Full-length cDNA Library and EST Analysis on Pesudocohnilembus persalinus
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摘要: 水滴伪康纤虫为海水养殖鱼类的重要危害性寄生虫。采用SMART技术构建营养期水滴伪康纤虫全长cDNA文库，初始文库滴度3.3×106pfu·mL-1，文库容量约为1.5×107 pfu，重组率97%。随机挑取24个克隆，经PCR检测插入的片段长度在0.3~2.0 kb，平均长度>500 bp。挑选文库中的1 200个克隆进行表达序列标签测序，得到1 032条高质量的EST，与NCBI数据库进行比对后，获得292个同源基因，其中包含190条单拷贝EST和102个重叠群，冗余度为71.7%。有215条EST在Tetrahymena thermophila，Paramecium tetraurelia，Ichthyophthirius multifiliis，Cryptocaryon irritans，Oxytricha trifallax等自由生活及寄生种类的纤毛虫的基因组中比对到同源基因，其中有134条EST具有功能注释，其余为未知功能的假定蛋白基因。水滴伪康纤虫cDNA文库的构建及EST测序的完成，为进一步发现和研究水滴伪康纤虫的功能基因奠定了基础。Abstract: Pesudocohnilembus persalinus is a harmful parasite found in marine fish. Using SMART technology, a full-length cDNA library of P. persalinus was constructed. Titer of the primary library was 3.3×106 cfu·mL-1, and the library capacity was 1.5×107 cfu with a recombination rate of 97%. A PCR amplification on 24 random clones revealed that the inserted cDNA fragments ranged from 300-2 000 bp, with an average length over 500 bp. Subsequently, 1 200 clones were selected from the library for EST sequencing. As a result, 1 032 high-quality ESTs were obtained and assembled into 292 unigenes including 102 contigs and 190 unique ESTs with a redundancy rate of 71.7%. In a blast analysis against NCBI database, 215 of the unigenes were homologous to the corresponding genes of ciliates with free-living and parasitic lifestyle, such as Tetrahymena thermophila, Paramecium tetraurelia, Ichthyophthirius multifiliis, Cryptocaryon irritans, Oxytricha trifallax, etc. But, only 134 ESTs had been annotated. The remainders were hypothetical protein genes. The results obtained from this study would substantially facilitate the molecular cloning and characterization of the functional genes in P. persalinus.
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Keywords:
- Pesudocohnilembus persalinus /
- cDNA library /
- EST sequencing
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盾纤虫病是目前海水养殖中危害最为严重的寄生虫病之一[1-2]。水滴伪康纤虫Pseudocohnilembus persalinus[3-5]是重要的一种盾纤类病原。目前对水滴伪康纤虫的研究在形态分类[6-8]、系统发育[9]和生态学[10-12]方面做了一些基础性的研究工作，但在盾纤虫的运动、生理代谢、信号传导过程中重要的分子及调控机理的研究却未见有报道。而与其他相对高等的脊椎动物(如鱼类)相比，纤毛虫显然存在着大量不同的代谢方式，而这些不同的方式中酶可以成为药物靶点或是免疫保护性抗原的候选蛋白。
构建cDNA文库作为从分子水平提供虫源抗原基因的手段，已在获取保护性和诊断性抗原研究方面发挥了重要作用，从而为原虫病的诊断与预防、虫种的鉴定与分类研究奠定了基础。
本研究拟构建水滴伪康纤虫营养期细胞的全长cDNA文库，以期为探明水滴伪康纤虫基因表达机理及诊断抗原、药物靶点和疫苗候选基因的筛选奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 水滴伪康纤虫
由中国海洋大学原生动物教研室惠赠，本课题组培养保存。
1.1.2 主要试剂
RNAiso Plus (TaKaRa)，SMART cDNA Library Construction Kit (Clontech)，Advantage 2 Polymerase Mix(Clontech)，QIAquick PCR Purification Kit(Qiagen)，Sfi I(NEB)。
1.2 试验方法
1.2.1 水滴伪康纤虫的培养与收集
(1) 水滴伪康纤虫的培养：沙滤海水经滤纸过滤，煮沸冷却后备用。接种水滴伪康纤虫于15 mL海水中，滴加过夜培养的E.coli DH5α菌液1 mL。18℃培养3 d后，密度大于4×104ind·mL-1后进行虫体的收集。
(2) 虫体的收集：虫体培养液经定性滤纸过滤去除大颗粒沉淀物，上述滤液用孔径为8 μm的微孔滤膜过滤，以去除培养液中的细菌，虫体用50 mL无菌海水重悬后，用孔径8μm微孔滤膜再次过滤，重复清洗3次，最后将虫体重悬于5 mL无菌海水中，4 000 r·min-1离心收集虫体用于总RNA的提取。
1.2.2 总RNA提取
采用RNAiso Plus试剂盒(TaKaRa)提取营养期水滴伪康纤虫总RNA，使用Nanodrop2000核酸定量仪(Thermo)测定总RNA的质量浓度及A260/A280值。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA质量。选择电泳条带清晰，Agilent 2100法检测RIN≥7且28S/18S≥0.7的总RNA样品用于下一步建库。
1.2.3 cDNA合成
(1) cDNA第一链合成：以SMART cDNA Library Construction Kit(Clontech)试剂盒合成cDNA第一链。取1 μg RNA样品，在0.2 mL PCR管中分别加入SMART IV Oligonucleotide，CDS Ⅲ/3′PCR Primer各1 μL，加ddH2O至总反应体系为5 μL，72℃温浴2 min。冰浴2 min，离心，加入下列试剂：5×First-Strand Buffer 2 μL，DTT (20 mmol·L-1) 1 μL，dNTP Mix (10 mmol·L-1) 1 μL，PowerScript Reverse Transcriptase 1 μL，42℃温浴1 h，合成单链cDNA，冰浴终止反应。
(2) 双链cDNA合成：以第一链cDNA为模板，采用长距PCR(long-Distance PCR)扩增以获得双链cDNA。反应体系：cDNA第一链产物2.0 μL，ddH2O 80 μL，10×Advantage 2 PCR Buffer 10 μL，CDS Ⅲ/3′PCR Primer、50×dNTP Mix、5′PCR Primer、50×Advantage 2 Polymerase Mix各2 μL。PCR程序为：95℃预变性1 min，95℃变性15 s，66℃退火20 s，72℃延伸4 min，18个循环。反应产物用蛋白酶K消化，酚:氯仿:异戊醇以去除体系中的蛋白。琼脂糖凝胶电泳检测合成的双链cDNA。
1.2.4 双链cDNA的酶切及cDNA文库的构建
双链cDNA用sfiI限制性内切酶修饰，形成两端分别带有sfiIA与sfiIB的黏性末端，酶切产物经纯化，与pUC19克隆载体(上海生工)连接，以E.coli DH5α为受体菌，α互补蓝白斑选择构建cDNA文库。
1.2.5 cDNA文库质量鉴定
将菌液涂布于LB(Ampr)平板上计算菌落数量。文库滴度(cfu·mL-1)＝培养皿中单菌落数×稀释率1000/涂布菌体体积(μL)，文库重组率/%＝白斑数/菌落总数×100%，原始库容量(cfu)＝文库滴度(cfu·mL-1)×文库体积(mL)。随机挑取24个菌落通过PCR鉴定插入片段大小。
1.2.6 EST测序及分析
随机挑取1 200个阳性克隆送上海生工测序。得到的EST序列与NCBI的非冗余蛋白质序列数据库(nr)进行BLASTx比对，与NCBI的非冗余核酸序列数据库(nt)进行BLASTn比对，E值均设为1e-5。
2. 结果与分析
2.1 水滴伪康纤虫总RNA质量及双链cDNA的合成
1%琼脂糖凝胶电泳结果显示，28 s与18 s条带清晰，亮度比大约为2:1，且无其他杂带，经NanoDrop 2000和Agilent 2100检测的水滴伪康纤虫总RNA样品的A260/A280和A260/A230值分别是2.07和1.54，总RNA质量浓度为580 ng·μL-1，28s/18s=1.8，RIN=8.9，质量检测结果表明，用于构建cDNA文库的总RNA样品符合建库要求。合成的双链cDNA电泳结果显示条带呈弥散性分布，大小250~3 000 bp(图 1)。
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图 1 水滴伪康纤虫总RNA(A)及双链cDNA(B)的凝胶电泳注：M为DL2000 DNA marker; a为total RNA; b为ds cDNA。Figure 1. Agarose gel electrophoresis of total RNA (A) and double strand cDNA (B) from P. persalinus2.2 水滴伪康纤虫cDNA文库的构建及质量鉴定
以SMART法构建水滴伪康纤虫cDNA文库。对培养板上的菌落进行计数，统计蓝、白斑数，计算初始文库滴度为3.3×106cfu·mL-1，文库容量约为1.5×107 cfu，重组率为97%(1091/1125)。随机挑取24个菌落，经PCR检测插入的片段长度在0.3~2.0 kb(图 2)，平均长度>500 bp。
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图 2 24个随机克隆中插入片段扩增产物的凝胶电泳注：M为DL2000 DNA marker; 1~24为positive clones。Figure 2. Agarose gel electrophoresis of inserted fragments in 24 random clones2.3 EST测序及序列分析
挑选文库中的1 200个克隆进行EST测序(图 3、表 1)，去除载体序列和短片段( < 100 bp)，拼接后得到1 032条EST，EST的长度主要集中在400~900 bp，占EST总数的62%，平均长度为560 bp。其中包含190条单拷贝和102条重叠群，冗余度为71.7%。其中丰度最高的重叠群对应117条EST。与NCBI数据库(nr，nt)进行比对后，以E≥1e-5为标准，292个水滴伪康纤虫EST在数据库中匹配到同源基因，其中有215条EST与Ichthyophthirius multifiliis，Cryptocaryon irritans，Neospora caninum，Tetrahymena thermophila，Tetrahymena pyriformis，Paramecium tetraurelia, Uronema marinum，Oxytricha trifallax 等寄生及自由生活种类纤毛虫的基因同源。在比对到的水滴伪康纤虫EST同源基因中有134条为已注释的功能基因，158条为未得到功能注释的假定蛋白基因。在获得生物学功能注释的基因进行GO分类，涉及3大类(BP，CC，MF)。在生物学过程部分，细胞过程类别(cellular process)占比最高，代谢过程(metabolic process)和单组织过程(single-organism process)次之。在细胞成分部分，细胞类别(cell)和细胞部分类别(cell part)得到最多的归类注释。在分子功能部分，与绑定分子功能类别(binding)和催化活性类别(catalytic activity)占比最高，在运输活性类别(transporter activity)也有着较大的占比。
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图 3 EST的长度分布(A)及单一序列的冗余度(B)Figure 3. Distribution of lengths(A) and redundancy(B) of singlets of ESTs表 1 部分EST序列的功能注释及与GenBank中同源比对Table 1. Function annotation and homology of partial EST sequences compared with data from GenBank编号 长度 功能注释 同源性/% E值 Pp-10-B02 1131 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 94 7.00E-152 Pp-109-D12 731 NADH脱氢酶亚基7 81 7.00E-174 Pp-A3-C01 1220 3-磷酸甘油醛脱氢酶 74 1.00E-168 Pp-A82-B11 1220 多聚泛素5 93 3.00E-136 Pp-E5-E01 1068 组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶 51 2.00E-87 Pp-B58-B08 1073 组织蛋白酶B 92 0 Pp-G91-C12 669 2型甲硫氨酸胺基肽酶 65 4.00E-77 Pp-I36-D05 1204 粪卟啉原Ⅲ氧化酶 56 2.00E-111 Pp61-E08 662 磷酸吡哆醛依赖转移酶 78 9.00E-61 Pp0382 1114 肌醇磷酸合成酶 67 9.00E-125 Pp-K73-A10 781 丙氨酰-tRNA合成酶 72 1.00E-119 Pp-A1-A01 1147 热休克蛋白90 69 1.00E-106 Pp-B10-B02 436 延长因子2 71 1.00E-31 Pp-D20-D03 472 核苷结合外膜蛋白 76 5.00E-49 Pp-D34-B05 1225 醌氧化还原酶 77 0 Pp-D4-D01 976 ATP合成酶γ亚基 51 5.00E-81 Pp-D53-E07 455 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶 69 1.00E-32 Pp-E56-H07 811 电压门控性钾通道β2亚基 77 5.00E-125 Pp-F5-E01 547 转录因子Dp-1 62 8.00E-23 3. 讨论与结论
盾纤类纤毛虫是一类机会性感染鱼类的兼性寄生虫。通常为自由生活或以自由生活为主，可兼性寄生于宿主体表或体内[13-14]。其寄生的部位主要为鱼类皮肤的溃疡病灶及鳃部，但有报道称在病鱼的体内器官、腹水甚至脑部也发现有大量的盾纤类寄生[2, 15-17]。盾纤类纤毛虫的兼性寄生及可感染鱼体内脏器的特点不同于其他的自由生活或是严格寄生的纤毛虫类，因此，对其基因背景的研究有助于了解其特殊的生活方式及对鱼类的侵染过程。2004年，Kim等[3]首次报道水滴伪康纤虫是牙鲆Paralichthys olivaceus盾纤虫病的病原，Xiong等[14]完成了水滴伪康纤虫的全基因组测序并对其进行了基因组范围的水平基因转移(horizontal gene transfer，HGT)分析，表明水滴伪康纤虫获得了源于原核生物的一些与其毒性有关遗传基因。而截至2017年3月15日，NCBI网站并未有关于水滴伪康纤虫EST序列的释出，功能基因克隆和注释的研究则未见有更多报道。
从本研究所构建的水滴伪康纤虫的cDNA文库的EST序列初步分析结果来看，有54.1%(158/292)的EST序列并未得到有效的注释。这与在NCBI数据库中已提交的盾纤类纤毛虫基因序列很少，且大多的基因序列并未得到有效的注释有关。在诸如四膜虫、草履虫等已进行全基因组测序的，有较多研究基础的纤毛虫中，许多基因的功能信息依然没有明确的注释。因此，如果能对水滴伪康纤虫中很大一部分未知功能的EST进行深入的研究，则有可能对这一类致病性盾纤类纤毛虫的侵染及毒性机理的有进一步的了解，为水产动物盾纤虫病的防治提供理论依据和新的防治手段，并可为纤毛类原生动物的基因功能研究提供更多的参考资料。
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图 1 水滴伪康纤虫总RNA(A)及双链cDNA(B)的凝胶电泳
注：M为DL2000 DNA marker; a为total RNA; b为ds cDNA。
Figure 1. Agarose gel electrophoresis of total RNA (A) and double strand cDNA (B) from P. persalinus
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图 2 24个随机克隆中插入片段扩增产物的凝胶电泳
注：M为DL2000 DNA marker; 1~24为positive clones。
Figure 2. Agarose gel electrophoresis of inserted fragments in 24 random clones
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图 3 EST的长度分布(A)及单一序列的冗余度(B)
Figure 3. Distribution of lengths(A) and redundancy(B) of singlets of ESTs
表 1 部分EST序列的功能注释及与GenBank中同源比对
Table 1 Function annotation and homology of partial EST sequences compared with data from GenBank
编号 长度 功能注释 同源性/% E值 Pp-10-B02 1131 磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 94 7.00E-152 Pp-109-D12 731 NADH脱氢酶亚基7 81 7.00E-174 Pp-A3-C01 1220 3-磷酸甘油醛脱氢酶 74 1.00E-168 Pp-A82-B11 1220 多聚泛素5 93 3.00E-136 Pp-E5-E01 1068 组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶 51 2.00E-87 Pp-B58-B08 1073 组织蛋白酶B 92 0 Pp-G91-C12 669 2型甲硫氨酸胺基肽酶 65 4.00E-77 Pp-I36-D05 1204 粪卟啉原Ⅲ氧化酶 56 2.00E-111 Pp61-E08 662 磷酸吡哆醛依赖转移酶 78 9.00E-61 Pp0382 1114 肌醇磷酸合成酶 67 9.00E-125 Pp-K73-A10 781 丙氨酰-tRNA合成酶 72 1.00E-119 Pp-A1-A01 1147 热休克蛋白90 69 1.00E-106 Pp-B10-B02 436 延长因子2 71 1.00E-31 Pp-D20-D03 472 核苷结合外膜蛋白 76 5.00E-49 Pp-D34-B05 1225 醌氧化还原酶 77 0 Pp-D4-D01 976 ATP合成酶γ亚基 51 5.00E-81 Pp-D53-E07 455 肽酰-脯氨酰-顺反式异构酶 69 1.00E-32 Pp-E56-H07 811 电压门控性钾通道β2亚基 77 5.00E-125 Pp-F5-E01 547 转录因子Dp-1 62 8.00E-23 
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