0.12 总计 621 998 614 473 432 5049 85 8272 比例/% 7.51 12.06 7.42 5.72 5.22 61.04 1.03 辣木转录组SSR重复单元的重复次数分布在5~24次，其中10~20次重复的SSR最多，共有5 049个，占总数的61.04%。；5~9次重复的SSR共有3 138个，占总数的37.94%。20次重复以上的SSR仅85个，占总数的1.03%。辣木转录组SSR的长度从10~279 bp不等，其中12~19 bp的SSR最多，占总数的59.58%(4 637个)，其次为小于12 bp的SSR(1 940个，占24.93%)和大于19 bp的SSR有(1 208个，占15.53%)。大于100 bp的SSR共有89个。
2.2 辣木转录组SSR基序重复类型和频率特征
从核苷酸基序类型来看，辣木转录组中的8 272个SSR位点共包含114种重复单元，一、二、三、四、五、六核苷酸重复各有4、12、54、29、5、10种。从分布频率(表 2)来看，出现最多的基元是A/T(4 452个，53.82%)，其次是AG/CT(2214个，26.76%)。在单核苷酸重复基元中，以A/T为主，占单核苷酸重复总数的96.64%。在二核苷酸重复基元中，以AG/CT为主，占二核苷酸重复总数的82.77%，其次分别为AT/AT和AC/GT，分别占二核苷酸重复总数的11.44%和5.61%。在三核苷酸重复基元中，以AAG/CTT为主，占三核苷酸重复总数的32.04%，其次为AGC/CTG、ATC/ATG、AGG/CCT、AAT/ATT和ACC/GGT，分别占三核苷酸重复总数的5.16%、4.93%、3.51%、3.48%和3.48%。在四核苷酸重复基元中，以AAAG/CTTT出现频率最高，占四核苷酸重复总数的20.43%，其次为AAAT/ATTT和AAAC/GTTT，分别占四核苷酸重复总数的18.28%和10.75%。各类五和六核苷酸重复出现频率均较低。
表 2 辣木转录组SSR基序类型分布Table 2. Distribution of SSR types in transcriptome of M. oleiferaSSR基序 数量 A/T 4452 C/G 155 AG/CT 2214 AT/AT 306 AC/GT 150 CG/CG 5 AAG/CTT 298 ATC/ATG 132 AGC/CTG 138 AGG/CCT 94 AAT/ATT 93 ACC/GGT 93 AAC/GTT 46 ACG/CGT 19 AAAAG/CTTTT 2 AAACC/GGTTT 1 AACAAG/CTTGTT 1 AAGCAG/CTGCTT 1 ACCATC/ATGGTG 1 ACCCTG/AGGGTC 1 ACTAGC/AGTGCT 1 ACT/AGT 3 CCG/CGG 14 AAAG/CTTT 13 AAAT/ATTT 17 AAGC/CTTG 1 AAGG/CCTT 2 AATT/AATT 1 ACAG/CTGT 1 ACAT/ATGT 3 AGCC/CTGG 1 AGCG/CGCT 1 AGGC/CCTG 1 AGGG/CCCT 3 ATCC/ATGG 1 AAAAC/GTTTT 1 AAATC/ATTTG 1 AACTGC/AGTTGC 1 ACCAGC/CTGGTG 1 ACCATG/ATGGTC 1 ACGATC/ATCGTG 1 AGCAGG/CCTGCT 1 3. 讨论与结论
本研究对来自辣木叶片的15 824条Unigene进行SSR位点分析，检测到SSR位点8 272个，出现频率为52.28%，略低于李54.51%[20]，显著高于连翘(25.15%)[30]、刺梨(20.37%)[21]、青稞(19.58%)[22]、野三七(16.86%)[33]、文冠果(12.93%)[23]、蜡梅(12.35%)[34]、红掌(12.17%)[35]、布渣叶(12.14%)[24]、白姜(9.39%)[25]、辣椒(7.84%)[26]、洋葱(5.57%)[27]、红松(3.74%)[23]和冷蒿(2.51%)[28]。本研究中SSR检出频率高达52.28%，表明辣木叶片转录组中含有丰富的SSR，可为SSR标记的开发提供丰富的候选位点。值得注意的是，本研究仅选择序列长度大于1 kb的Unigene进行分析，这可能是导致SSR检测频率较高的原因之一。方智振等[20]采用这种策略在李转录组中搜索到大量的SSR。王兴春等[29]在连翘转录组分析中也采用了相同的策略，但SSR出现频率显著低于本研究。刺梨、青稞、白姜、红松和冷蒿等植物的研究中均对所有Unigene进行分析，但SSR出现频率存在显著差异[21, 23, 25, 28]。此外，SSR位点识别参数也是影响结果的重要因素。本研究对单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸重复SSR进行分析，而文冠果[23]、布渣叶[24]、白姜[25]、冷蒿[28]和野三七[33]等仅对二核苷酸至六核苷酸SSR进行分析。然而，布渣叶[24]、白姜[25]和野三七[33]设置的参数一致，但结果也存在显著的差异。因此，植物转录组中SSR的发生频率受物种、转录组数据量和检索标准等因素的影响[20]。
在辣木叶片转录组中，单核苷酸重复(53.82%)为主要SSR类型，其次为二核苷酸重复(32.34%)和三核苷酸重复(11.24%)。这与李[20]、苦荞[30]和海甘蓝[31]等植物的结果类似，但不同于红掌[35]、荔枝[41]和党参[42]等以二核苷酸重复为主的植物。与党参[32]、马铃薯[33]、蜡梅[34]和李[20]等植物相似，辣木转录组中二核苷酸重复以AG/CT重复为主，AT/AT和AC/GT次之，出现频率极低的为CG/CG。但该结果不同于以AC/TG重复为主的洋葱[27]和冷蒿[28]等植物。董清华等[34]认为双子叶植物中主要三核苷酸重复为AAG/CTT的观点，在本研究得到了验证。在单子叶植物玉米、水稻和大麦中的三核苷酸重复分别为CCG/GGC、AGG/TCC和CCG/GGC[34]，与双子叶植物有明显的差异。可见，不同物种的主要SSR类型明显不同。
本研究分析了辣木转录组SSR的分布、结构特点、基序重复类型和频率特征，并与其他植物的研究结果进行了比较。结果表明辣木转录组中含有大量SSR，且类型多样，可为辣木SSR引物开发以及种质资源多样性、品种鉴定及亲缘关系研究等奠定良好的基础。
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表 1 辣木转录组SSR不同基序长度和重复次数的数量分布
Table 1 Distribution of SSRs with different motif types and repeating numbers in transcriptome of M. oleifera
基序长度/bp 重复次数 总计 比例/% 5 6 7 8 9 10~20 >20 1 0 0 0 0 0 4522 85 4607 55.69 2 0 769 501 452 429 524 0 2675 32.34 3 579 217 108 21 3 2 0 930 11.24 4 37 6 2 0 0 0 0 45 0.54 5 4 1 0 0 0 0 0 5 0.06 6 1 5 3 0 0 1 0 10 0.12 总计 621 998 614 473 432 5049 85 8272 比例/% 7.51 12.06 7.42 5.72 5.22 61.04 1.03 
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表 2 辣木转录组SSR基序类型分布
Table 2 Distribution of SSR types in transcriptome of M. oleifera
SSR基序 数量 A/T 4452 C/G 155 AG/CT 2214 AT/AT 306 AC/GT 150 CG/CG 5 AAG/CTT 298 ATC/ATG 132 AGC/CTG 138 AGG/CCT 94 AAT/ATT 93 ACC/GGT 93 AAC/GTT 46 ACG/CGT 19 AAAAG/CTTTT 2 AAACC/GGTTT 1 AACAAG/CTTGTT 1 AAGCAG/CTGCTT 1 ACCATC/ATGGTG 1 ACCCTG/AGGGTC 1 ACTAGC/AGTGCT 1 ACT/AGT 3 CCG/CGG 14 AAAG/CTTT 13 AAAT/ATTT 17 AAGC/CTTG 1 AAGG/CCTT 2 AATT/AATT 1 ACAG/CTGT 1 ACAT/ATGT 3 AGCC/CTGG 1 AGCG/CGCT 1 AGGC/CCTG 1 AGGG/CCCT 3 ATCC/ATGG 1 AAAAC/GTTTT 1 AAATC/ATTTG 1 AACTGC/AGTTGC 1 ACCAGC/CTGGTG 1 ACCATG/ATGGTC 1 ACGATC/ATCGTG 1 AGCAGG/CCTGCT 1
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