Molecular Cloning and Functional Analysis of UDP N-acetylglucosamine Pyrophosphorylases Gene in Frankliniella occidentalis
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摘要:目的 阐明几丁质合成通路中的关键基因UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP N-acetylglucosamine pyrophosphorylases, UAP)对西花蓟马Frankliniella occidentalis生长发育的影响。方法 基于西花蓟马转录组数据，克隆验证了UAP基因的开放阅读框(Open Reading Frame, ORF)全长序列，命名为FoccUAP。利用RT-qPCR方法分析FoccUAP在各个组织和不同龄期的表达情况。最后通过向西花蓟马蜕皮24 h的2龄若虫显微注射dsUAP，检测沉默效率，观察其对西花蓟马生长发育的影响。结果 FoccUAP基因开放阅读框全长1 545 bp，编码514个氨基酸，预测蛋白分子量为56.738 kDa，具有Glyco - tranf - GTA - type Super family家族的保守结构域，与等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆虫的UAP基因亲缘关系较近。FoccUAP基因在西花蓟马各个组织都有表达，在头部和腹部相对表达量最高，触角、胸部和足相对表达量较低。该基因在虫体生长发育的各个阶段均有表达，其中2龄幼虫、蛹以及羽化后24、48、168、240 h的成虫表达量分别是1龄幼虫的1.30、2.50、1.56、2.0、2.43和2.56倍。RNAi结果表明，注射dsUAP的西花蓟马羽化率（36.3%）和注射后120 h的存活率（5.0%）均显著低于dsGFP对照组，且注射dsUAP的西花蓟马成虫出现翅膀发育不完整、胸腹部皱缩不规则等畸形现象。结论 FoccUAP基因对西花蓟马生长发育具有重要的作用。
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关键词:
- 西花蓟马 /
- UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶 /
- 几丁质合成 /
- RNAi
Abstract:Objective Effects of UDP N-acetylglucosamine pyrophosphorylases (UAP) on the growth and development of Frankliniella occidentalis were studied.Method Based on a transcriptome dataset, an open reading frame (ORF) of UAP gene of F. occidentalis (FoccUAP) was cloned. Expressions of the FoccUAP in different body tissues and growth stages of the insect were detected by RT-qPCR. Effects of UAP gene on the growth and development were examined by microinjecting dsRAN in the 2nd instars (eclosion about 24 h) of F. occidentalis.Result The full-length of FoccUAP ORF was 1 545 bp and encoded 514 amino acids with a predicted molecular mass of 56.738 kDa. FoccUAP contained the conserved domain of glyco-tranf-GTA-type super family, which had a close evolutionary relationship with the orthologues in Isoptera, Blattaria, Orthoptera, and Hemiptera. The RT-qPCR results showed that FoccUAP was highly expressed in the head and abdomen, detected in the antenna, thorax and leg, and found in all developmental stages of the insect. The relative transcript levels of FoccUAP in the 2nd instar, pupa, adult-24 h, adult-48 h, adult-168 h, and adult-240 h were 1.30-, 2.50-, 1.56-, 2.0-, 2.43-, and 2.56-fold, respectively, of those in the 1st instar. Further examination on the RNAi showed that the injection of dsUAP into the 2nd instar F. occidentalis significantly decreased the eclosion rate (36.3%) and the survival rate (5.0% in 120 h after microinjection) as compared to dsGFP controls. Moreover, the dsUAP treatment also induced abnormal phenotypes on wings and abdomen–thorax of the thrips.Conclusion UAP played a significant role in the growth and development of F. occidentalis. -
0. 引言
【研究意义】西花蓟马Frankliniella occidentalis，属于缨翅目Thysanoptera，蓟马科Thripidae，是全球性的重要害虫之一，主要通过直接取食以及间接传播病毒病对250多种农作物、花卉、蔬菜和树木造成危害[1-2]。2003年6月在我国大陆首次发现该虫，2004年后在北京和云南等地造成严重危害，是一种危险性入侵生物[3-4]。目前，国内外主要采用化学药剂来防治蓟马，但由于人们长期大量使用化学农药，导致昆虫抗药性增强和化学农药对环境污染日益严重。几丁质是自然界中存在最普遍的氨基多糖，主要存在于真菌、线虫和节肢动物中。几丁质是昆虫表皮、体内组织基底膜和消化道围食膜的主要成分，对昆虫的形态构建及生命活动具有重要的作用[5]。由于几丁质在昆虫生长发育过程起着关键性的作用，同时人类和高等动物不具备几丁质代谢系统的特性 [6]，因此，开展几丁质合成途径相关基因研究具有重要的理论意义与潜在应用价值。【前人研究进展】昆虫发育必须经历周期性脱皮和合成新皮的过程，这一过程伴随着几丁质的合成和降解。昆虫几丁质的合成过程非常复杂，目前发现有8种酶共同参与其中：海藻糖酶(Trehalase)、己糖激酶(hexokinase)、葡萄糖-6-磷酸异构酶(glucose-6-phosphate isomerase)、谷氨酸盐：果糖-6-磷酸转氨酶(glutamine: fructose-6-phosphate Aminotransferase)、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰转移酶(glucosamine-6-phosphate-N-acetyltransferase)、磷酸乙酰氨基葡萄糖变位酶(phosphoacetylglucosamine mutase)、UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)和几丁质合成酶(chitin synthase)[7-10]。其中某一个过程受阻就会造成几丁质合成困难，导致昆虫因缺少几丁质而不能存活。UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase（UAP）作为几丁质合成途径上的关键酶之一，其功能在黑腹果蝇Drosophila melanogaster、埃及伊蚊Aedesaegypti、家蚕Bombyxmori、赤拟谷盗Triboliumcastaneum、甜菜夜蛾Spodopteraexigua等真核生物中得到了研究[11-14]。对真核生物和原核生物的UAP进行比较，发现UAP基因的氨基酸序列并不相似，但有一个相同L/MX2GX1GTX6PK氨基酸结构域[15-16]。通过对赤拟谷盗的TcUAP靶基因进行RNA干扰，发现赤拟谷盗由于几丁质合成量不足而导致死亡[17]。RNA干扰甜菜夜蛾5龄第一天的幼虫SeUAP基因，会导致部分甜菜夜蛾出现蛹期畸形及死亡。同样的结论也出现在对果蝇突变体的研究中，果蝇的DmUAP基因突变体存在许多缺陷，主要是角质层和气管形态的缺陷，导致缺陷的原因主要是几丁质含量的减少[18-19]。【本研究切入点】几丁质对昆虫生长发育具有极其重要的意义，基于昆虫几丁质代谢途径开发环境友好型的杀虫剂成为植物保护领域的研究热点[6]。然而，目前国内外关于蓟马UAP的功能研究尚未见报道。【拟解决的关键问题】在西花蓟马基因组与转录组数据的基础上，本研究对西花蓟马UAP基因进行克隆、鉴定，利用实时荧光定量PCR法研究该基因在西花蓟马生长发育过程中的表达模式，并利用RNAi技术，观察该基因对西花蓟马生长发育的影响，为进一步探讨西花蓟马UAP的生理功能提供科学参考。
1. 材料与方法
1.1 供试昆虫
西花蓟马由云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所提供，用四季豆饲养于人工气候箱（MGC-350HP-2，上海一恒科技有限公司）。饲养条件为温度（25±1）℃，相对湿度60%～70%，光照L∶D=14∶10 h。
1.2 西花蓟马UAP-ORF的克隆鉴定
在西花蓟马基因组和转录组数据的基础上，获得了FoccUAP基因开放阅读框序列，利用Primer 5.0软件设计全长引物（表1）。西花蓟马总RNA的提取采用Trizol（Invitrogen公司）法，总RNA用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转录成cDNA，以此作为PCR模板扩增FoccUAP开放阅读框。PCR体系为20 μL∶2 μL 10×Taq Buffer，2 μL dNTPs（2.5 mmol·L−1），1 μL cDNA 模板，上下游引物各0.5 μL（10 μmol·L−1），0.5 μL Taq酶，用 ddH2O补齐至20 μL。反应条件为：95℃预变性 2 min；95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，反应35个循环；最后72℃延伸10 min。取5 μL PCR产物，加1 μL 6 × loading buffer混合上样，用1% 琼脂糖凝胶电泳检测。片段纯化回收后用5 μL与pEASY®-T1 Cloning Kit载体（北京全式金生物科技有限公司）连接，转化后挑选阳性克隆子送福州铂尚生物技术有限公司测序。
表 1 引物信息Table 1. Primers used引物名称
Primer name序列
SequenceFoccUAP-ORF-F ATGGAGCACCAGTACGAAAACCTC FoccUAP-ORF-R TTAGTGAACACCATTTGATATCCCA dsFoccUAP-F TAATACGACTCACTATAGGGTACAAATGCTACCTGCACTGAAAGTAAGCT dsFoccUAP-R TAATACGACTCACTATAGGGTGGCAACATCATCCTGGATTCTCC qFoccUAP-F TCCGTTTACTGATAGTCTTGTTGTCTGGG qFoccUAP-R GCTGTGCGTGGGCAATCCTTTT qβ-actin-F CACCACCGCTGAGCGTGAAATCG qβ-actin-R GTGATGACCTGACCGTCGGGAAGC dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG 1.3 FoccUAP序列特性及系统进化树分析
使用DNA star软件将克隆获得的DNA序列翻译成蛋白质序列；使用NCBI Blastx进行氨基酸序列同源性比对，使用在线工具ExPASy (http: //web.Expasy.org /protparam)对蛋白质的分子量、等电点等进行预测，采用SignalP 5.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 进行信号肽的预测，使用Conserved domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/lexington/lexington.cgi?cmd=rps)预测FoccUAP的保守结构域等。
经过BLAST同源比对，从NCBI网站(https:www.Ncbi.Nlm.nih.gov)分别选取半翅目、双翅目、等翅目、鞘翅目等共28个物种的昆虫几丁质合成酶UAP序列，与本研究克隆的FoccUAP序列进行进化树分析。使用MEGA7软件Neighbor Joining方法构建系统进化树。
1.4 FoccUAP的时空表达
组织表达选取羽化24 h的成虫300头，在PBS缓冲液中解剖出触角、头、胸、腹、足；时间表达选取蜕皮24 h的1龄若虫、2龄若虫、蛹和羽化24 、48 、168、240 h的成虫各100只。Trizol法提取西花蓟马的总RNA，然后用EasyScript Reverse Transcriptase反转录试剂盒（北京全式金生物科技有限公司）反转录为cDNA。根据序列信息设计荧光定量特异性引物（表1），同时以西花蓟马的β-actin基因（GenBank登录号：XM_026432071.1）作为内参（表1）。分别以FoccUAP基因在腹部和1龄幼虫的表达量作为组织表达和时间表达的标准参量。每组样品重复3次。试验采用 2−ΔΔCt的方法计算FoccUAP基因的相对表达量。荧光定量PCR采用20 μL体系：SYBR预混液(TakaRa)10 μL，上下游引物(10 μmol·L−1)各0.4 μL，cDNA模板1 μL，灭菌超纯水8.2 μL。PCR采用两步法进行：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，62℃退火15 s，40次循环。
1.5 FoccUAP的dsRNA合成
根据已获得的基因序列设计靶向FoccUAP的dsRNA干扰片段（dsUAP），同时根据绿色荧光蛋白序列设计用于对照的dsGFP片段（表1）。以PEASY-FoccUAP质粒为模板，扩增特异性片段并回收，用HiScribe T7 Quick High Yield RNA Synthesis Kit（New England Biolabs）试剂盒合成dsRNA。体外转录体系为: ATP、GTP、UTP和CTP各2 μL，T7 RNA Polymerase Mix2 μL，模板(DNA) 1 μg，10 × Reaction buffer 2 μL，加 RNase free water补至 20 μL，37℃反应12 h。最后在反应体系加 1 μL DNase I(TakaRa)，37℃ 30 min 除去DNA模板。合成的dsRNA 梯度稀释后使用琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop 2000(Thermo)进行质量及浓度检测，并保存于－80℃备用。
1.6 RNAi注射试验及表型观察
利用油压式手动微量注射仪（Cell Tramoil, Eppendorf）将质量浓度为0.5 µg·µL−1的dsFoccUAP和dsGFP分别注射到200只蜕皮24 h的2龄西花蓟马若虫体腔。注射后72 h和120 h分别取出20只活虫检测dsRNA的沉默效果。另外，在注射后12 h，取30只活虫，单头饲养于放置四季豆的饲养管中，每12 h 观察存活情况和形态变化，共观察144 h，统计个体死亡率和成虫畸形率。试验重复3次。
1.7 数据分析
不同处理组之间的多重比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA, Tukey HSD test）（SPSS 21.0），差异显著性检验水平标准P＜0.05。
2. 结果与分析
2.1 FoccUAP的克隆与序列进化分析
以西花蓟马总RNA合成的cDNA为模板，克隆得到与预期大小相符的目标片段，经测序获得了西花蓟马FoccUAP的开放阅读框（open reading frame, ORF），全长1 545 bp，编码514个氨基酸（图1）。经软件SignalP 5.0预测，FoccUAP含有信号肽，区域为第1−10个氨基酸: MEHQYENLRN（图1）。利用NCBI的Conserved domains功能对蛋白质结构域预测，发现FoccUAP具有1个保守的结构域：Glyco-tranf-GTA-type superfamily结构域（第89−411位氨基酸）（图1）。
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图 1 FoccUAP基因的核苷酸及预测的氨基酸序列注：下划线部分为信号肽氨基酸序列；双下划线为蛋白保守结构域氨基酸序列；*为终止密码子。Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence of FoccUAPNote: The signal peptide sequence (MEHQYENLRN) is marked with underline. The conserved amino acid sequences of Glyco-tranf-GTA-type superfamily are marked with double underline. The TAA stop codon is marked with *.将FoccUAP氨基酸序列与其他28种昆虫UAP利用MEGA5.1邻接法，以步长值1 000构建系统进化树（图2）。图中进化树可分为两大支，其中FoccUAP与等翅目、蜚蠊目、直翅目和半翅目昆虫的UAP亲缘关系最近，序列最高同源性为56%（图2）。
2.2 FoccUAP的时空表达
利用RT-qPCR分析FoccUAP基因在西花蓟马不同发育阶段的mRNA相对表达量。结果表明FoccUAP基因在虫体生长发育的各个阶段均有表达，其中2龄幼虫、蛹以及羽化后24、48、168 和240 h的表达量分别是1龄幼虫的1.30、2.5、1.56、2.0、2.43、2.56倍（图3-A）。此外，对提取羽化后24 h的西花蓟马不同组织的总RNA进行RT-qPCR分析FoccUAP基因的表达情况。结果表明，FoccUAP基因在西花蓟马各个组织都有表达，在头部和腹部相对表达量最高，触角、胸部和足表达量较低（图3-B）。
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图 3 FoccUAP基因在西花蓟马不同发育时期（A）和不同组织（B）的mRNA表达分析注：数据上不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）Figure 3. Relative expression levels of FoccUAP mRNA in different developmental stages (A) and tissues (B) of F. occidentalisNote: Different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).2.3 dsRNA干扰对西花蓟马存活率和发育的影响
由图4-A可知，显微注射0.5 μg·μL−1的dsUAP可显著抑制FoccUAP基因的表达，观察发现，注射dsGFP的西花蓟马羽化率为86.8%，而注射dsUAP的西花蓟马羽化率仅为36.3%，且在注射后120 h的总存活率仅为5.0%（图4-B）；此外，注射dsUAP的西花蓟马成虫出现翅膀发育不完整、胸腹部皱缩等畸形现象（图4-C～D）。说明UAP基因与西花蓟马的表皮发育和蜕皮有一定的关系。
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图 4 注射dsUAP对西花蓟马死亡率及生长发育的影响注：*或者不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）Figure 4. Effects of dsUAP on growth and mortality rate of F. occidentalisNote：* or different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).3. 讨论与结论
UDP-N-乙酰氨基葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase, UAP）是生物合成中的关键酶，主要功能为催化可逆反应N-乙酰氨基葡萄糖-1-磷酸(N-acetylglucosamine -1-phosphate，GlcNAc-1-P)+UTP形成UDP-N-乙酰氨基葡萄糖(UDP-N-acetylglucosamine，UDP-GlcNAc)+PPi[20-21]。UAP最早从金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureu中分离纯化得到，随后在小牛的大脑组织和念珠菌球虫Moniliophthoraperniciosa中纯化获得[22]。UAP在原核和真核生物的生理代谢活动中均扮演重要作用[21]。近年昆虫UAP的研究也取得了长足的进步，埃及伊蚊Aedes aegypti、黑腹果蝇Drosophila melanogaster和甜菜夜蛾Spodopteraexigua等三十多种昆虫的UAP基因得到克隆鉴定[11-13]。进一步研究发现，昆虫UAP基因与昆虫表皮、气管和围食膜中几丁质的合成密切相关，如黑腹果蝇D. melanogaster UAP基因缺陷导致虫体表皮的上皮组织畸形，气管表现亦不正常，并且几丁质含量大量减少[11]；赤拟谷盗Tribolium castaneum UAP基因对昆虫的生长发育及存活至关重要[12]；利用dsRNA干扰东亚飞蝗Locusta migratoria UAP基因，其中肠和表皮中的几丁质合成都受到阻碍，最终导致虫体蜕皮障碍而死亡[13]；在甜菜夜蛾S. exigua中将UAP基因沉默后，同样可引起甜菜夜蛾化蛹障碍死亡[14]。然而，缨翅目蓟马类昆虫是目前农作物生产上最为重要的害虫之一，还未见UAP研究报道。因此，开展蓟马类昆虫UAP基因功能研究具有重要理论意义和应用价值。
本研究首次克隆鉴定了蓟马类害虫UAP基因，发现西花蓟马UAP基因与其他昆虫同源性较低，序列最高同源性仅为56%，表明缨翅目昆虫在进化上具有较高的保守性。从组织表达模式看，头部FoccUAP mRNA相对表达量最高，表明头壳发育过程中需要大量的几丁质，这与头部比其他组织更加坚硬相一致。此外，从时间表达模式看，蛹期和羽化168 h和240 h成虫的FoccUAP mRNA相对表达量最高，这可能是由于蛹阶段虫体需要形成翅以及更为坚固蛹壳，因此需要大量几丁质供给；而成虫阶段FoccUAP mRNA的高表达，该结果与UAP在甜菜夜蛾相似[14]，说明UAP除了与昆虫表皮、气管和围食膜中几丁质合成相关，可能还有其他未明确的功能。
本研究发现，通过向蜕皮后24 h 的2龄若虫显微注射质量浓度为0.5 μg·μL−1的dsUAP抑制FoccUAP基因的表达，西花蓟马死亡率显著增加；同时，注射dsUAP的西花蓟马化蛹率显著降低且成虫胸腹部、翅膀出现畸形。这表明，UAP基因表达水平下降可能导致几丁质的前体物质UDP-GlcNAc合成不足，从而使几丁质合成受阻而引发虫体畸形甚至死亡，其详细的死亡机理还需要进一步研究。
综上所述，本研究首次对西花蓟马UAP基因进行克隆、鉴定，利用实时荧光定量PCR法研究该基因在西花蓟马生长发育过程中的表达模式，并利用RNAi技术观察该基因对西花蓟马生长发育的影响，为进一步探讨西花蓟马UAP基因的生理功能提供科学参考。
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图 1 FoccUAP基因的核苷酸及预测的氨基酸序列
注：下划线部分为信号肽氨基酸序列；双下划线为蛋白保守结构域氨基酸序列；*为终止密码子。
Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence of FoccUAP
Note: The signal peptide sequence (MEHQYENLRN) is marked with underline. The conserved amino acid sequences of Glyco-tranf-GTA-type superfamily are marked with double underline. The TAA stop codon is marked with *.
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图 3 FoccUAP基因在西花蓟马不同发育时期（A）和不同组织（B）的mRNA表达分析
注：数据上不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）
Figure 3. Relative expression levels of FoccUAP mRNA in different developmental stages (A) and tissues (B) of F. occidentalis
Note: Different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).
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图 4 注射dsUAP对西花蓟马死亡率及生长发育的影响
注：*或者不同的字母表示差异显著（Tukey HSD test, P＜0.05）
Figure 4. Effects of dsUAP on growth and mortality rate of F. occidentalis
Note：* or different lowercase letters means significant difference (Tukey HSD test, P＜0.05).
表 1 引物信息
Table 1 Primers used
引物名称
Primer name序列
SequenceFoccUAP-ORF-F ATGGAGCACCAGTACGAAAACCTC FoccUAP-ORF-R TTAGTGAACACCATTTGATATCCCA dsFoccUAP-F TAATACGACTCACTATAGGGTACAAATGCTACCTGCACTGAAAGTAAGCT dsFoccUAP-R TAATACGACTCACTATAGGGTGGCAACATCATCCTGGATTCTCC qFoccUAP-F TCCGTTTACTGATAGTCTTGTTGTCTGGG qFoccUAP-R GCTGTGCGTGGGCAATCCTTTT qβ-actin-F CACCACCGCTGAGCGTGAAATCG qβ-actin-R GTGATGACCTGACCGTCGGGAAGC dsGFP-F TAATACGACTCACTATAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGG dsGFP-R TAATACGACTCACTATAGGGTCCTCGATGTTGTGGCGG 
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